Chinese Journal of Tissue Engineering Research ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (52): 8498-8503.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.52.024
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Wang Teng-bin, Zhu Hui, Li Tian-shi
Revised:
2014-12-08
Online:
2014-12-17
Published:
2014-12-17
Contact:
Li Tian-shi, Associate chief physician, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
About author:
Wang Teng-bin, Studying for master’s degree, Physician, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2013010012641
CLC Number:
Wang Teng-bin, Zhu Hui, Li Tian-shi . Development of chitosan and its derivative scaffolds for tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(52): 8498-8503.
2.1 壳聚糖的结构与生物学特性 2.1.1 壳聚糖的结构 壳聚糖作为甲壳素脱乙酞氨基后的一种产物,又称为脱乙酞甲壳素,是纤维素以外第二大最丰富的天然高分子化合物[3]。壳聚糖作为一种甲壳素的脱乙酞化产物,结构上与聚多糖类似,游离的氨基可使其溶解度及生物活性大幅度提高[4]。自然界中不存在100%的甲壳素,同样,提纯制备壳聚糖也很难做到100%的纯度,其与甲壳素的区别主要在于其C2位上乙酰基的含量,通常以脱乙酰度表示。壳聚糖另一个结构上的特征为其分子链的长度,以相对分子质量表示。作为最重要的决定参数,不同的脱乙酰度及相对分子质量组合,产生的壳聚糖功能会有很大差别。 2.1.2 壳聚糖的生物学特性 除了相对分子质量值,壳聚糖的溶解度不仅与它的平均脱乙酰度值相关,更与其主链上乙酰基团分布有关[5-7]。固态下的脱乙酰过程会令最初的壳聚糖聚合物存在不规则的结构型,检测其在乙酸及盐酸下的溶解度,发现它的离子化程度与酸的pH及pK值相关[8-9]。一般来说,其主要溶解于酸而不溶于碱。 壳聚糖通过化学介质的释放表现出潜在的促炎性质[10]。组织学结果表明这种材料可以刺激分叶核白细胞及巨噬细胞的迁移[11-13],促进血管化,重组细胞外基质及形成肉芽组织[14-15]。同等条件下,壳聚糖的氮含量要远远高于其他合成纤维素,这也令其成为一个非常好的整合剂。 壳聚糖是一种生物可降解材料,主要通过酶水解而降解,其中起主要作用的是溶菌酶。Ikeda等[16]将棉花状的甲壳素(相对分子质量200 000;35%,70%及100%脱乙酰度)植入骨腔内,分别在1,3,6,9,12个月时进行组织病理学检查,所有不同类型的壳聚糖都随时间降解,并且参与到骨组织的重建中去,然而壳聚糖在骨组织内9个月才基本分解。但无论在体内或体外实验中,壳聚糖的单位结构—对关节炎症状有着非常好缓解作用的D-氨基葡萄糖却非常容易分解。 2.2 壳聚糖用于体外细胞的培养 壳聚糖的结构与黏多糖相似。使带正电荷的壳聚糖与海藻酸钠等带负电荷的高分子聚阴离子反应,可以制备不同形状的微胶囊,其半透膜可以阻止动物细胞抗体蛋白进出,却允许营养物质、代谢产物等生理活性物质的出入,保证了细胞的长期存活[17]。正因为其特殊的生物学性质,壳聚糖被广泛用于细胞培养上。 肝细胞:张瑞等[18]以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架来培养人肝细胞L-02,在实验第3天可见大部分微载体表面有许多肝细胞黏附成团,总的存活率均在90%以上,且肝细胞保持良好的形态学结构。