Kartogenin对大鼠和兔源骨髓间充质干细胞成软骨与成骨分化的差异性影响

doi:10.12307/2025.568

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (35): 7490-7498.doi: 10.12307/2025.568

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Kartogenin对大鼠和兔源骨髓间充质干细胞成软骨与成骨分化的差异性影响

柳承源1，2，过倩萍1，2

1苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215000；2苏州大学苏州医学院骨科研究所，江苏省苏州市 215000

收稿日期:2024-09-10 接受日期:2024-11-22 出版日期:2025-12-18 发布日期:2025-04-30
通讯作者: 过倩萍，硕士，副研究员，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215000；苏州大学苏州医学院骨科研究所，江苏省苏州市 215000
作者简介:柳承源，男，1998年生，浙江省金华市人，汉族，硕士，主要从事干细胞、组织工程和再生医学研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82072424)，项目负责人：过倩萍

Differential effects of kartogenin on chondrogenic and osteogenic differentiation of rat and rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

Liu Chengyuan1, 2, Guo Qianping1, 2

1Department of Orthopedic Surgery, First Affiliated Hospital, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; 2Orthopedic Institute, Suzhou Medical College, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China

Received:2024-09-10 Accepted:2024-11-22 Online:2025-12-18 Published:2025-04-30
Contact: Guo Qianping, MS, Associate researcher, Department of Orthopedic Surgery, First Affiliated Hospital, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; Orthopedic Institute, Suzhou Medical College, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
About author:Liu Chengyuan, MS, Department of Orthopedic Surgery, First Affiliated Hospital, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; Orthopedic Institute, Suzhou Medical College, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82072424 (to GQP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Kartogenin：是一种脂溶性的生物活性小分子，能够激活SOX9等转录因子促进软骨特异性基因的表达，从而促进软骨细胞的增殖和分化。
骨髓间充质干细胞：是存在于骨髓中的一种多能干细胞，具有自我更新和多向分化能力，能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多种细胞类型，因此在骨组织修复和再生医学中发挥着关键作用。

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜力，是软骨和骨组织再生研究中的重要细胞来源。Kartogenin(KGN)是一种小分子药物，已被证明能够促进干细胞成软骨分化，但促成骨分化能力仍存在争议，而且KGN对不同种属干细胞成软骨、成骨分化的具体作用仍未得到充分阐述。
目的：探讨KGN对兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞成软骨和成骨分化的影响。
方法：通过全骨髓分离贴壁法获得兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞，分别用不同浓度KGN进行处理，采用CCK-8法检测细胞增殖情况，采用甲苯胺蓝和茜素红染色评估成软骨和成骨分化情况。筛选出合适浓度的KGN后，使用碱性磷酸酶染色、qRT-PCR分析和Western blot分析成骨、成软骨相关基因和蛋白的表达。
结果与结论：①在0-10 000 nmol/L范围内，KGN对兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞的增殖没有显著影响；②KGN对兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞的分化效果却表现出显著差异，在兔源骨髓间充质干细胞中，KGN主要促进成软骨分化，同时抑制成骨分化，具体表现为甲苯胺蓝染色呈阳性，而碱性磷酸酶染色和茜素红染色没有明显变化，qRT-PCR分析显示KGN上调了成软骨相关基因(如Col2a1 和 Sox9)的表达，并下调了成骨相关基因(如Alpl、Col1a1、Runx2和Bglap)的表达，Western blot实验也有相似的结果；③相比之下，在大鼠源骨髓间充质干细胞中，KGN同时促进了成软骨和成骨分化，尽管甲苯胺蓝染色变化不明显，但碱性磷酸酶染色和茜素红染色阳性率显著增加，表明成骨分化增强，qRT-PCR分析显示KGN上调了成软骨相关基因(如Col2a1和Sox9)的表达，同时上调了成骨相关基因(如Alpl、Col1a1、Runx2和Bglap)的表达，Western blot实验也有相似的结果。这些结果表明，KGN在兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞中的分化调控作用存在明显差异，可能与两种细胞中的基因表达模式和信号通路不同有关。

https://orcid.org/0009-0008-1331-4777 (柳承源)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, Kartogenin, 成软骨分化, 成骨分化, 基因表达, 细胞增殖, 再生医学, 工程化干细胞

