Polypeptide modified coating, a bone tissue engineering material, is used for treatment of osteoporosis

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.018

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: The biological substances fixed onto the implant surface, including specific proteins, enzymes, polypeptides, could promote the proliferation and differentiation of osteogenic cells in order to achieve a good osteogenic effect.
OBJECTIVE: To introduce the biological characteristics of the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) peptides, cell biological behavior and implant osseointegration in osteoporosis.
METHODS: Authors retrieved the relevant articles in PubMed database (January 1984 to January 2013), Wanfang database (January 2002 to December 2012) and CHKD database (January 2002 to December 2012) using the key words “RGD peptides, osteoporosis, bone marrow mesenchymal stem cells, osseointegration, osteoblast, induced differentiation”. Papers were included concerning the biological characteristics of RGD peptides, the biological behavior of cells and the bone-implant integration in osteoporosis.
RESULTS AND CONCLUSION: Osseointegration on the surface between implant and bone tissue can be further improved by grafting biologically active substance. Bionics modification, to simulate the extracellular matrix environment in vivo, can promote cell adhesion and growth, which is an effective way to improve osseointegration and is also an important direction of research in the field of tissue engineering recently. The future research is focused on designing specific and efficient polypeptides and simple and effective fixation methods.

Key words: biocompatible materials, tissue engineering, osteoporosis, osseointegration

CLC Number:

R318

Wang Cong, Yuan Wen, Wu Xiao-dong, Ao Hai-yong . Polypeptide modified coating, a bone tissue engineering material, is used for treatment of osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(42): 7455-7461.