周海洋等[19]将肝细胞分别与纤维蛋白胶、壳聚糖凝胶、鼠尾胶原、透明质酸钠支架材料复合形成工程化肝组织凝胶,接种于培养板中,并定期通过光镜来观察大鼠肝细胞,MTT比色法评价细胞活性。MTT显示细胞活性及白蛋白分泌达到高峰,A值分别为培养初期的1.11倍和1.17倍,上清白蛋白含量分别是初期的1.13倍和1.15倍,提示肝细胞在该支架上存活良好。 间质干细胞:张文元等[20]以壳聚糖和丝素以质量比为3∶7冻干制作成壳聚糖-丝素海绵状支架,用于培养大鼠真皮间质干细胞,结果显示真皮间质干细胞在支架上良好生长(24 h时实验组细胞平均黏附率为93%)。 成纤维细胞:Hsu等[21]成功地在甲壳素薄膜上培养人牙龈成纤维细胞并分离出S-亚群和N-亚群。他们认为生物膜诸如甲壳素薄膜等能有效用于细胞亚群分离,从而更好地为再生医学服务。唐庆等[22]采用酶-去垢剂法制备人脱细胞羊膜,双相法制备碱性成纤维细胞生长因子-明胶-壳聚糖缓释微球并以此培养成纤维细胞,发现成纤维细胞在支架表面爬行生长良好,层粘连蛋白表达较对照组高。 脂肪干细胞:Cheng等[23]的研究显示脂肪干细胞在壳聚糖薄膜上能被非化学性地激活,形成椭球形态并表达多样性标志基因。 软骨细胞:Kuo等[24]尝试分别在弹性蛋白及聚赖氨酸表面修饰的聚氧化乙烯壳聚糖复合支架上培养牛膝软骨细胞,结果显示细胞在两者上皆生长良好,但以弹性蛋白为表面的支架显示出更好的细胞附着及细胞增殖能力。另外,弹性蛋白修饰的支架生产出更多的黏多糖及胶原。 目前,壳聚糖薄膜或者壳聚糖支架已在体外细胞培养表现出可观的效果,并可起到分离细胞亚群的效果。在体内其降解生成的寡糖可以刺激各种细胞生长,促进成纤维细胞增生和合成生长因子。但就总体而言,壳聚糖的细胞亲和性不高,细胞黏附性仍未能尽如人意,对其改性或与其他材料如胶原、丝素等复合加以改进,将会是其发展趋势。 2.3 各种复合支架的应用 2.3.1 壳聚糖-胶原支架 壳聚糖支架虽然生物相容性良好,但由于单纯的壳聚糖材料亲水性较差、降解速度慢等原因,目前国内外大部分研究倾向于将壳聚糖与多种材料甚至各种生长因子进行复合构建组织工程支架,壳聚糖-胶原支架就是其中一种。胶原蛋白本身就是所有哺乳动物细胞外结构基质的骨架,它在为细胞提供支持和保护作用的同时,与细胞的黏附、生长及表型表达均有密切关系。医用胶原材料作为组织引导材料、可降解缝合线及止血海绵等在临床已取得良好效果。由于其纤维结构有利于组织培养中的细胞黏附、长及增殖,使其成为一种理想的组织工程支架材料。 利用组织工程学的方法制备人造皮肤是解决烧伤患者皮源不足的有效途径之一[25]。壳聚糖结构与人体内的糖胺聚糖相似,能促进生长因子及胶原的合成,还能减缓胶原的降解速度[26]。关嫚等[27]将固含量0.8%的胶原-壳聚糖溶液冻干后压膜,经戊二醛交联后再冻干形成双层支架的底层,然后注入固含量0.2%的胶原-壳聚糖溶液,经冻干、交联、再冻干得到结构较稳定的双层复合海绵支架。在该双层支架上培养的小鼠成纤维细胞贴壁生长正常。他们认为该双侧胶原-壳聚糖支架材料具有良好的结构稳定性,而且有较好的细胞相容性,是很有潜力的皮肤缺损修复材料。Xu等[28]将胶原壳聚糖真皮支架、胶原磺化羧甲基壳聚糖真皮支架及脱细胞基质真皮支架移植于猪Ⅲ度烧伤创面后,发现胶原壳聚糖真皮支架实验组的CD34阳性信号(新生血管数目)明显高于其他实验组,提示该真皮支架保留了壳聚糖在促进血管化方面的作用。将人工皮肤应用于活体上,过敏或毒性是一个极其重要的问题。Lu等[29]将成纤维细胞与复方真皮基质壳聚糖凝胶混合制成真皮替代物,然后接种角质形成细胞,培养二三周后,将形成的人工皮肤移植于新西兰家兔全层皮肤缺损处,无家兔出现中毒或过敏症状,皮肤各层生长良好,组织学检查未显示过度增生和肿瘤发生。 Suphasiriroj等[30]将鼠成骨细胞接种于壳聚糖-胶原复合支架,发现低脱乙酰度细胞增殖速率及碱性磷酸没水平明显高于高脱乙酰组,提示壳聚糖支架的脱乙酰度与其性能相关。 