2.1   非编码RNA的分类及基本功能特征   非编码RNA是指由基因组转录出来的RNA分子，这些RNA分子并不涉及蛋白质的编码过程，凭借其调节能力已成为各种生物学现象中的一线分子参与者之一[6]。在人类基因组中，74.7%的序列可以转录成RNA，但mRNA的总外显子序列只有2.94%[7-8]。剩余的序列信息以非编码RNA的形式输出。根据功能，非编码RNA可分为调控型非编码RNA和结构型非编码RNA两大类。调控型非编码RNA主要是通过影响基因的表达方式来实现其功能。自非编码RNA被发现以来，其在肺纤维化当中的研究越来越多(表1)，该文主要讨论调控型非编码RNA与肺纤维化的关系，常见的调控型非编码RNA包括微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、环状RNA (circular RNA，circRNA)等。"

2.2   非编码RNA与肺纤维化    2.2.1   miRNA与肺纤维化   miRNA是一种长度在20-24个核苷酸之间的内源性小RNA，主要功能是通过与mRNA的3’非翻译区(3’UTR)结合来发挥作用，通过抑制翻译过程或降解靶标mRNA来促成基因的沉默作用，从而调节基因表达[9]。miRNA的作用机制开始于miRNA基因的转录，产生一个初级 miRNA后再形成一个更短的pre-miRNA，最终形成成熟的miRNA。成熟的miRNA会被嵌入到一个被称为RNA诱导沉默复合体的结构中，该复合体在miRNA的引导下靶向mRNA[10-11]。有研究对miRNA的作用机制进行了探讨，发现它们通过将RNA复合物引导至mRNA的互补区域，从而减少含有miRNA互补序列的mRNA活性。miRNA和mRNA 之间的紧密互补配对可能会导致相互配对的mRNA被切割和降解，而抑制翻译过程则是通过miRNA与其靶标之间的不完全或较弱的互补配对来实现的[12]。miRNA对于正常的发育和生理功能至关重要。近年的研究愈发发现，miRNA在肺纤维化的发生发展过程中存在正向或负向的调控关系[13]，并且有着重要的功能作用。肺纤维化是间质性肺炎慢性进行性纤维化的特殊形式之一，特征是肺组织瘢痕形成。 KADOTA等[14]的研究揭示了在重复性肺泡上皮损伤引起的致病性特发性肺纤维化(肺纤维化的一种特殊形式)伤口愈合中，转化生长因子β和WNT基因的广泛作用[15-16]。此外，细胞外囊泡被发现能够携带并传递生物活性分子，参与多种生理及病理过程[17-18]。KADOTA等[14]的实验表明，人支气管上皮细胞来源囊泡通过减弱WNT信号传导，能抑制转化生长因子β介导的肌成纤维细胞分化和肺上皮细胞衰老；人支气管上皮细胞来源囊泡中的miRNA主要通过抑制WNT信号通路的经典和非经典路径减弱细胞衰老和肌成纤维细胞的分化，特别是miR-16、miR-26a、miR-26b、miR-141、miR-148a和miR-200a在降低肌成纤维细胞中WNT5A和WNT10B的表达以及人支气管上皮细胞中WNT3A、WNT5A和WNT10B的表达方面发挥了作用。以往的研究表明，在特发性肺纤维化患者中，Let-7d的表达会下调，而高迁移率族蛋白A2的表达上调，这促进了上皮-间质化过程[19-20]。在转化生长因子β1激活的情况下，高迁移率族蛋白A2水平的上升与转化生长因子β对Let-7d的下调作用相联系。作为促炎因子的高迁移率族蛋白A2增加可能会推进肺纤维化的发展。另外，miR-26a被发现参与了包括心脏纤维化和特发性肺纤维化在内的多种纤维化过程。 LIANG等[21]研究发现，miR-26a表达在肺纤维化小鼠肺部和特发性肺纤维化模型中降低，这种下降导致结缔组织生长因子的转录后抑制减弱，进而激发了胶原蛋白的生成；miR-26a在肺部的抑制会在体内引起肺纤维化，而miR-26a的高表达抑制了转化生长因子β1对MRC-5细胞(一种人类肺成纤维细胞株)纤维化的诱导作用；转化生长因子β1媒介的Smad3磷酸化作用导致miR-26a表达下降，同时miR-26a直接作用于Smad4且抑制p-Smad3进入细胞核的过程，进而影响p-Smad2/Smad3在细胞核内的定位情况。