2.1   牙囊细胞的来源、鉴定及其生物学特性   牙囊组织在牙齿萌出过程中发挥着重要作用，既参与牙冠形态的形成，也参与牙根发育。因此，起源于牙囊的牙囊细胞被视为牙周组织的前体细胞[20]。牙囊细胞不仅可以直接来源于牙囊组织，还可能源自Hertwig上皮根鞘细胞，这些细胞经过上皮-间充质转化后也可转化为牙囊细胞。至今，两者的差异尚无法明确区分。 用于体外培养和后续研究的牙囊细胞可以从大鼠或人类的牙囊组织中提取，通常选择因各种原因被拔除的智齿附带组织进行传代培养。通过倒置显微镜及苏木精-伊红染色观察细胞形态与生长状态，并采用免疫组化染色技术检测牙囊细胞的特征，结果显示牙囊细胞呈长梭形、纺锤形及不规则三角形，且表达典型的干细胞标志物[21]。 2.1.1   增殖能力   牙囊细胞具有显著的增殖能力，受到培养时间和传代次数的影响。SHOI等[22]对健康儿童的相同嵌生上颌切牙中的牙髓干细胞与牙囊细胞进行比较，发现牙囊细胞的细胞增殖率和集落形成能力显著高于牙髓干细胞。王贺等[23]使用二次酶消化法对小鼠牙囊细胞进行原代培养，观察到第3代细胞的生长速度最快且状态最佳，适合用于各种后续实验。 2.1.2   多向分化能力   牙囊细胞不仅具备显著的增殖特性，还展现出良好的骨向分化能力，能够向牙周膜、牙骨质和牙槽骨分化[24-27]。相较于牙周膜干细胞[28]，牙囊细胞具有更好的分化潜能，并且在多能性和免疫因子表达上优于人牙髓干细胞和人胚胎干细胞[29]。在体外培养条件下，牙囊细胞还可以向脂肪细胞及神经细胞分化[30]。在人肝细胞生长因子的存在下，牙囊细胞能向肝细胞分 化[31]，并保持一定的干细胞生物学特性。此外，牙囊细胞在组蛋白脱乙酰酶抑制剂的作用下可分化为心肌细胞，分化后的心肌细胞具有较高的归巢率，显示出牙囊细胞在心肌细胞分化和再生中的潜力[32]。YANG等[33]评估了5种牙源性干细胞在不同的神经细胞分化诱导模式及时间点，结果表明牙囊细胞相比其他细胞具有更高的增殖能力，并在表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子培养条件下展现出最佳的神经分化潜能，可能成为更优的候选细胞类型。 2.1.3   牙囊细胞的分泌功能   牙囊细胞能够分泌多种细胞因子和基质成分，如生长因子和细胞外基质，参与组织再生与修复。间充质干细胞的活性成分有相当一部分取决于它们的分泌组，分泌组指的是在条件培养基或细胞外囊泡中释放的所有生物活性分子(神经营养因子)[34-35]。外泌体就属于分泌组的一种，其内包括了多种细胞因子和生长因子等，这些物质对组织修复有一定的促进作用，其原理涉及一种由蛋白质介导的“肇事逃逸机制”[36]，即免疫细胞或者是缺损组织的细胞通过分泌、摄取细胞外囊泡和免疫介导的吞噬作用，将分泌组内的旁分泌物质转导至细胞内[37-38]，并产生一定的生物学效应，见图3。牙囊细胞外泌体对牙囊细胞自身[39]、牙源性以及非牙源性细胞和组织均具有一定的调控作用，可促进牙周组织及其他组织的再生修复[40]。"

有学者将牙囊细胞外泌体提取分离后与大鼠骨髓间充质干细胞共培养，发现外泌体能够被骨髓间充质干细胞摄取并且可以促进骨髓间充质干细胞的增殖活性以及迁移分化[42]。另有学者将牙囊细胞外泌体与牙周膜干细胞共培养，发现牙周膜干细胞对牙囊细胞外泌体也有摄取情况，并且能够增强牙周膜干细胞的增殖迁移能力[43-44]。 田俊等[45-46]则通过研究发现，牙囊细胞外泌体除了可抑制巨噬细胞炎症反应，还能被牙髓组织摄取，并可能通过抑制牙髓炎症反应促进炎症牙髓组织的修复。 尽管在临床实践转化方面仍存在许多障碍，且尚未有较完善的研究来对牙囊细胞外泌体的临床治疗效果进行评估[47]，但不可否认，牙囊细胞衍生的外泌体正在成为一种有前途且实用的组织修复和再生治疗方法。 