Abstract: BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells possess multipotent differentiation potential and are an important source of cells for cartilage and bone tissue regeneration research. Kartogenin is a small-molecule drug that has been demonstrated to promote stem cell differentiation towards chondrogenesis. However, the ability to promote osteogenic differentiation is still controversial, and the specific effects of kartogenin on the chondrogenic and osteogenic differentiation of stem cells of different species have not been fully elucidated.
OBJECTIVE: To investigate the effects of kartogenin on chondrogenic and osteogenic differentiation in rabbit-derived and rat-derived bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Rabbit-derived and rat-derived bone marrow mesenchymal stem cells were obtained through whole bone marrow separation and adherence methods, and were treated with varying concentrations of kartogenin. Cell proliferation was detected using the CCK-8 assay. Chondrogenic and osteogenic differentiation was assessed via toluidine blue and alizarin red staining, respectively. After screening for the optimal concentration of kartogenin, alkaline phosphatase staining, qRT-PCR, and western blot assay were employed to analyze the expression of osteogenic and chondrogenic-related genes and proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Within the concentration range of 0 to 10 000 nmol/L, kartogenin did not significantly affect the proliferation of rabbit-derived or mouse-derived bone marrow mesenchymal stem cells. (2) The differentiation effect of kartogenin on rabbit-derived and rat-derived bone marrow mesenchymal stem cells showed significant differences. In rabbit-derived bone marrow mesenchymal stem cells, kartogenin predominantly promoted chondrogenic differentiation while inhibiting osteogenic differentiation. This was evident from positive toluidine blue staining, whereas alkaline phosphatase and alizarin red staining exhibited no significant changes. qRT-PCR analysis revealed upregulation of chondrogenic-related genes (Col2a1 and Sox9) and downregulation of genes associated with osteogenesis (Alpl, Col1a1, Runx2, and Bglap). Similar results were found in the western blot assay. (3) In contrast, kartogenin in mouse-derived bone marrow mesenchymal stem cells promoted both chondrogenic and osteogenic differentiation. While toluidine blue staining remained largely unchanged, alkaline phosphatase and alizarin red staining revealed increased positivity, indicative of enhanced osteogenesis. qRT-PCR analysis showed upregulation of not only chondrogenic-related genes (Col2a1 and Sox9) but also genes linked to osteogenesis (Alpl, Col1a1, Runx2, and Bglap). The western blot assay results showed similar results. These findings suggest that kartogenin exerts differential regulatory effects on the differentiation of rabbit and rat bone marrow mesenchymal stem cells, potentially stemming from variations in gene expression profiles and underlying signaling pathways.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cell, kartogenin, chondrogenic differentiation, osteogenic differentiation, gene expression, cell proliferation, regenerative medicine, engineered stem cell

中图分类号:

柳承源, 过倩萍. Kartogenin对大鼠和兔源骨髓间充质干细胞成软骨与成骨分化的差异性影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7490-7498.

Liu Chengyuan, Guo Qianping. Differential effects of kartogenin on chondrogenic and osteogenic differentiation of rat and rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(35): 7490-7498.