该实验证明了miR-26a在纤维化肺疾病中的抗纤维化作用，同时也提出使用miR-26a预防和治疗特发性肺纤维化的新策略。同年，LIANG等[22]通过综合分析再次证明了miR-26a表达在患有实验性肺纤维化的小鼠中下调。 FERNANDEZ等[23]的研究发现miR-31对组织纤维化是负向调节的，因为miR-31在博来霉素诱导的纤维化和特发性肺纤维化患者的纤维化成纤维细胞中表达降低。SUN等[24]研究了miRNA在二氧化硅诱导的肺上皮细胞上皮-间质化中的作用，发现miR-29b被二氧化硅动态下调并影响了RLE-6TN细胞(大鼠肺上皮细胞)的上皮-间质化过程；此外，向肺纤维化小鼠递送miR-29b可显著抑制二氧化硅诱导的上皮-间质化，预防肺纤维化，改善肺功能，证明miR-29b可能是矽肺纤维化过程中的新型负调节因子。YAMADA等[25]的研究发现，miR-29b在博来霉素诱导的肺纤维化中降低胶原表达，并且miR-29b可以抑制肺纤维化模型小鼠中纤维化相关基因Ⅰ型胶原的表达，从而减缓肺纤维化的进展。 2019年，WEI等[26]利用RNA测序和定量RT-PCR方法对转化生长因子β1诱导的人肺成纤维细胞中的miRNA变化进行了全面研究，发现miR-133a在转化生长因子β1刺激下呈时间和浓度依赖性上调，miR-133a抑制转化生长因子β1诱导的肌成纤维细胞分化，而miR-133a抑制剂则增强了转化生长因子β1诱导的肌成纤维细胞分化；转化生长因子β1、结缔组织生长因子和Ⅰ型胶原是miR-133a的直接靶标，将miR-133a基因引入肺部组织能有效缓解由博来霉素引发的小鼠肺部纤维化现象。BOUTZ等[27]将HEK 293细胞(人类胚胎肾细胞系)与每个荧光素酶/nPTB 3′UTR 报告基因和人工miRNA或荧光素酶特异性siRNA结合共转染，发现miR-133可以下调携带nPTB 3′UTR的mRNA表达，抑制纤维化进程。2017年，CUI等[28]发现miR-34a在特发性肺纤维化患者和实验性肺纤维化小鼠的肺肌成纤维细胞中表达增加，证实miR-34a通过促进肺成纤维细胞的衰老来抑制肺部的纤维化反应，发挥负反馈调节机制。 根据YANG等[29]的研究，经转化生长因子β1处理的人类肺成纤维细胞中miR-145表达增加；此外，与健康人相比，miR-145在特发性肺纤维化患者肺组织中的表达升高；在肺成纤维细胞中过度表达miR-145可导致α-平滑肌肌动蛋白的表达增加并加强细胞的收缩能力，促进局部和纤维性粘连的生成，相反，miR-145缺失会减少转化生长因子β1诱导的α-平滑肌肌动蛋白表达；miR-145不影响转化生长因子β1的活性，但可促进潜在转化生长因子β1的激活，miR-145的靶向目标是KLF4(一种锌指转录因子)，KLF4被认为是调控α-平滑肌肌动蛋白表达的一个负向调节因子。 2020年，HUANG等[30]通过RNA序列化技术发现miR-424是转化生长因子β1诱导的人肺成纤维细胞中重要的miR，转化生长因子β1诱导后导致人类肺成纤维细胞内的miR-424表达量增加了2.6倍，在纤维化肺组织中的增加幅度为1.7倍。此外，SIS3(Smad3抑制剂)能够阻断转化生长因子β1诱导的miR-424表达上升，这揭示了转化生长因子β1经典信号传导途径参与肺纤维化进程；通过转染miR-424发夹抑制剂可降低转化生长因子β1诱导的经典肌成纤维细胞分化标志物的表达。荧光素酶报告基因实验显示，miR-424模拟物能够抑制Slit2(一种分泌型糖蛋白)的3′-UTR基因活性，而对Slit2的3′-UTR进行突变可消除这种抑制效应。综上，该研究结果揭示了miR-424在转化生长因子β1诱导的人肺成纤维细胞分化中具有促纤维化作用，其通过减少负调节因子 Slit2的表达发挥转化生长因子β1信号通路的正反馈调节作用。 