牙囊细胞以上的良好生物学特性均向研究者们展示了其运用在牙周组织再生当中的潜力，是十分具有潜力的牙周组织再生工程种子细胞。 2.2   生物因素对牙囊细胞生物学特性的影响   牙囊细胞的增殖以及成骨分化受多种生物因素影响，见图4。内源性信号以及各微环境是影响干细胞性能的决定性因素[48]，为方便区分，文章将生物因素分类为内源性因素和外源性因素，前者主要包括各常见信号通路以及细胞自身的生物代谢途径，后者主要是指为进一步研究牙囊细胞相关生物学特性而人工构建的微环境等。不同的生物因素可以单独作用于牙囊细胞产生生物学效应的变化，也可以由不同生物因素结合起来共同作用于牙囊细胞，从而造成不同的生物学效应，相关研究集中于对牙囊细胞增殖与成骨分化的影响。"

2.2.1   内源性因素   Dlx3/骨形态发生蛋白2反馈调节机制在调控牙囊细胞的成骨分化上尤为重要[49]，牙囊细胞的成骨分化在一定程度上取决于Dlx3和骨形态发生蛋白的浓度比例，转录因子Dlx3具有能诱导牙囊细胞成骨向分化的作用，具体机制涉及Dlx3对骨形态发生蛋白信号通路的调节：骨形态发生蛋白2促进蛋白激酶A和SMAD的激活，上述生物因子促进Dlx3的合成，Dlx3则对骨形态发生蛋白2和Runt相关转录因子的合成具有诱导作用，值得一提的是，除了通过骨形态发生蛋白2依赖性途径刺激成骨分化，Dlx3也可直接刺激牙囊细胞的成骨分化。除此之外，蛋白激酶A/β-连环蛋白通路对Dlx3/骨形态发生蛋白反馈调节机制有维持作用，蛋白激酶A通过磷酸化β-连环蛋白来增加其活性，而β-连环蛋白则是调控牙囊细胞成骨分化的重要因子，调控Dlx3合成的同时也诱导成骨标志物Runt相关转录因子2[50]。在经典Wnt/β-连环蛋白信号通路中，经典与非经典Wnt信号之间同样存在一定的反馈机制[51]，经典信号Wnt3a可以促进牙囊细胞的碱性磷酸酶活性，非经典信号Wnt5a选择性地抑制Wnt3a介导的碱性磷酸酶活性的增加，而Wnt3a亦可以通过增加Wnt5a的表达对碱性磷酸酶表达进行负反馈调节。蛋白激酶C和蛋白激酶B的经典亚型可通过β-连环蛋白和核转录因子κB信号通路对牙囊细胞的成骨分化进行调控，牙囊细胞中的蛋白激酶B活性受经典蛋白激酶C的调节，核转录因子κB通路在牙囊细胞中则受蛋白激酶C/蛋白激酶B轴调节[52]。另有研究表明，骨形态发生蛋白2诱导牙囊细胞内的Runt相关转录因子2等表达可通过p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路、SMAD信号通路等多种信号通路转导机制完成[53]。各信号通路对牙囊细胞的影响及互作见表2。"

自噬过程是AMP活化蛋白激酶信号通路的一个重要生物靶点，在牙齿发育过程中具有重要作用[54]，研究表明牙囊细胞同其他干细胞一样同样会发生自噬。由于AMP活化蛋白激酶和自噬在牙囊细胞中的作用尚不明确，故有研究使用AMP活化蛋白激酶激活剂AICAR以及AMP活化蛋白激酶抑制剂dosromorphin分别对牙囊细胞进行处理，发现3 d时激活组的碱性磷酸酶活性与相关成骨标志物表达均降低，而抑制组的部分成骨标志物则上升，表明AMP活化蛋白激酶调控牙囊细胞的早期成骨分化[55]；进一步研究采用自噬激活剂PI103或自噬抑制剂wortmannin分别处理牙囊细胞，发现牙囊细胞的自噬作用会抑制其分化与矿化，随后采用特异性小干扰RNA敲除AMP活化蛋白激酶α基因，发现自噬相关蛋白表达降低，而相关成骨分化标志物下降，表明AMP活化蛋白激酶还可通过自噬间接影响生物矿化。 2.2.2   外源性因素   由于体外培养与体内培养的条件不同，学者们一直力求通过营造各种微环境和运用各种手段来干预牙囊细胞的生物学特性变化。牙囊细胞在炎症微环境中仍保留较好的牙周组织再生效能[56]，且经过脂多糖预处理后的牙囊细胞小细胞外囊泡对牙周炎治疗的疗效增强[57]。