图/表（结果） 8

2.1 骨髓间充质干细胞的形态和流式分析结果采用全骨髓分离贴壁法分离并培养兔和大鼠源骨髓间充质干细胞，培养5 d后，可以观察到细胞形态非常相似，兔源骨髓间充质干细胞为长梭形，大鼠源骨髓间充质干细胞为梭形，两者都表现出强烈的贴壁生长特性。此外，细胞核较大，呈椭圆形或圆形，核仁清晰可见，显示出明显的干细胞特征，见图1A，B。为了验证培养的骨髓间充质干细胞的纯度，流式细胞仪检测结果显示，第2代兔源骨髓间充质干细胞高表达特异性表面抗原CD90和CD29，阳性率分别达到95.3%和92.1%；同时，这些细胞低表达或不表达骨髓成纤维细胞、造血干细胞表面抗原CD45和CD34，阳性率分别为1.92%和5.22%。同样，鼠源骨髓间充质干细胞也高表达CD90和CD29，阳性率分别为95.6%和94.9%，而CD45和CD34低表达或不表达，阳性率分别为1.18%和7.91%，见图1C，D。
2.2 KGN对细胞增殖的影响采用CCK-8法评估不同浓度KGN(0，100，1 000，10 000 nmol/L)对兔和大鼠源骨髓间充质干细胞增殖的影响。培养1，3，5，7 d后，各组之间的细胞增殖数量无显著统计学差异，这表明在0-10 000 nmol/L的浓度范围内，KGN对两种骨髓间充质干细胞的增殖均无明显影响，见图2。
2.3 不同浓度KGN对兔源骨髓间充质干细胞成骨和成软骨分化的影响通过甲苯胺蓝染色和茜素红染色来表征细胞的成软骨和成骨分化情况，见图3。在甲苯胺蓝染色图像中，细胞形态为长梭形，无明显聚集现象，KGN处理组的细胞核呈深蓝色，胞质为浅蓝色。其中，10 000 nmol/L KGN组染色极为明显，表现出最显著的促成软骨分化效果。在茜素红染色图像中，各组细胞均未着色，未观察到钙结节的沉积，表明在这些条件下未出现明显的成骨分化。
2.4 不同浓度KGN对大鼠源骨髓间充质干细胞成骨和成软骨分化的影响由图4可见，在甲苯胺蓝染色图像中，大鼠源骨髓间充质干细胞形态为梭形，具有明显的聚集现象，形成软骨小节。低浓度KGN对细胞聚集没有明显影响，但

10 000 nmol/L KGN有效促进大鼠骨髓间充质干细胞形成更大的细胞聚集体，细胞着色更深，着色范围更广，说明其成软骨效果最佳。在茜素红染色图像中，各组聚集的细胞上均有一定的钙结节沉积，其中10 000 nmol/L KGN组钙结节体积最大、数量最多，说明成骨效果最佳。

2.5 KGN在早期对兔和大鼠源骨髓间充质干细胞成骨的影响因10 000 nmol/L KGN对兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞的成骨分化具有不同的调控效果，进一步使用含10 000 nmol/L KGN的培养基对兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞培养1周，通过碱性磷酸酶染色和定量分析KGN对不同种属骨髓间充质干细胞成骨早期的影响。兔源骨髓间充质干细胞对照组中碱性磷酸酶染色较弱，经KGN处理后碱性磷酸酶阳性染色进一步减弱，定量分析结果也显示出相同的趋势，见图5A，B。然而，在大鼠源骨髓间充质干细胞中，对照组表现出较强的碱性磷酸酶阳性染色，而经KGN处理后碱性磷酸酶阳性染色进一步增强，定量分析结果同样支持这一现象，见图5A，C。
2.6 KGN在晚期对兔和大鼠源骨髓间充质干细胞成骨的影响使用含10 000 nmol/L KGN的培养基对兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞培养3周，通过碱性磷酸酶染色和定量分析KGN对不同种属骨髓间充质干细胞成骨晚期的影响。兔源骨髓间充质干细胞的对照组和KGN组均表达碱性磷酸酶，但阳性率较低，且定量结果显示两组之间无显著性差异，见图6A，B。相反，在大鼠源骨髓间充质干细胞中，无论是对照组还是KGN组，碱性磷酸酶表达均较高，其中KGN组的阳性染色面积更大，定量结果显示碱性磷酸酶含量更高，见图6A，C。这些结果表明，与兔源骨髓间充质干细胞相比，大鼠源骨髓间充质干细胞本身表达更高的碱性磷酸酶，而在KGN作用下大鼠源骨髓间充质干细胞表现出更强的成骨潜能。
2.7 KGN对兔和大鼠源骨髓间充质干细胞的软骨诱导作用高密度微团(Micromass)法是一种高密度细胞培养系统，能够模拟软骨组织的细胞环境，促进细胞的自然聚集和分化，从而展示软骨细胞的特征。采用Micromass培养法进一步证实KGN的软骨诱导作用，将兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞置于含KGN的软骨诱导培养基中进行培养。经过1周的诱导处理后，番红染色结果显示，细胞中出现大量软骨细胞外基质的沉积，并伴随明显的细胞团聚现象，见图7。这些结果表明，KGN能够有效诱导兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞。
2.8 KGN对兔和大鼠源骨髓间充质干细胞成软骨/成骨分化基因和蛋白表达的影响由图8可见，qRT-PCR结果显示，在KGN处理的兔源骨髓间充质干细胞中，成软骨相关基因Col2a1和Sox9 的表达显著上调；同时成骨相关基因Alpl、Col1a1、Runx2和Bglap的表达水平降低或无显著变化。Western blot结果显示，KGN可以促进兔源骨髓间充质干细胞成软骨蛋白Ⅱ型胶原的表达上调，同时成骨相关蛋白Ⅰ型胶原的表达无明显变化。这些结果表明KGN在兔源骨髓间充质干细胞中主要促进软骨分化并抑制成骨分化。相反，在大鼠源骨髓间充质干细胞中，KGN上调了成软骨相关基因 Col2a1 和成软骨相关蛋白Ⅱ型胶原的表达，同时还显著上调了成骨相关基因 Alpl、Col1a1、Bglap和成骨相关蛋白Ⅰ型胶原的表达。这些结果表明，KGN在鼠源骨髓间充质干细胞中能同时促进成软骨和成骨分化。