Figures/Tables 1

2.1 RGD多肽的生物学效应 RGD多肽是一段由3个氨基酸组成的短肽序列，它是许多细胞表面某些整合素的特异性配体，是目前应用最广泛且被证明是最有效的促黏附多肽，被称之为“黏附序列”。RGD多肽作为细胞黏附序列是由Pierschbacher等[15]于1984年在纤维粘连蛋白中首次发现的，他们观察到RGD多肽能使整合素α5β1从亲和柱洗脱，固定在基质材料后能黏附细胞。此后，在许多骨非胶原蛋白中也发现了含有RGD的氨基酸序列，它们除了在结构上具有共性外，在功能上也都具有支持细胞黏附和介导基质矿化的作用。RGD序列在这些没有固定形态的非胶原蛋白中发挥着重要的生物活性，细胞表面的整合素蛋白能够识别并结合这一序列，介导细胞与细胞之间和细胞与胞外基质间的黏附作用，同时启动跨膜信号传导，联系细胞外环境与细胞内的代谢活动，对细胞生长代谢起着重要调节作用。与RGD序列结合的受体称之为“整合素”。整合素是由α及β二个亚基以非共价键结合形式构成的具有跨膜蛋白特性的异二聚体受体，被首次发现于20世纪90年代中期，目前已发现了16种α亚基和8种β亚基，构成20余种整合素，骨组织中表达的有8种，分别为α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α8β1、αvβ3及αvβ5, 成骨细胞膜表面表达的整合素主要是α5β1，破骨细胞则主要表达αvβ3。含有RGD的蛋白通过特异整合素受体使成骨细胞及破骨细胞参与骨代谢，与很多骨代谢疾病的病理机制有很大关系。整合素与细胞外基质蛋白结合形成信号转导的基础结构，细胞外基质-整合素-细胞骨架及信号传递分子复合物，即焦点黏附物，与FAK结合后自身磷酸化而激活，骨架蛋白可能在黏着斑激酶激活中起作用，激活的黏着斑激酶进而激活多条信号转导通路，通过改变细胞形态、细胞骨架重建将细胞外信息传递到细胞内，调控基因表达，行使功能。近年来发现整合素触发的是酪氨酸磷酸化级联反应[16]，其中黏着斑激酶是信号转导途径中的关键酪氨酸激酶。生物材料工程研究发现，在植入的生物材料表面构建RGD多肽，可以诱导成骨细胞整合素基因的表达，促进成骨细胞黏附与生物材料的表面并分化成熟，促进骨形成[17-18]。 2.2 影响RGD多肽生物学效应的因素 2.2.1 密度的影响成骨细胞及骨髓间充质干细胞的黏附效果与RGD的密度有密切关系。若RGD密度过低，不能充分发挥其黏附特性，影响成骨细胞的表面黏附效率。若密度过高又会一定程度上限制细胞的行为，许多研究结果已经表明了RGD密度与细胞行为的关系。Massia等[19]用放射性125I标记的合成多肽GRGDY(Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr)共价连接于玻璃底物表面，以寻找适于细胞延展的最优密度，当RGD表面密度为1 fmol/cm2，即RGD肽-肽间距在440 nm时最有利αvβ3介导的细胞延展，而140 nm间距(RGD密度为10 fmol/cm2) 则最适于种子细胞黏着斑形成和张力纤维重组；并且认为12 pmol/cm2的表面密度达到了RGD的饱和水平，过高的密度因配体间相互掩蔽及空间狭小，阻碍了较大受体分子在有限空间内进行簇集，因而并不能使所有的RGD发挥生物黏附效力，影响细胞黏附效果。Schuler等[20]发现RGD肽发挥活性的最低密度是0.027 pmol/cm2，随着RGD肽密度的升高，成骨细胞的黏附量越多，当密度达到0.67 pmol/cm2时与TiO2组相当。但RGD密度的升高对黏附成骨细胞的形态也有不利影响，当密度大于0.67 pmol/cm2时成骨细胞表现为分化能力较差的伸展形态，而分化成熟时的圆形形态消失，说明随着密度升高细胞的铺展形态受到了影响。以往部分研究认为，对于骨细胞的生长，RGD密度的最优值应该为(0.62±0.25) pmol/cm2[21]。但目前对于在动物实验中固定于材料表面的RGD修饰密度应该控制在一个怎样的范围内还需要进一步研究。 2.2.2 空间结构的影响 RGD多肽的构象对细胞识别过程极为重要，在含有RGD多肽中引入构象限制可提高其与整合素受体的亲和性。黏附蛋白的RGD序列位于β转角的顶端，即位于两个反平行折叠片层形成的β转角尖端，这个环远离分子核心部位，非常暴露并呈动态构象，即具有高度的柔性，这种柔性可使RGD的构象诱导楔合整合素受体的结合。目前多数研究仍然集中在体外，脱离了体内的复杂生物环境，减少了动物体内酶的破坏，并且为了减少蛋白在实验中的消耗及免疫原性，多数实验利用人工合成或是分离提取的短肽序列，进一步增强了配体分子的稳定因素，所以就目前实验中的部分结果不能充分说明体内的全部情况。含RGD多肽因空间构象的不同又分为线性多肽和环性多肽。