研究发现，在大肠杆菌脂多糖模拟的炎症微环境下，牙囊细胞的成骨能力受到了抑制，但低浓度的大肠杆菌脂多糖却对牙囊细胞的增殖迁移有一定的促进作用[58]，其机制可能为大肠杆菌脂多糖可以显著上调白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α表达，通过Toll样受体4介导的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路和核转录因子κB通路促进牙囊细胞的增殖，并且可以降低成骨相关基因mRNA相对表达量，从而达到抑制牙囊细胞成骨分化的作用。WEI等[59]研究发现，在炎症微环境中，骨膜蛋白的剔除会导致牙囊细胞的增殖和成骨分化能力减弱；进一步研究表明，骨膜蛋白通过整合素αM/p-ERK/ERK信号通路调节巨噬细胞来介导牙囊细胞促进牙周再生的过程[60]。此外，在体外培养的持续低氧条件下，低氧可能通过触发Nanog，八聚体结合转录因子4(Octamer-bindingtranscriptionfactor-4，Oct-4)和SRY盒-2（SRY related HMG box-2，Sox-2）基因等干细胞标志物表达来保持牙囊细胞的干细胞特性，但具体信号通路仍不明确[61]；钙离子浓度也会影响牙囊细胞生物学特性，低钙离子浓度会影响人牙囊细胞增殖与迁移，而高钙离子浓度则通过上调成骨分化相关基因RUNX2和骨桥蛋白的表达来调节牙囊细胞的成骨分化[62-63]。 另有研究发现，短期刺激牙囊细胞可显著增加其白细胞介素6，8的释放[64]，这表明牙囊细胞具有一定的免疫特性。介于这些免疫特性，外源性生长因子难以发挥其效用，但通过基因转染生长因子基因片段导入靶细胞内，有利于获得生长因子持续高效发挥作用，对此，冉玲等[65]开展研究，最终发现超声强度为0.5 W/cm2且辐照时间为30 s时转染率明显高于其他超声参数组合以及传统脂质体介导的转染率，且对细胞活力无明显影响，从而为牙周组织工程提供一种较理想的基因转染方法。 长期的天然或者是人为因素(如医疗检查)所导致的低剂量红外线可能会导致DNA的病变，而DNA损伤反应是真核生物进化而来用以保护DNA免受辐射诱导的DNA双链断裂导致的损伤。BELMANS等[66]发现牙囊细胞暴露于低剂量的X射线下，会诱导DNA双链断裂的发生，并且DNA双链断裂的数量随着辐射剂量的增加而线性增加；为深入研究其具体机制，有研究用NU7441来抑制DNA蛋白激酶，DNA蛋白激酶是DNA损伤反应的重要因子，结果发现与对照组相比，β-半乳糖苷酶活性和阳性细胞数量均减少，即细胞衰老减少[67]；蛋白激酶B是DNA蛋白激酶的靶蛋白，在加入蛋白激酶B的情况下，发现β-半乳糖苷酶活性和阳性细胞数量有一定程度的回弹，这些结果表明，DNA损伤反应的抑制与细胞衰老的诱导有关，而DNA蛋白激酶则通过诱导蛋白激酶B的上调来实现细胞衰老。 此外，生物提取物/药物也对牙囊细胞的生物学特性产生一定的影响。如淫羊藿苷具有调控人牙囊干细胞旁分泌的作用，从而释放更多调节成骨分化的细胞因子[68]；有研究对常见的转录因子p53在牙囊细胞中的作用进行研究，比较了可诱导p53基因表达的E2F-1基因，观察两者在牙囊细胞增殖发育和成骨分化中的作用，结果发现E2F-1对成骨分化的无诱导作用[69]；而p53抑制衰老牙囊细胞的成骨分化和细胞增殖，但对衰老诱导没有明显作用，而姜黄素能通过下调p16、p21和上调E2F1、p53以及恢复成骨标志物Runt相关转录因子2和骨桥蛋白来抑制由于细胞传代所导致的牙囊细胞衰老[70]。另有研究表明，牙囊细胞可通过与其他细胞相互作用以提高自身能力，如牙乳头干细胞和牙囊细胞可通过体外交互作用调节体外培养微环境，通过能提高内源性Oct-4、Sox2和C-myc而保持牙囊细胞的干细胞特性[71]。