LION CARDENAS等[31]的研究表明，对博来霉素敏感和耐药的小鼠纤维化反应与独特的miRNA表达模式相关，miR-199a-5p在特发性肺纤维化患者肺部组织中的表达显著升高；洞察蛋白1(细胞膜的一部分)被确认为是miR-199a-5p的直接靶标，miR-199a-5p通过调控洞察蛋白1来诱导转化生长因子β的表达，从而加强肺成纤维细胞的分化和增殖，推动纤维化的进展。 ADEL等[32]在辣椒素治疗博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型中发现，miR-155-5p可以调控其靶炎细胞因子白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和转化生长因子β1的表达来改善中性粒细胞胞外陷阱产生的影响。该研究表明，miR-155-5p下调与白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1的水平显著降低相关，这一发现为基于辣椒素的治疗在改善特发性肺纤维化肺损伤中的应用提供了新的见解。 PATTNAIK等[33]通过体外培养人肺细胞实验发现，核因子I-B的过表达抑制了上皮-间质转化，并减轻了博来霉素诱导的小鼠肺纤维化严重程度，确定了miR-326对核因子I-B的翻译后调控。该团队设计了一种治疗方法，涉及以过表达质粒或以miRNA-326 的形式外源性给予核因子I-B，这种治疗方法可降低间充质细胞表型并恢复上皮细胞表型，从而防止肺纤维化的发展或进展。miRNA与肺纤维化的相关研究总结，见表2。"

2.2.2   lncRNA与肺纤维化   lncRNA是长度超过200个核苷酸的调控型非编码RNA，具有5’帽和3’ poly A尾，但缺乏编码蛋白质的开放阅读框[34]，尽管lncRNA不编码蛋白质，但在基因表达以及调控过程中发挥着十分重要的功能。lncRNA可以根据其在基因组上的位置关系分为以下几类：内含子lncRNA、蛋白编码基因间的lncRNA及反义lncRNA[35]。lncRNA可以通过多种方式影响转录后水平的表达，例如通过作为竞争性内源性RNA来调节miRNA水平。lncRNA可以发挥不同的功能，并根据定位具有不同的相互作用伙伴。 lncRNA在各种生物学过程中都发挥着重要作用。越来越多的证据表明，lncRNA不仅可以调节先天免疫应答，还可以调节更复杂的适应性免疫应答及免疫细胞发育[36]。近年来，研究者们在组织纤维化领域发现了lncRNA同样发挥了不可小觑的作用。lncRNA与肺纤维化大量相关研究已有报道[37]，lncRNA作为多种生物过程的调节因子，已被证明参与特发性肺纤维化的病理生理学，包括成纤维细胞活化[38]。 ZHAO等[39]的研究显示，在小鼠纤维化阵列中，lncRNA PFAR(一种在肺纤维化中发挥作用的lncRNA)通过海绵miR-138调节YAP1-Twist轴来促进肺纤维化过程中的成纤维细胞分化。SAVARY等[40]通过小鼠和人类微阵列鉴定发现，lncRNA DNM3OS(一类单链RNA生物分子)为转化生长因子β诱导的成纤维细胞活化的成纤维细胞特异性关键效应子，它通过产生3种不同的促纤维化成熟miRNA(miR-199a-5p/3p和miR-214-3p)来调节纤维化过程。ZHANG等[41]的研究表明，不同的lncRNA调节不同细胞类型的肺纤维化。lnc ITPF(按功能重新命名的新型lncRNA)与异质核糖核蛋白L形成RNA-蛋白质复合物，以控制成纤维细胞中的宿主基因ITGBL1，从而加速肺纤维化进程[42]。lncRNA核糖核酸BC158825/lnc PCF通过海绵miRNA mir344-5p靶向肺泡上皮细胞中的MAP3K11(一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)来促进肺纤维化[43]。 