研究较多的线性多肽是GRGD、GRGDSPC、GRGDSY等，常见的环形多肽是cyclo-RGDFX、cyclo-DFVRA、cyclo-DFKRC等。由于环肽空间结构稳定性好，半衰期较长，所以生物活性较持久，能较线性肽更强、更特异地促进细胞黏附，且耐受蛋白降解[22-23]。Verrier等[24]发现与线性RGD肽相比，更加少量的环形RGD多肽可以取得相同的黏附效果，证明环状RGD序列具有更强的生物学效应。 2.2.3 其他因素的影响单独的RGD三肽是无活性的，通过在C端接上其他氨基酸才表现出一定的生物活性。一般认为，与RGD肽相连的第4位氨基酸对活性影响较大，第5位氨基酸则对它的集合专一性起着关键作用。许多RGD多肽都可促进成骨细胞的生长，但是因周围序列的不同而表现不一样的生物活性。目前认为RGD后的邻位氨基酸能够对所结合的整合素类型及受体亲和力产生影响[25]。另一些多肽或是生长因子虽然对细胞黏附无明显影响，但它对RGD多肽有很好的协同作用，如LDV、PHSRH等。Jeschke等[26]发现随着时间的推移，在24 h后RGD多肽增强细胞黏附的作用有所减弱，当增加转化生长因子β时可延长RGD的黏附效应。对于人工合成RGD肽及含RGD的肽链而言，固定状态时能起到类似基质蛋白的作用，启动细胞黏附；而当其为游离状态时能竞争性地与细胞表面受体结合，抑制细胞与纤连蛋白、玻璃黏连蛋白、胶原蛋白等的黏附，因而RGD具有双重生物效应。 2.3 骨质疏松状态下细胞的生物学特性在骨质疏松状态下，成骨细胞及破骨细胞生物学特性有所改变，会发生成骨能力下降及破骨能力增强，导致骨代谢失衡。随着近年来对骨质疏松机制研究的深入，研究者逐渐把研究重点放在了成骨细胞来源细胞-骨髓间充质干细胞上。细胞黏附过程可被描述为4个连续发生并相互重叠的变化时相：细胞附着、细胞伸展、肌动蛋白细胞骨架的组织及黏着斑的形成，它是一个涉及多种成分并受到多种因素影响的复杂过程[27]。启动这个过程需要一连串的配体受体结合及跨膜信号传导来完成。国内学者提取骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞并培养，通过扫描电镜对观察细胞形态及贴壁率，并且描绘细胞生长曲线，发现在骨质疏松状态下，骨髓间充质干细胞的黏附、增殖能力明显下降，形态亦有所差异，研究认为细胞的最初黏附效应对随后的增殖分化影响较大[28]。李冬菊等[29]研究提示去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力降低。Mets等[30]研究骨髓基质细胞发现，快速增殖形成大集落的细胞较增殖速度慢形成小集落的细胞有着更强大的群体倍增能力，推测原因可能是体外培养骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞较对照组传代Ⅱ型细胞的比例增加快，逐渐成为无增殖能力的终末分化脂肪细胞，导致细胞增殖能力减弱。有研究显示，RGD多肽修饰聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架虽然对细胞增殖无显著促进作用，但可明显提高骨髓间充质干细胞对改性材料的黏附效果，并且对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化有显著促进作用。由于骨髓间充质干细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞双向分化的潜能特点，可通过抑制其向脂肪细胞分化而促进其向成骨细胞分化。从材料学角度来说，改善与之接触材料表面的理化特性对细胞黏附起着关键作用[31-32]，从而弥补因病理状态下的细胞生物学特性，进一步增强细胞增殖、分化的能力[33]。 2.4 RGD多肽对骨质疏松中种植体的影响骨科内植物的早期骨整合对植入物-骨界面长期稳定性至关重要。目前通过涂层来改善种植体骨整合的方法主要分为物理改性、化学改性[34]、生物化学改性。生物化学改性即在种植体表面接种生物活性物质，是目前研究的热点。将对成骨细胞黏附、增殖、分化有明显促进作用的特定蛋白质、多肽固定于种植体表面，可促进种植体周围成骨[35]。目前研究表明，在骨非胶原蛋白中有一类蛋白在功能上具有支持细胞黏附和介导基质矿化的作用。并且这些蛋白在结构上具有一个共性，即都含有RGD序列。RGD序列能促进成骨细胞对纯钛或钛合金材料的黏附，提高成骨细胞活性，加速骨基质矿化，并且在骨代谢调控过程发挥重要作用。这类蛋白包括骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白及纤维粘连蛋白等。