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引言

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一类源自骨髓的多能干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种组织细胞[1-3]，还具有低免疫原性和免疫调节能力，在再生医学、组织工程及免疫治疗中具有重要的应用前景[4-8]。骨髓间充质干细胞的生物学特性在不同种属中可能存在显著差异[9-10]。例如，大鼠来源骨髓间充质干细胞在体外表现出良好的成骨和成软骨能力[11]，常用于软骨和骨的修复，在药物筛选和疾病机制研究中也显示出广泛的应用潜力[12-13]。有研究探讨不同种属干细胞对相同药物刺激的反应，发现这些细胞在分化方向上有显著差异[14]。尽管同一药物可能在不同种属干细胞中激活相似的信号传导通路，然而由于种属间基因表达谱的差异、微环境的变化以及其他物种特异性因素的影响，这些干细胞的分化潜力及最终的分化路径可能呈现出显著的异质性[15-17]。这一现象强调了在跨物种干细胞研究和药物筛选过程中，必须充分考虑种属差异对细胞命运决定的影响，以确保实验结果的可靠性与临床转化应用的严谨性。
Kartogenin(KGN)是一种小分子药物，近年来在促进骨髓间充质干细胞向软骨分化方面取得了显著进展[18-19]。KGN通过增强软骨发育关键转录因子SOX9的表达来促进软骨形成，从而在软骨组织工程中展现出较大的潜力[20-21]。尽管KGN在促进软骨分化方面的效果已得到广泛验证，但它在成骨分化中的作用仍存在争议[7，22]，KGN对不同种属骨髓间充质干细胞成软骨分化和成骨分化的具体作用仍未得到充分阐述。
该研究从大鼠和兔骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞，探讨KGN对兔和大鼠源骨髓间充质干细胞成软骨和成骨分化的调控效果，为KGN在组织工程和再生医学中的应用提供新的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2022年9月至2023年12月在苏州大学附属第一医院骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康雄性SD大鼠4只，6 周龄，体质量200-230 g；健康雄性新西兰大白兔4只，8月龄，体质量2.0-2.2 kg，用于提取骨髓间充质干细胞。动物均购于杭州启真实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK(浙) 2022-0005。
实验方案经苏州大学动物伦理委员会批准，审批号为SUDA20220711A02，实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 主要试剂与仪器戊巴比妥(上海麦克林生化科技股份有限公司，中国)；CCK-8试剂盒(苏州新赛美生物科技有限公司，中国)；甲苯胺蓝、KGN、二甲基亚砜(Sigma-Aldrich，美国)；0.25%胰酶、青霉素/链霉素双抗溶液、胎牛血清、F12培养基、α-MEM培养基(Gibco，美国)；流式抗体 CD34、CD45、CD29和CD90(Novus Biologicals，美国)；反转录试剂、荧光定量PCR试剂盒(Bio-Rad，美国)；Western blot一抗α-Tubulin、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原(Abcam，美国)；40 g/L多聚甲醛、PBS、茜素红S染色液、BCIP-NBT碱性磷酸酶显色液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、碱性磷酸酶检测试剂盒(上海碧云天生物技术股份有限公司，中国)；倒置显微镜(Nikon，日本)；全波长酶标仪(BioTek，美国)；qPCR仪器(Bio-Rad，美国)；CO2细胞培养箱、生物超净台、Nanodrop 2000光谱仪(Thermo Fisher Scientific，美国)；高速离心机(Eppendorf，德国)；培养皿、培养孔板(无锡耐思生命科技股份有限公司，中国)；RT Master Mix试剂盒(ABM，加拿大)；TRIzol(Invitrogen，美国)；SYBR Green Master(Bio-Rad，美国)；CFX96实时系统(Bio-Rad，美国)。