2022年，ZHANG等[41]在研究中发现，lnc IAPF(一种新型lncRNA)通过促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化而加速肺纤维化，肺纤维化中lnc IAPF表达显著增加的因素：组蛋白3赖氨酸27乙酰化(H3K27ac)修饰利于lnc IAPF启动子的染色体区域开放，染色体区域开放后ATF3与lnc IAPF启动子结合并启动lnc IAPF转录；同时证明了ELAVL1(ELAV样RNA结合蛋白1)是主要的lnc IAPF结合蛋白，lnc IAPF过表达可增强肌成纤维细胞的增殖和迁移，然而这种行为会因ELAV样RNA结合蛋白1表达的干扰而逆转，lnc IAPF对纤维化的影响取决于ELAV样RNA结合蛋白1。 WANG等[44]发现敲低lncRNA H19能够通过调节miR-140-转化生长因子β/Smad3信号通路在体外和体内减轻肺纤维化。HUANG等[45]在实验中发现lncRNA FENDRR在缓解肺纤维化方面也发挥了一定的作用。LI等[46]的研究发现，lncRNA NEAT1通过miR-9-5p/转化生长因子β信号通路促进肺纤维化。 SUN等[47]的研究发现，lncRNA DACH1(腊肠犬同源物1)在特发性肺纤维化患者肺部和肺纤维化实验小鼠模型中的表达均下调，DACH1敲除小鼠发生了自发性肺纤维化，DACH1的过表达则减弱了转化生长因子β1诱导的小鼠肺成纤维细胞异常激活、胶原沉积和分化，证实DACH1的强制表达不仅预防了博来霉素诱导的肺纤维化，还逆转了博来霉素小鼠模型中的肺纤维化。机制研究发现，DACH1与富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1蛋白结合，降低了丝氨酸/精氨酸的剪接因子1的活性并抑制了CTNNB1(编码β-连环蛋白的基因)的积累，丝氨酸/精氨酸的剪接因子1表达的增强阻断了lnc DACH1在肺成纤维细胞中的抗纤维化作用。lnc DACH1的缺失促进了小鼠肺成纤维细胞的增殖、分化和细胞外基质沉积，而CTNNB1的沉默则消除了这些影响。此外，lnc DACH1的一个保守片段减轻了转化生长因子β1驱动的MRC-5细胞过度增殖、细胞外基质沉积和分化。 QIAN等[48]的研究发现，在博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型和转化生长因子β1刺激的RLE-6TN细胞模型中，ZEB1-AS1的表达均上调并与ZEB1密切相关。该研究还发现，抑制ZEB1-AS1可以减缓上皮-间充质转化过程，有助于缓解博来霉素引起的纤维化现象。在作用机制上，ZEB1-AS1被认为是推动RLE-6TN细胞纤维化的关键因素，而ZEB1-AS1沉默能通过调控miR-141-3p来抑制转化生长因子β1触发的纤维化过程。ZEB1-AS1充当miR-141-3p的竞争性内源RNA，ZEB1-AS1过量表达会减少miR-141-3p的水平，进而触发ZEB1的活化，而增加miR-141-3p表达能够通过针对ZEB1的作用来抑制纤维化过程。这一研究揭示了lncRNA ZEB1-AS1作为一种新型促纤维化因子，通过调控miR-141-3p/ZEB1通路影响肺纤维化的发展。 LIU等[49]发现萝卜硫素的抗纤维化功能主要依赖于lncRNA(LOC344887)，在LOC344887的启动子和内含子1中发现了2个功能性AREs(抗氧化应激元件)，表明LOC344887是一个新的抗纤维化NRF2靶基因。RNA-seq分析结果显示，LOC344887控制与纤维形成相关的基因和信号通路，LOC344887的缺失或下调可增强CDH2/N-cadherin等纤维化基因的表达，减弱萝卜硫素的抗纤维化作用。此外，LOC344887介导的纤维化基因下调可能涉及PI3K-Akt信号通路，因为使用药物抑制PI3K活性可阻断LOC344887的作用。该研究结果表明，NRF2介导的LOC344887上调抑制了CDH2等纤维化基因的表达，进而促进了萝卜硫素的抗纤维化潜能。 