以上研究或许能为牙囊细胞在牙周再生治疗的应用提供理论基础以及新的思路。 2.3   支架材料在牙囊细胞研究中的应用    2.3.1   支架材料在牙科干细胞中运用的现状   支架材料是牙周组织再生的一个必不可少的部分。为了使种子细胞增殖和分化，需要提供一个由生物材料所构成的细胞支架，支架材料相当于人工细胞外基质，支架材料与种子细胞结合，培养成熟后植入生物体内，继而发生再生过程，支架降解，新的组织形成并填补缺损[72]；生物打印的出现有别于其他传统支架的制作方法，它使研究者们可以针对不同的缺损定制出能改进或治疗该缺损的生物支架材料[73-75]，见图5。研究发现种子细胞和支架之间存在相互作用，支架会影响到细胞的功能，而细胞在再生过程中也会导致支架的形态变化，其机制涉及细胞和支架的反馈回路，即细胞的活动如机械传导、功能调节以及增殖分化迁移等，可以影响支架的重组和收缩力，而支架的重组和收缩力又会反馈地影响上述提及的细胞活动，故或许可以以此为依据设计适合牙囊细胞的支架材料。"

支架材料按其性质主要分为天然/合成可降解高分子材料、天然/合成可降解无机材料；还有其他各种人工合成(复合)材料。合成(复合)材料通常指的是2种或2种以上常见的天然/合成可降解高分子材料或者天然/合成可降解无机材料，通过化学交联、物理吸附、冷冻干燥、3D打印和特异性结合等复合技术，形成具有某种联合作用，该联合作用对牙囊细胞的增殖发育以及成骨分化效应往往要比一种支架单独作用要更为明显。 用于牙周组织工程再生的支架材料要求具有良好的生物相容性[76]。有体外研究表明，细胞与支架之间的微机械相容性与牙囊细胞的机械敏感基因表达标志物和成骨分化标志物显著相关[77]，这为寻找更适合牙囊细胞生长增殖分化的支架材料提供了一定的理论基础。事实上，此类研究仍需进一步发展。 2.3.2   天然/合成可降解高分子(复合)材料   胶原材料因具有优异的生物相容性而被用作组织工程再生的支架材料：FU等[78]的研究评估了可注射基质胶作为支架的潜在用途，该研究采用三维支架材料基质胶，以骨形态发生蛋白9和大鼠牙囊细胞为实验对象，采用皮下植入的方法，6周后进行染色、分析与评估，结果发现骨形态发生蛋白9有效促进了大鼠牙囊细胞的成骨分化，而基质胶则促进了骨形态发生蛋白9诱导的大鼠牙囊干细胞在体内的成骨。 纤维蛋白胶同样因独特的生理学性质而具有良好的生物相容性，其在组织工程内作为支架材料已较为广泛。刘红等[79]评估了纤维蛋白胶作为细胞移植载体的可行性及有效性，该研究以纤维蛋白胶与人牙囊细胞为实验对象，分析了纤维蛋白胶与人牙囊细胞二维及三维结合模式对细胞存活、增殖及凋亡的影响，结果发现纤维蛋白胶的3D-1复合模式下，牙囊细胞具有较高的增殖趋势。 由亲水均聚物、共聚物或大聚体形成的水凝胶，因具有与组织相似特征的三维聚合物网络而在牙科生物材料领域受到了广泛的关注[80]。在3层纳米复合水凝胶支架中[81]，支架的每一层均由不同的物质构成，并且都设计用于再生牙周组织的特定部分[82]：骨质层由几丁质-聚(乳酸-乙醇酸)水凝胶支架与纳米生物活性玻璃陶瓷和骨质蛋白1制成；面向骨表面的肺泡骨层由几丁质-聚(乳酸-乙醇酸)水凝胶支架制成，其中含有纳米生物活性玻璃陶瓷和富血小板血浆；试图再生牙周韧带纤维的中间层由相同的几丁质-聚(乳酸-乙醇酸)水凝胶支架制成，其中含有成纤维细胞生长因子。将3层组装在一起形成生物相容性复合支架，诱导人牙囊细胞分化为成骨细胞、成牙骨质细胞和成纤维细胞，将该支架注入兔牙周缺损模型，发现具有促进缺损的骨水泥、牙周膜以及牙槽骨再生的效能[83]。此外，还有关于牙囊细胞诱导的神经分化，研究发现添加了一定量的鼠尾草水提取物以及氯白链球菌提取物的纳米透明质酸支架对牙囊干细胞的神经分化有一定的诱导作用[84]。 