1.4 实验方法
1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养使用戊巴比妥麻醉后处死大鼠，在无菌条件下解剖取出双侧股骨和胫骨，将骨两端剪开后，用无菌注射器抽取10 mL预冷的完全培养基(含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的α-MEM培养基)冲洗骨髓腔，收集冲洗液，4 000 r/min离心5 min，去除上清，用完全培养基重悬细胞沉淀，接种于平底培养皿，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，每隔2 d换液1次，细胞融合度达到90%时，使用胰酶消化并传代，取生长状况良好的第2代细胞用于实验。在培养过程中使用倒置显微镜在明场下及时拍照观察。
1.4.2 兔骨髓间充质干细胞的分离培养使用戊巴比妥麻醉后处死新西兰兔，在无菌条件下解剖取出股骨和胫骨，将骨两端剪开后，用无菌注射器抽取10 mL预冷的完全培养基冲洗骨髓腔，收集冲洗液，4 000 r/min离心5 min，去除上清，用完全培养基重悬细胞沉淀，接种于平底培养皿，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，48 h后更换培养基以去除非贴壁细胞，随后每隔 2 d换液1次，细胞融合度达到90%时，使用胰酶消化并传代，取生长状况良好的第2代细胞用于实验。在培养过程中使用倒置显微镜在明场下及时拍照观察。
1.4.3 骨髓间充质干细胞的鉴定分别对第2代兔和大鼠源骨髓间充质干细胞进行离心(1 000 r/min，5 min)，弃去上清，用Buffer溶液重悬，确保细胞分散无团块，如有团块则静置3-5 min后弃去并重复直至细胞均匀，然后将细胞稀释至 5×109 L-1，取100 μL细胞悬液加入流式管，加入CD29、CD90、CD34和CD44 抗体后于4 ℃孵育30 min，加入2 mL Buffer 溶液重悬细胞并离心弃上清，再次重悬细胞后留细胞团，加入100 μL Buffer溶液重悬，随后避光加入对应二抗混匀后于4 ℃孵育30 min，再次离心弃上清，最后加入400 μL Buffer溶液轻轻吹打混匀，过滤后即可上机进行流式细胞术检测。
1.4.4 配制不同浓度的KGN培养基将KGN溶于二甲基亚砜配制KGN浓缩液，浓度为10 mmol/L，然后使用体积分数5%胎牛血清、1%双抗、F12基础培养基配制含不同浓度KGN的培养基(0，100，1 000，10 000 nmol/L)。
1.4.5 CCK-8法检测KGN对细胞增殖的影响将第2代兔和大鼠源骨髓间充质干细胞以5×103个/孔密度接种于96孔板中，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，更换成含有不同浓度KGN的F12完全培养基(0，100，1 000，10 000 nmol/L)，每组设置6个重复，继续培养1，3，5，7 d后，每孔更换为含有CCK-8试剂的培养基，在37 ℃避光孵育2 h，使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度值，以评估细胞的增殖活性。
1.4.6 KGN对细胞成软骨和成骨分化的影响将第2代兔和大鼠源骨髓间充质干细胞以1×104个/孔密度接种于24孔板中，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，更换成含有不同浓度KGN的F12完全培养基(0，100，1 000，10 000 nmol/L)，每组设置3个重复，培养3周后，通过甲苯胺蓝和茜素红染色考察KGN对细胞成软骨和成骨分化的影响。
