2.1 组织工程化半月板的种子细胞来源 半月板的结构属于纤维软骨，有别于一般的关节透明软骨，主要由纤维软骨细胞、基质和胶原构成，在生物学性质上有其特殊性。目前，组织工程化半月板种子细胞的主要来源有半月板纤维软骨细胞和骨髓间充质干细胞。   半月板纤维软骨细胞：叶川等[23]研究有胚半月板细胞的优化获取及生物学特性，在胰酶消化的基础上采用胶原酶阶段消化法消化解离8个月人胚半月板中的纤维软骨细胞，并与胶原酶一次消化法所得的细胞进行对比，同时进行原代培养和传代培养，观察细胞存活率、生长曲线、形态学改变、细胞周期并进行酸性糖胺多糖染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定。胶原酶阶段消化法所得细胞的存活率高于一次消化法；原代细胞贴壁时间和潜伏期较传代细胞长；半月板纤维软骨细胞在体外培养至第4代时会发生去分化现象。半月板采用胶原酶阶段消化法可减少酶对细胞的毒性，得到细胞活力较高的纤维软骨细胞，原代细胞贴壁时间和潜伏期较长，第二三代细胞适于作为组织工程用种子细胞。   骨髓间充质干细胞：骨髓间充质干细胞具有繁殖能力强的特点，可在体外培养30代以上，而且取材方便。解大龙等[24]对半月板软骨进行脱细胞处理，制备猪脱细胞半月板支架，并与传至第3代的骨髓基质干细胞进行培养。干细胞无血清培养液出现1条负染条带，即基质金属蛋白酶2带，证明培养的骨髓基质干细胞有侵袭性，可以与支架材料结合和生长良好。苏木精伊红染色见脱细胞半月板软骨内无细胞成分，基质间空隙较大，相互连接成网状结构。改良MASSON法染色见脱细胞后半月板软骨基质为绿染，证明留存有大量胶原。电镜下见脱细胞半月板软骨支架的孔隙大，孔隙壁不光滑，孔隙直径20-200 μm，孔隙率为80%以上，且孔隙和孔隙之间相互连通，形成三维网架结构。半月板支架与骨髓基质干细胞结合良好，且伸出伪足，分泌蛋白。徐青镭等[25]将已分离并经体外传代培养扩增的兔骨髓间充质干细胞在用碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1协同刺激后，用逆转录-聚合酶链式反应的方法探明有pC-I的编码基因表达，证明其已经进入软骨细胞分化谱系。碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1协同刺激骨髓间充质干细胞的体外增殖，并且使其进入软骨细胞分化谱系，为半月板组织工程重建提供可靠的自体来源种子细胞。   2.2 组织工程化半月板的支架材料来源 半月板支架材料是组织工程化半月板研究的基本要素，也是目前研究的热点问题。其中包括天然生物材料、人工合成生物材料和复合生物材料的研究，近年来组织工程化半月板支架材料的研究取得了可喜的进展，胶原半月板移植物已经开始应用于临床，由于含水量高，结构与体内细胞外基质类似，具有良好的生物相容性。同时，复合支架材料也是组织工程半月板支架材料研究的重点。   天然生物材料：骨膜、软骨膜、小肠黏膜下层、异体半月板组织等，以及分离合成的天然支架材料如胶原、纤维蛋白等，都是组织工程化半月板的天然材料。   小肠黏膜下层是天然的细胞外基质材料，同时自身含有多种生长因子，对组织修复重建和细胞生长有重要作用，生物相容性良好，目前已用于构建多种组织工程支架材料，如血管、神经、骨、软骨、肌腱、韧带等组织。赵玉鑫等[26]研究小肠黏膜下层作为组织工程化半月板支架材料的可行性，将猪的小肠通过物理的方法处理后，在100 mmol/L乙二胺四乙酸和   10 mmol/L氢氧化钠浓度中浸泡6-8 h，去离子水冲洗后置于1 mmol/L盐酸和1 mmol/L氯化钠溶液中浸泡6-8 h，冲洗后在 1 mmol/L氯化钠磷酸盐缓冲液中浸泡16 h，磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中浸泡 2 h，去离子水冲洗基质2 h，含1 g/L过氧乙酸的体积分数为0.2的乙醇溶液中浸泡8 h，用含0.5 g/L 过氧化钠的磷酸盐缓冲液清洗 2 h，程序性降温到-80 ℃，冻干后真空包装，γ射线辐照。将小肠黏膜下层在体外复合传至第3代的半月板纤维软骨细胞，在复合培养第1-4天观察细胞增殖不明显，第5天有较多细胞直接贴附于材料边缘，第7天有大量细胞向材料边缘聚集，细胞形态多为梭形或多角形，连成一片。半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层复合培养7 d可见细胞间通过突起相互连接附着在材料表面，细胞在小肠黏膜下层支架材料上生长、黏附、增殖良好，并分泌大量的细胞外基质成分。   