LIU等[42]的研究发现，lncRNA SNHG16在博来霉素和转化生长因子β诱导的肺纤维化模型中表达上调，敲低SNHG16可以减轻肺纤维化；机制研究表明，SNHG16可以结合和调控miR-455-3p的表达，进而调节Notch2的表达，因此lncRNA SNHG16通过调控Notch2的表达促进肺纤维化。SUN等[50]的研究发现，TP53TG1(由p53诱导的lncRNA TP53靶点-1)是特发性肺纤维化调控网络中失调的枢纽基因，也是特发性肺纤维化驱动的成纤维细胞中下调的顶级基因之一，TP53TG1过表达可抑制纤连蛋白1、胶原1α1、胶原3α1、ACTA2 mRNA、Fn1和Ⅰ型胶原蛋白水平的升高，以及转化生长因子β1诱导的MRC-5细胞和原代小鼠肺成纤维细胞中成纤维细胞的过度增殖迁移和分化；此外，腺相关病毒(AAV5)强制表达TP53TG1可防止博来霉素小鼠模型诱导的实验性纤维化，逆转小鼠模型中已建立的肺纤维化。SUN等[51]通过腹腔内注射百草枯来构建小鼠肺损伤及间质纤维化模型，采用转录组测序与微阵列技术检测肺部纤维化过程中的lncRNA表达，发现在百草枯引起的纤维化肺组织中有513种lncRNA表达水平升高，204种lncRNA表达水平降低；基因分析表明，这些差异表达的lncRNA与上皮形态发生、伤口愈合和细胞分化相关，这些途径都与上皮-间质转化密切相关。该团队还鉴定了2个上调lncRNA的进化保守靶基因：2700086A05Rik和uc.77，这2个基因分别编码上皮-间质转化的重要调节因子Hoxa3和Zeb2，实验发现2700086A05Rik或uc.77在人类肺上皮细胞内的高表达能够触发上皮-间质转化，这一过程伴随着上皮-间质转化相关标记物的基因及蛋白质水平的提升和细胞形态学的改变。CAO等[52]使用微阵列分析纤维化肺组织与正常肺组织之间IncRNAs和mRNA表达的差异，通过原位杂交方法检测了2种差异表达显著的lncRNA，分别是AJ005396和S69206，其结果与微阵列分析所得相符；在肺纤维化大鼠模型中观察到210种lncRNA表达增加，358种lncRNA表达减少，415种mRNA表达量上升，530种mRNA表达量下降；在纤维化肺组织样本中，AJ005396和S69206的表达水平呈现出显著增加。 ZHANG等[53]在博来霉素诱导的A549细胞模型中发现lncRNA SNHG8增加，lncRNA SNHG8过表达会升高纤维化相关因子单核细胞趋化蛋白 1、CC 基序趋化因子配体18和α平滑肌肌动蛋白表达，增加 Ⅰ型胶原α-1 链和胶原 Ⅲ 型α-1 链表达，敲低SNHG8后可通过调节miR-4701-5p/MUC5B轴来减弱肺纤维化进展，这可能与转化生长因子β1/Smad2/3信号的调节有关。这些发现表明lncRNA SNHG8可能成为治疗特发性肺纤维化的潜在靶点。 黄芪是一种在中医中广泛使用的草药，被认为具有增强免疫力、抗炎和抗氧化等多种药理作用。基于这一理论，GUAN等[54]从黄芪中提取有效生物活性物成分黄芪甲苷Ⅳ，通过实验发现黄芪甲苷Ⅳ可以通过lncRNA-ATB/miR-200c/ZEB1信号通路抑制上皮-间质转化过程，从而改善肺纤维化。 FU等[55]通过动物实验证实，SRL-4可通过调节lncRNA-miRNA-mRNA途径改善肺纤维化，该实验通过SRL-4将两类非编码RNA进行了结合，进一步揭示了非编码RNA在肺纤维化发生发展中的重要性。lncRNA与肺纤维化的相关研究总结，见表3。"

2.2.3   circRNA与肺纤维化   circRNA是一种丰富的非编码RNA物种，由外显子和内含子序列形成[56]。circRNA具有多种特性，包括进化保守性、组织特异性表达和更高的稳定性[57]。circRNA可以调节基因表达充当miRNA的海绵，调节选择性剪接或作为蛋白质的转录因子和包容性编码[58]。circRNA可分为反义circRNA、外显子circRNA、基因间circRNA、内含子circRNA和正义重叠circRNA。大多数circRNA长度为201-700 bp，其中一些超过2 kb。