(1)甲苯胺蓝染色：成软骨诱导3周，吸去培养基后使用PBS洗涤细胞3遍，然后用40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3遍，加入0.1%甲苯胺蓝染色液，在室温下染色15 min，用去离子水洗涤，最后通过倒置显微镜进行拍照观察。
(2)茜素红染色：成骨诱导3周，吸去培养基后使用PBS洗涤细胞3遍，然后用40 g/L多聚甲醛固定15 min，用去离子水洗涤3遍，加入茜素红S染色液，在室温下染色30 min，用去离子水洗涤，最后通过倒置显微镜进行拍照观察。
1.4.7 KGN的软骨诱导作用的验证采用高密度微团(Micromass)培养法验证KGN的软骨诱导作用。将第2代兔和大鼠源骨髓间充质干细胞消化成单细胞悬液，转移至离心管中，以1 000 r/min离心5 min，弃去上清，将细胞重悬至1×1011 L-1，然后取20 μL细胞悬液加入24孔板中，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中静置2 h以促进细胞贴壁。待细胞贴壁后，对照组加入不含KGN的成软骨诱导培养基(F12培养基、体积分数2%血清、1%青霉素-链霉素双抗混合液、100 nmol/L地塞米松、50 μg/mL 抗坏血酸、1 mmol/L丙酮酸钠、40 μg/mL脯氨酸、5 μg/mL ITS)，实验组加入含10 000 nmol/L KGN的成软骨诱导培养基，在相同培养条件下诱导培养1周，期间每2 d更换1次培养基。培养结束后，移除培养基，用PBS轻轻洗涤3遍，然后用40 g/L多聚甲醛固定15 min，再次用PBS洗涤3遍，加入0.1%番红染色液，室温下染色15 min，用去离子水洗涤，最后通过倒置显微镜进行拍照观察。
1.4.8 碱性磷酸酶染色及定量将第2代兔和大鼠源骨髓间充质干细胞分别以1×104个/孔密度接种于12孔板中，待细胞贴壁后，更换含10 000 nmol/L KGN的F12完全培养基，每组设置3个重复，培养1，3周后进行碱性磷酸酶染色和定量分析，具体方法：吸去培养基，用PBS洗涤3遍，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，再用PBS洗涤3遍，然后加入碱性磷酸酶染色试剂，在室温下避光孵育15-30 min，直至出现蓝色沉淀，染色完成后用PBS洗涤细胞，在显微镜下观察拍照。定量分析：吸去培养基，用PBS洗涤3遍，然后每孔加入50 μL RIPA裂解液，在冰上裂解20 min，将裂解液转移至EP管中，高速离心(12 000 r/min，1 min)以分离细胞碎片，获取上清液，随后利用BCA蛋白试剂盒对样品进行处理，在分光光度计上于562 nm处检测吸光度值，以确定蛋白浓度，根据碱性磷酸酶试剂盒步骤操作，使用分光光度计在405 nm处测定吸光度值，结合已知的蛋白浓度，计算碱性磷酸酶的活性。
1.4.9 qRT-PCR检测将第2代兔和大鼠源骨髓间充质干细胞分别以1×105个/孔密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，对照组使用不含KGN的完全培养基培养，实验组更换含10 000 nmol/L KGN的F12完全培养基，培养3周后，采用TRIzol提取RNA，并通过NanoDrop 2000分光光度计测量RNA浓度，用RT Master Mix试剂盒将RNA反转录为cDNA，在CFX96实时系统上进行qPCR，使用SYBR Green Master定量基因表达。反应条件为：95 ℃预变性30 s， 95 ℃变性5 s(40个循环)，60 ℃退火延伸30 s。熔解曲线从60-95 ℃用于确认引物特异性。引物序列见表1和表2，由Sangon Biotech(上海，中国)合成。每组进行3个生物学重复实验。目标基因的相对表达水平使用2-ΔΔCt方法计算，以Gapdh为内参标准化。