人工合成材料：由于人工合成支架材料的几何形态、孔架结构、机械力学性能和力学强度等是可以调节至合适的大小，目前常用的人工合成材料有聚乳酸、聚羟基乙酸以及聚乳酸-羟基乙酸共聚物。   外消旋聚丙交酯是聚乳酸同分异构体的一种，通过水解氧化参与三羧酸循环，降解为二氧化碳和水。叶川等[27]应用外消旋聚丙交酯作为组织工程化半月板的支架材料，采用胶原酶阶段消化法获取人胚半月板纤维软骨细胞，碱性成纤维细胞生长因子作用于第3代细胞，并用四唑盐比色法得出最佳效应浓度，扩增后的细胞种植于多聚赖氨酸修饰前、后的外消旋聚丙交酯上，观察外消旋聚丙交酯的亲水性、细胞吸附性和细胞增殖情况。碱性成纤维细胞生长因子扩增人胚半月板细胞的最佳效应浓度为50 μg/L(P < 0.05)；外消旋聚丙交酯亲水性及细胞吸附性欠佳，予多聚赖氨酸修饰后明显改善，细胞在外消旋聚丙交酯上生长良好，3周时已有大量细胞生长。50 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子可用于体外大量扩增人胚半月板细胞，外消旋聚丙交酯经多聚赖氨酸修饰后可表现出良好的亲水性、细胞吸附性和体外生物相容性，可作为半月板组织工程细胞培养支架材料应用。   复合材料：胶原涂层的聚羟基丁酸羟基戊酸酯是聚羟基丁酸与羟基戊酸的共聚物，聚羟基丁酸是原核微生物在碳、氮营养失衡的情况下，作为碳源和能量储存而合成的热塑性聚酯，聚羟基丁酸具有良好的机械性能和组织相容性，而且由生物合成，无毒副作用，同时还具有质轻、耐腐蚀、可塑性强、生物可降解等优良特性。聚羟基丁酸通过与羟基戊酸形成共聚物聚羟基丁酸羟基戊酸酯，随着羟基戊酸比例的增高，聚羟基丁酸羟基戊酸酯的强度和韧性得以提高，而且更易被降解。卢华定等[28]观察Ⅰ型胶原涂层的聚羟基丁酸羟基戊酸酯对半月板纤维软骨细胞的吸附作用，评价其作为组织工程化半月板支架材料的可行性。制备Ⅰ型胶原涂层的聚羟基丁酸羟基戊酸酯组织工程化半月板假体，体外分离培养兔半月板纤维软骨细胞，将培养的半月板纤维软骨细胞接种于Ⅰ型胶原涂层的聚羟基丁酸羟基戊酸酯支架。聚羟基丁酸羟基戊酸酯能制成具有一定力学强度的半月板假体，通过Ⅰ型胶原涂层后增强了其细胞吸附能力，半月板纤维软骨细胞在支架孔壁贴附良好，维持表型稳定，分泌胞外基质。Ⅰ型胶原涂层的聚羟基丁酸羟基戊酸酯支架细胞相容性良好，能按半月板的大小、形状制成有一定力学强度的半月板假体，是比较理想的半月板组织工程支架材料。   最近在组织工程化半月板支架材料的结构研究中发现，可以通过三维纤维沉积技术来改变支架结构、孔隙率和共聚体的沉积，这样的支架材料可以更好模拟组织的生物力学性能。随着分子生物学与生物材料学的发展，更多的半月板支架材料会不断被研发出来，可以促进组织工程化半月板早日应用于临床。   2.3   构建组织工程化半月板细胞因子的作用 转化生长因子β1：可以起到调节细胞生长和分化的作用。刘和风等[29]研究蚕丝蛋白纤维(丝素)-胶原复合半月板支架作为兔纤维软骨细胞组织工程支架的可行性，将体外培养扩增的兔半月板纤维软骨细胞接种于该支架上，加入转化生长因子β1三维立体培养，丝素-胶原复合物能制成理想形状和大小的三维立体多孔半月板支架，纤维软骨细胞能良好的贴附于支架孔壁上。   碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1和胰岛素样生长因子1：叶川等[20]研究碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1单独或联合作用于人胚半月板细胞，探讨组织工程化半月板种子细胞大量扩增最佳作用组合及浓度。体外分离培养半月板纤维软骨细胞，用Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Aggrecan免疫荧光染色检测其性状。取第3代细胞贴壁后使用血清饥饿法同步化细胞，加入3种细胞因子作用于半月板细胞，每样本设8个复孔和阴性对照组，作用48，72 h采用四唑盐比色法检测软骨细胞增殖情况。同法设定7个组，每组8个复孔，分别为阴性对照组、碱性成纤维细胞生长因子最佳效应浓度组(50 μg/L)、转化生长因子β1最佳效应浓度组(5 μg/L)、胰岛素样生长因子1最佳效应浓度组 (50 μg/L)、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1最佳效应浓度联用组、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子1最佳效应浓度联用组、转化生长因子β1和胰岛素样生长因子1最佳效应浓度联用组，48，72 h用四唑盐比色法得出吸光度(A)值并分析软骨细胞的增殖效应。3种细胞因子最佳效应浓度单纯及联合运用对人胚半月板细胞增殖的比较，见表2。"