詹兴旺等[31]采用冷冻干燥法将质量分数为2%胶原与3%壳聚糖混合制备胶原-壳聚糖多孔支架,将分离培养的第2代兔软骨细胞接种到胶原-壳聚糖支架上,测得胶原-壳聚糖支架的吸水性为(80.0±0.55)%,孔隙率为(88.5±1.5)%,孔径为100-150 μm,复合细胞培养2周后细胞增殖活力高,软骨细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于对照组,认为质量分数为2%胶原与3%壳聚糖的混合支架适合软骨细胞生长和快速增殖,是一种良好的修复和重建软骨载体。 采用胶原-壳聚糖复合物制备组织工程化人造皮肤已成为众多学者的共识,胶原作为细胞外基质的主要成分,其细胞黏附性是十分可观的,正好可以改善壳聚糖在该方面的缺陷,而壳聚糖亦能促进胶原合成及减缓其降解速度,因此,作为人造皮肤支架材料而言,胶原-壳聚糖复合物有着独特的优势,但机械性能及生物力学方面的不足亦限制了它在组织工程学其他方面的应用。 2.3.2 壳聚糖-羟基磷灰石支架 壳聚糖作为天然的高分子聚合物,来源丰富,具有良好的生物相容性、可降解性及可塑性等优良特性,非常适合加工成适合细胞生长的骨组织工程支架,而目前相关的研究热点亦在于此。壳聚糖构架结构易变形,其机械属性逊色于那些正常的骨骼,所以它无法单独作为支持的承重骨植入。壳聚糖本身没有骨传导作用,添加陶瓷材料可以提高其骨传导和机械强度[32]。虽然单独使用壳聚糖构架不能模仿天然骨的所有属性,但壳聚糖聚合材料可以模拟骨的所有属性是一个重大的发现[33-34]。 季娟娟等[35]用改良MTT法检测壳聚糖膜对原代培养的胎鼠颅骨成骨细胞的毒性作用,测得壳聚糖膜对成骨细胞各时间点的毒性分级为0级或1级,认为壳聚糖有良好的生物相容性。 组织工程中的羟基磷灰石是一种人工合成的缺钙羟基磷灰石,是常见的一种生物活性材料,具有良好的生物相容性、生物活性、骨传导性及与人体骨矿物相组分的相似性,但其本身脆性大、韧性低、降解率低,不适合用于负重部位骨缺损的修复[36]。其另一较大不足在于缺乏可塑性和黏结性,故应用受到一定限制。将羟基磷灰石与壳聚糖、胶原等材料复合,有助于提高其可塑性,扩大应用范围。 刘璐等[37]将改性壳聚糖与胶原按1∶2、1∶1和2∶1制备3种改性壳聚糖-胶原-羟基磷灰石复合支架,将复合支架与成骨细胞MC3T3-E1联合培养,CCK-8法检测增殖结果发现,增加胶原含量在细胞联合培养初期有利于细胞的黏附和增殖,但从第10天开始,3种样品中细胞数量相差不大,均出现平台期。他们认为透明质酸改性壳聚糖-胶原-纳米羟基磷灰石复合材料可以作为骨支架材料供成骨细胞黏附、增殖,其中胶原与壳聚糖的体积比为1∶1为较优配比。 徐培等[38]将纳米羟磷灰石/壳聚糖支架材料与大鼠成骨细胞在体外复合培养,采用MTT比色法和生长曲线描绘支架材料对细胞增殖的影响。发现大鼠成骨细胞能在纳米羟磷灰石/壳聚糖材料上附着、增殖,其生长良好,生理功能不受抑制。 Kavya等[39]将壳聚糖-硫酸软骨素-纳米二氧化硅以冻干法焊接成纳米支架外加纤维蛋白涂层,培养MG-63细胞,结果提示细胞生长良好,认为该支架可作为骨组织工程学的理想材料。史宏灿等[40]将第3代软骨细胞种植到羧乙基壳聚糖-纳米羟基磷灰石复合材料,分别计算材料表面软骨细胞在2,6,12 h的细胞贴壁率,并用MTT法测定细胞增殖活性,发现兔气管软骨细胞在羧乙基壳聚糖-纳米羟基磷灰石复合材料表面上12 h的贴壁率达(88.4±2.1)%,与其他组差异无显著性意义(P > 0.05)。同时MTF检测显示气管软骨细胞在羧乙基壳聚糖-纳米羟基磷灰石复合材料表面生长状态良好。扫描电镜结果显示软骨细胞在羧乙基壳聚糖-纳米羟基磷灰石薄膜上增殖和分化良好。 壳聚糖-羟基磷灰石聚合物是骨组织工程良好的载体,具有高生物相容性、生物可降解性、多孔结构、骨传导,无细胞毒性,所以其被广泛应用在骨组织工程中,但仍存在羟基磷灰石与壳聚糖界面结合不太理想、粒子分散不均匀、脆性大、力学性能差等问题,所以目前的研究方向应在于发现如何改善这种机械力学性能的差距上面。 2.3.3 人工合成高分子材料-壳聚糖支架 人工合成高分子生物材料聚乳酸和聚羟基乙酸已作为第一批可降解吸收材料被美国食品药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准用于临床,是迄今研究最多的人工合成可降解材料,具有良好的生物相容性,其降解产物为CO2、H2O和羟基乙酸。 