1.4.10 Western blot检测将第2代兔和大鼠源骨髓间充质干细胞分别以1×105个/孔密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，对照组使用不含KGN的完全培养基培养，实验组更换含10 000 nmol/L KGN的F12完全培养基，培养3周后，用RIPA(含有1×蛋白酶抑制剂和1×磷酸酶抑制剂)提取总蛋白。取等量的总蛋白加入1/4体积的蛋白上样缓冲液，100 ℃煮样5 min，使用10% SDS-PAGE分离蛋白后转移到NC膜上，用TBST配制的5%脱脂奶粉室温封闭2 h，4 ℃过夜孵育一抗Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及内参 α-Tubulin (稀释比例为1∶2 000)，第2天使用相应二抗(稀释比例为1∶4 000)室温孵育1 h，再用1×TBST缓冲液洗膜3次，滴加ECL发光液，通过凝胶成像仪器观察条带。每组进行3个生物学重复实验。
1.5 主要观察指标 ①兔和大鼠源骨髓间充质干细胞贴壁后的细胞形态和流式分析；②不同浓度KGN对兔和大鼠源骨髓间充质干细胞增殖的影响；③不同浓度KGN对兔和大鼠源骨髓间充质干细胞成骨和成软骨分化的影响；④10 000 nmol/L KGN处理后兔和大鼠源骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性；⑤采用高密度微团(Micromass)培养法验证KGN的软骨诱导作用；⑥10 000 nmol/L KGN处理后兔和大鼠源骨髓间充质干细胞中成软骨、成骨相关基因和蛋白表达水平。
1.6 统计学分析采用 GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，各项数据以均值±标准误表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用 t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过苏州大学生物统计学专家审核。