circRNA都包含少于10个外显子[59]。关于circRNA与肺纤维化之间相关机制的研究不如miRNA、lncRNA多。 LI等[60]使用 circRNA 微阵列在特发性肺纤维化患者血浆中鉴定出67个显著失调的circRNA，其中38个上调，29个下调；在特发性肺纤维化患者血浆样本中，hsa_circRNA_100906、hsa_circRNA_102100和 hsa_circRNA_102348显著上调，而hsa_circRNA_101225、 hsa_circRNA_104780 和 hsa_circRNA_101242 表达下调，差异表达的circRNA宿主基因参与细胞周期调控、黏附连接和RNA转运，研究中建立的circRNAs/microRNAs/mRNAs竞争性内源性RNA网络揭示了一种现象，即由circRNA保护的mRNA在多个信号通路中扮演关键角色，包括缺氧诱导因子1、转化生长因子β1、Wnt、Janus激酶、Rho相关蛋白激酶和核因子κB路径，这些途径在肺纤维化过程中显得尤为重要，相关mRNA可能作为肺纤维化的潜在生物标志物。此外，该研究还发现 hsa_circRNA_100906和hsa_circRNA_ 102348分别直接与miR-324-5p和 miR-630相互作用，而miR-324-5p和 miR-630在特发性肺纤维化患者中的表达下调。2020年，QI等[61]通过实验证实，Hsa_circ_0044226敲低后可通过下调CDC27抑制RLE-6TN细胞中转化生长因子β1诱导的上皮-间质转化，从而缓解肺纤维化。 LIU等[62]的研究发现，circ-PWWP2A(环状RNA PWWP2A)在转化生长因子β和脂多糖诱导的肝星状细胞及小鼠纤维化肝组织中表达上调，并且circ-PWWP2A的表达水平与肝星状细胞的激活和增殖存在显著正相关关系；利用荧光素酶报告系统和蛋白质相互作用的下拉实验有效确认了miR-203和miR-223为circ-PWWP2A的下游目标microRNA，降低circ-PWWP2A表达能有效缓解体内的肝纤维化症状。 BAI等[63]的研究发现，microRNA-21的结合位点存在于circRNA_0026344内，在人类支气管上皮细胞中，circRNA_0026344能够作为microRNA-21的海绵体现其功能。研究使用pcDNA3.0-circRNA_0026344高表达载体转染人类支气管上皮细胞，观察到在香烟烟雾提取物刺激下导致的microRNA-21水平升高现象得到显著逆转。此外在MRC-5细胞实验中，人类支气管上皮细胞分泌的含microRNA-21的外泌体显著降低了Smad7蛋白表达，激活了转化生长因子β1/Smad3信号通路。同时通过Targetscan数据库分析预测并确认了Smad7 3’UTR区域中与microRNA-21结合的物种保守位点，利用荧光素酶报告基因实验进一步证实了microRNA-21与Smad7 mRNA 3’UTR区域的结合作用，揭示其在转录层面的抑制机制。 LI等[64]在转化生长因子β1处理的HFL1细胞(人类肺成纤维细胞的细胞系)中发现，circ_0035796和L1CAM(一种细胞表面蛋白)表达显著上调，转化生长因子β1处理诱导HFL1细胞的增殖、迁移、侵袭、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的分泌及氧化应激反应，而circ_0035796耗竭可减轻这些影响。 WU等[65]的通过体外实验和体内模型探讨hsa_circRNA_0001861在肺成纤维细胞中的功能，发现hsa_circRNA_0001861通过与miR-296-5p结合并调节其下游mRNA BBC3来抑制转化生长因子β1诱导的肺成纤维细胞的增殖和纤维化；此外，hsa_circRNA_0001861表达的上调在体内显著缓解了肺纤维化，这些发现为开发针对肺纤维化的新治疗策略提供了有价值的见解。circRNA与肺纤维化的相关研究总结，见表4。"