骨桥蛋白在骨代谢中起到了非常重要的作用，它通过细胞黏附序列RGD识别整合素αvβ5与细胞相结合，参与了细胞的黏附、迁移和增殖。骨桥蛋白能刺激成骨细胞增殖和钙化，同时也促进破骨细胞和骨基质的附着，增加破骨细胞的活性，抑制骨组织的矿化过程[36]。有研究表明在骨质疏松中骨桥蛋白表达明显升高，说明骨质疏松的发病与骨桥蛋白密切相关[37]。骨唾液酸蛋白的组织分布相对局限，主要存在于成骨细胞、破骨细胞中，在软骨细胞及牙骨质线中也有大量贮存。对骨质疏松患者进行研究，血清骨唾液酸蛋白水平与血清骨转换指标碱性磷酸酶、骨钙素呈正相关，而与血清雌激素水平及腰椎骨密度呈负相关。纤维粘连蛋白是骨基质中由成骨细胞分泌的一种糖蛋白，通过与周围基质蛋白的特异性结合，参与成骨细胞的存活、增殖等生物学行为[38-39]。研究表明纤维粘连蛋白作为细胞外基质的重要成分[40]，在骨折愈合骨痂组织中可检测其表达，提示纤维粘连蛋白可能通过调节细胞生长分化及增殖周期促进骨折愈合[41]。将这类基质非胶原蛋白质固定在钛合金表面可改善种植体表面的理化特性，提高材料表面的生物活性。但蛋白具有免疫原性，有携带病毒的风险，并且花费较高，在材料表面的稳定性较差，将其固定于植入材料表面可能难以达到预期效果。根据RGD具有的良好生物活性，将短节段多肽序列与其他类型的骨生长因子联合应用甚至可以产生协同效果[42]。Pallu等[43]分别利用体外和体内实验观察RGD涂覆的羟基磷灰石-钛合金对人骨祖细胞黏附和分化能力及骨修复的作用，结果提示RGD涂层对成骨细胞黏附、分化及体内骨再生的作用与羟基磷灰石涂层几乎相当。研究表明胶原能够促进种植体周围新骨形成，将RGD与胶原结合可增强种植体周围的骨形成作用。骨缺损修复的关键是靠细胞活化和成骨信号的释放，骨形态发生蛋白被认为是骨髓间充质干细胞向骨细胞分化的信号分子[44]。有学者发现在骨缺损区植入复合RGD多肽表面修饰的羟基磷灰石-磷酸三钙组织工程骨组中骨形态发生蛋白2的表达水平最高。学者认为，RGD多肽表面修饰的HA-TCP材料的细胞相容性明显优于单纯材料，RGD多肽修饰可黏附较多骨髓间充质干细胞在材料表面及孔隙内增殖、分化，RGD多肽表面修饰对以羟基磷灰石-磷酸三钙为支架材料的组织工程骨修复作用有明显优化作用[45-46]。近年来，由于氧化钛纳米管层具有良好的促进成骨作用，所以在骨科和牙科被广泛使用。有研究显示，固定RGD之后的氧化钛纳米管层在4 h的骨髓间充质干细胞黏附数目明显升高，成骨细胞的基因表达显著增强[46]。成骨细胞及其前体细胞骨髓间充质干细胞在种植体表面的附着、增殖、分化是种植体骨整合的关键。骨与种植体融合的基本过程是：首先，体液中的骨基质蛋白吸附于种植体表面，以蛋白为媒介，成骨细胞随后附着于植入材料的表面进行贴壁、铺展，生长分化，从而形成新生骨组织[47]。在这个过程中，成骨细胞对材料表面的附着和铺展是植入材料与骨组织融合的关键，也是材料表面形成新骨的前提条件和基础。评价种植体的生物相容性和生物活性，必然要看它能否主动诱导成骨细胞在其表面附着。生物材料工程研究发现，在植入的生物材料表面构建RGD多肽可诱导成骨细胞整合素基因的表达，促进成骨细胞黏附于材料表面并分化成熟，促进骨形成[48]。成骨细胞通过与多种骨基质蛋白结合后分化成为骨细胞来完成骨形成过程。而在这个过程中，成骨细胞和骨基质蛋白的结合能力与其表面整合素的表达水平密切相关。所以，生物材料表面构建RGD多肽可通过提高细胞表面与基质蛋白结合的整合素含量来增强骨重建。在长期应用糖皮质激素的骨质疏松患者中发现成骨细胞整合素αvβ3、αvβ5的表达有所下降[49]，抑制成骨细胞与基质蛋白的黏附，影响成骨细胞功能。那么通过构建RGD多肽的方法可以可逆性地恢复成骨细胞表面相关整合素的表达，弥补骨质疏松时成骨细胞下降的生物学行为，在一定程度上提高细胞的黏附、增殖及分化功能。破骨细胞对骨吸收起主导作用，其骨吸收活动包括移行、聚集和黏附于骨基质表面。骨基质中的骨桥蛋白、纤维粘连蛋白和玻璃粘连蛋白通过RGD序列与破骨细胞表面的整合素αvβ3结合，介导这种黏附过程。抗αvβ3抗体可以阻断破骨细胞的黏附。因此，αvβ3抗体、RGD多肽及模拟RGD序列的化学合成物可望成为抵抗骨吸收的有效手段。由于是RGD序列在功能上介导了细胞的黏附和基质的矿化，近年来，不断有新合成的模拟RGD序列的小分子化合物被报道，可有效预防和治疗骨质疏松，这为骨质疏松治疗开辟了新的方向。蝰蛇毒素是含49个氨基酸残基的多肽，属 RGD 序列家簇。研究发现蝰蛇毒素与整合素αvβ3有高度亲和力，通过竞争性地结合αvβ3抑制αvβ3与玻璃粘连蛋白的结合，并且还可引起破骨细胞皱缩，直接抑制骨吸收。"

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