因此，高分子材料向研究者们展示了其在牙周组织再生中的灵活性和可塑性，可以根据缺损部位的不同，从而制造具有针对性的支架材料，实现高效的组织再生。 2.3.3   天然/合成可降解无机(复合)材料   羟基磷灰石在骨组织工程中具有优异效果，作为最常用的磷酸钙骨移植材料，不仅可以用作临床支持牙槽骨，纳米羟基磷灰石还可以改善骨再生特性，与其他不同支架结合使用也可取得一定成效[85]。有研究表明，接种了人牙囊细胞 6周的羟基磷灰石支架，细胞的3D组织和细胞簇周围存在致密物质，即表明羟基磷灰石支架能有效促进人牙囊细胞的骨向分化[86]。 在体内，将播种在羟基磷灰石/β-磷酸三钙支架上的Dickkopf相关蛋白3与短发夹RNA复合牙囊细胞移植到重症联合免疫缺陷小鼠的皮下组织，然后进行苏木精-伊红和马森染色，与对照细胞相比，慢病毒介导的Dickkopf相关蛋白3和短发夹RNA在牙囊细胞中的表达促进了钙化结节的形成、碱性磷酸酶活性以及β-连环蛋白、Runt相关转录因子2和骨钙素的表达；在体内，植入部分呈现出大部分新形成的类骨基质和胶原蛋白，结果证实，在大鼠牙囊细胞矿物质诱导过程中，Dickkopf相关蛋白3的表达被下调，而下调Dickkopf相关蛋白3可促进人牙囊细胞的成骨[87]。 此外，NIE等[88]生产了一种新型支架，其中包含可生物降解的珊瑚羟基磷灰石，该支架接种了表达骨形态发生蛋白9转染鼠牙囊细胞的重组腺病毒(Ad-骨形态发生蛋白9转染的鼠牙囊细胞)，通过对照实验发现该支架植入物可促进牙槽骨缺损后的牙槽骨再生，而骨形态发生蛋白9对鼠牙囊细胞成骨分化的诱导作用涉及Smad1/5/8信号通路的激活。 无机材料良好的生物相容性使得其在牙周组织再生工程中得以广泛使用，通过调整纳米级无机材料的含量或许可改善支架的性能，从而制备生物相容性更好的支架。 2.3.4   其他各种人工合成(复合)材料   如今的牙周组织再生工程常采用多种支架材料复合的方法，以追求良好的生物相容性与机械性。骨桥蛋白作为一种细胞因子，可以促进成骨过程中的磷酸钙成核，甚至可以调节羟基磷灰石晶体的形态[89]。COSTA等[90]从患者牙囊组织中分离出组织碎片，用一定方法制成干细胞培养物并对此进行研究，结果证明带有骨桥蛋白纤维蛋白仿生水凝胶的3D复合支架胶原蛋白/纳米羟基磷灰石可促进体内外牙囊细胞的增殖，并促进其成骨基因的表达。 除了常见的复合材料，还出现了一类新型支架材料。如纳米纤维微球，它正在成为突出的下一代仿生注射支架系统，其作为聚合物支架显示出宿主体的可接受性更高，免疫反应较小。SARVIYA等[91]系统研究以了解单独使用仿生纳米纤维微球和不同浓度锂皂石的物理化学特性对人牙囊细胞及其细胞附着、增殖和成骨分化的影响，结果发现，锂皂石纳米硅酸盐与仿生纳米纤维可注射支架系统的作用有助于在正常生理条件下增强干细胞分化。 石墨烯基纳米材料常被用于石墨烯基聚合物纳米复合材料，作为组织工程中的支架材料填充，考虑到其研究内容是对牙囊细胞细胞毒性、氧化应激诱导以及细胞和线粒膜改变等的影响[92]，故也纳入讨论当中，望其能为更适合的支架材料提供理论实验基础。实际上，在牙科领域中，石墨烯基纳米材料正逐渐成为组织工程的替代品[93]。 目前常用的牙周组织再生工程支架材料见表3。表4总结了各材料对牙囊细胞生物学特性的影响，便于直观反映不同支架材料对牙囊细胞的作用效果，主要涉及其增殖以及成骨分化的影响。"

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此外，有系统性的关于复合支架搭载间充质干细胞外泌体的研究[94]，外泌体注入支架中可在一定程度上解决其体内半衰期短、无法实现局部缓释的局限性，从而用于组织修复和再生，并取得了一定的治疗效果。但目前其在牙周组织修复的运用集中在牙周韧带干细胞中，尚未有牙囊细胞外泌体结合支架材料的研究，故该方法在未来也许能通过实验验证其应用价值。"