朱奇等[41]在壳聚糖神经导管中插入聚乳酸/聚羟基乙酸纤维制备成组织工程化神经,移植桥接Beagle犬坐骨神经50 mm缺损,同时以Beagle犬50 mm自体神经移植作为对照组,植入后2,4,6个月血液学和血清生化检测结果与对照组无明显差异;再生神经及其周边组织未出现变性、坏死,心、肝、脾、肺、肾等主要脏器大体解剖和组织切片未见异常。他们认为壳聚糖/聚乳酸羟基乙酸组织工程化神经植入Beagle犬体内6个月后生物相容性良好。 王新刚等[42]采用冷冻-冻干法制备聚乳酸-羟基乙酸编织网/胶原-壳聚糖多孔支架(PCCS)和胶原-壳聚糖支架,对比观察PCCS、聚乳酸-羟基乙酸编织网及胶 原-壳聚糖支架的微观形态及吸水能力,发现PCCS多项指标均高于其余两组,提示PCCS能够快速诱导血管长入并促进血管成熟,其中支架的机械支撑作用与三维多孔结构具有重要协同作用。 聚乳酸-羟基乙酸复合壳聚糖支架亦存在不足之处。Jiang等[43]体外研究发现,壳聚糖复合聚乳酸-羟基乙酸后的压缩模量和抗压强度与骨小梁相似,因此可用作承重骨的骨组织工程支架材料。Jiang等另一项研究发现,聚乳酸-羟基乙酸支架复合壳聚糖后在体外降解得更慢,随之力学性能也下降,而单纯聚乳酸-羟基乙酸支架虽然降解速度较快,但降解前12周仍能保持良好的力学性能。这暴露了壳聚糖作为附加剂的不足之处,即随着材料降解,力学性能下降明显。若要保持材料的力学性能,则需要通过改变复合方法,再添加另一种材料来弥补这一缺陷。该研究还发现,聚乳酸-羟基乙酸支架复合壳聚糖后在体内发生的炎症反应更严重,时间更长,造成矿化作用减弱。这很可能就是复合材料力学性能下降的原因之一。 2.3.4 可注射性支架 随着微创技术的发展,可注射性组织工程日益受到重视,壳聚糖水凝胶特别是温敏性壳聚糖水凝胶,作为一种可注射性支架更是备受关注。壳聚糖水凝胶不仅具有壳聚糖支架良好的生物相容性及可降解性,更可以液态形式注射入体内,并在生理温度下转变为凝胶,具有一定的生物强度。田华科等[44]以壳聚糖、β-甘油磷酸钠水溶液和羟乙基纤维素溶液为原料制备壳聚糖水凝胶支架,将其与兔髓核细胞复合构建组织工程髓核,细胞存活率>90%,扫描电镜显示细胞表面有细胞外基质分泌,RT-PCR示COl Ⅱ、聚集蛋白聚糖mRNA较单纯培养多。Madhumathi等[45]采用湿化学合成发在壳聚糖水凝胶表面添加了一层羟基磷灰石,在保持壳聚糖原本良好的生物相容性同时提升了水凝胶的机械强度,弥补了其不足之处。但相对其他复合支架,其机械强度依然不尽如人意。 2.3.5 改性壳聚糖支架 通过化学或物理方法对壳聚糖进行交联改性,以提高其机械性能,控制体内周期等,也是目前的一个研究趋势。目前常见的物理改性交联方法有热交联、电磁波交联、凝胶化改性等,化学改性交联则有明胶、脱氧胆酸、烷基化和棕榈酰等多种多样。改性后壳聚糖的机械强度、生物学性能等均有所提高,且相对上述的复合支架,单一的改性壳聚糖支架降解周期更加容易控制,整体生物学性能及机械性能不易被其他混合材料左右,成分单一,纯度亦更可控,对比其他复合材料更加稳定,临床结果可重复性更高,但目前在组织工程上的应用还相对缺乏。 Torres等[46]用纤维蛋白原改性壳聚糖及未改性壳聚糖培养多核破骨细胞,观察其对底物的吸收程度及速度,结果发现两者的细胞黏附率相似,但在培养21 d后,改性组细胞数量较未改性组多,另外改性组抗酒石酸酸性磷酸酶更多。通过荧光显微镜及电子显微镜确认,改性组底物吸收率更高。该研究提示纤维蛋白原可能对破骨细胞的吸收功能有促进作用。 成分更为单一的改性壳聚糖支架易于与其他物质复合成多功能支架。Marsich等[47]通过冻干法及凝胶化将纳米银颗粒与乳酸改性壳聚糖支架复合,希望得到具有杀菌功能的支架。CT扫描显示该支架是平均孔径341.5 µm、孔隙率80%的单相多孔结构,体外实验显示纳米银并不影响乳酸改性壳聚糖支架对成骨细胞增殖的促进作用,并且对革兰阳性菌、革兰阴性菌均显示出强大的杀菌能力。"
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