讨论

KGN是一种可以促进软骨分化并保护软骨细胞的小分子化合物[23]。有研究表明，KGN不仅能促进软骨再生，还能减少炎症反应，保护现有软骨细胞免受退化[11，24-25]，但它对不同种属的细胞是否有一致的调控作用尚未有报道。该研究发现在不同浓度的KGN处理下，兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞的增殖能力均未表现出显著差异，表明KGN在100-10 000 nmol/L浓度范围内对两种骨髓间充质干细胞的增殖无显著促进作用。然而，KGN能有效促进两种骨髓间充质干细胞成软骨分化，并在不同种属中表现出不同的效果：在兔源骨髓间充质干细胞中，KGN主要促进成软骨分化且抑制成骨分化；而在大鼠源骨髓间充质干细胞中，KGN 则能同时促进成软骨和成骨分化。早期实验显示，KGN对兔源骨髓间充质干细胞的成骨分化有抑制作用，而对大鼠源骨髓间充质干细胞则有促进作用，随着培养时间延长，KGN对大鼠源骨髓间充质干细胞的成骨分化促进效果进一步增强。在基因和蛋白表达层面，qRT-PCR和Western blot分析显示，KGN在兔源骨髓间充质干细胞中上调成软骨相关基因和蛋白的表达并抑制成骨相关基因和蛋白的表达；而在大鼠源骨髓间充质干细胞中，KGN能同时上调成软骨和成骨相关基因和蛋白的表达。这些结果表明，KGN在不同种属骨髓间充质干细胞分化中发挥不同的调控作用。
KGN对兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞的成骨和成软骨分化具有显著的种属差异性作用。在高浓度的 KGN作用下，兔源骨髓间充质干细胞更倾向于向软骨分化。KGN通过激活Sox9信号通路来促进软骨分化的效果在兔源骨髓间充质干细胞中表现得尤为明显，这可能是由于兔源骨髓间充质干细胞中Sox9信号通路的高活性或更强的响应能力，从而使得这些细胞更倾向于向软骨分化[26-27]。研究表明Sox9是软骨分化的主要调节因子，在软骨祖细胞中高表达并通过抑制肥大软骨细胞标志性基因(Col10a1)的表达维持软骨细胞的表型[28-30]。CAO等[31]已证明通过含有Sox9的腺病毒载体转导兔骨髓间充质干细胞来修复兔关节损伤，缺损处形成更多的软骨组织和透明软骨特异性细胞外基质，以及软骨形成标志基因表达更高。此外，在细胞分化过程中，成骨和成软骨分化路径往往互相竞争。KGN通过激活Sox9相关软骨分化路径同时可能会抑制成骨分化的Wnt/β-catenin信号通路的传导[10，32]，这种效应在兔源骨髓间充质干细胞中可能尤为明显，导致成骨相关标志物碱性磷酸酶和成骨基因(如Runx2和Col1a1)的表达下调[33-35]。
相反，在鼠源骨髓间充质干细胞中，成软骨相关基因(Col2a1)的表达提示成软骨分化，而碱性磷酸酶的高表达和成骨标志基因(Runx2等)上调则提示成骨分化，表明大鼠源骨髓间充质干细胞对KGN的响应更为多元化。虽然大鼠源骨髓间充质干细胞中软骨相关基因Sox9没有显著变化，但这一现象背后的机制可能涉及SOX9的多效性，它不仅推动软骨分化，也可能参与成骨基因的表达调控[36]，以及Wnt/β-catenin 信号通路的交互作用[8，37]。值得注意的是，对照组大鼠骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶表达量较高，这侧面说明了相较于兔源骨髓间充质干细胞，大鼠源骨髓间充质干细胞可能天然具有更高的成骨潜能，这种双重作用可能归因于大鼠源骨髓间充质干细胞中独特的内在细胞特性和信号转导分子的差异，导致KGN能够激活多条信号通路，从而同时促进成软骨和成骨分化，这些发现支持了KGN作为软骨分化诱导剂的潜在应用价值，并揭示了它在不同种属骨髓间充质干细胞中具有双重分化调控作用的可能性。KGN促进软骨分化的作用已在多项研究中得到验证。LIU等[20]制备了一种复合水凝胶CM-KGN@GelMA，其中含有转化生长因子β1类似物短肽细胞调节蛋白10和KGN，两者在体外通过上调Runx1、Sox9基因和蛋白的表达，对促进骨髓间充质干细胞成软骨分化具有协同作用。BAHARLOU HOUREH等[38]设计了一种壳聚糖/聚己内酯复合支架同时负载KGN，发现KGN偶联支架上有更多的COL2和SOX9阳性细胞；基因表达分析还显示，在KGN存在下，Sox9、Col2a1表达水平较高，而Col1a1表达下调。该研究首次揭示了KGN在大鼠源骨髓间充质干细胞中同时具有促进软骨和成骨分化的双重作用，拓展了对KGN功能的认识。YAN等[39]研究表明KGN通过提高自噬水平和上调Smad1/5/9信号来促进小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。该研究这一发现与YAN等[39]研究中提到的KGN对骨骼系统具有复杂影响的证据相一致。
该研究虽然揭示了KGN对兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞的不同分化调控作用，但仍存在局限性。首先，研究中使用的样本量相对较小，仅涉及兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞，这种样本量限制可能影响结果的普遍适用性，特别是在其他动物模型或人源细胞中的表现尚未得到验证。因此，未来研究需要包括更广泛的样本来源，以确认KGN作用的广泛适用性和有效性。其次，实验条件如KGN浓度和培养时间是基于先前研究和预实验设定的，但体外实验环境与体内环境可能存在差异，这意味着 KGN 的生物效应在体内可能与体外观察结果有所不同，可能影响KGN在实际临床应用中的效果。因此，进一步的体内研究和临床前试验是必要的，以评估KGN在实际生物环境中的表现。
在理论方面，该研究首次揭示了KGN在不同种属骨髓间充质干细胞中具有显著的分化调控作用差异，具体表现为对兔源骨髓间充质干细胞的成软骨分化促进作用和对大鼠源骨髓间充质干细胞的成软骨与成骨分化促进作用，这一发现拓展了对KGN作用机制的理解，特别是在不同种属细胞中的生物学效应差异，表明KGN可能通过不同的信号通路或分子机制调节细胞分化，提供了关于KGN作用的新见解。在实际应用方面，该研究为KGN在再生医学中的应用提供了新的方向和基础。通过优化KGN的使用条件，可能提高软骨再生的效率和质量，从而改善关节疾病患者的治疗效果[40]。另一方面，KGN在大鼠源骨髓间充质干细胞中同时促进成软骨和成骨分化，揭示了其作为多功能诱导剂的潜力，可能有助于开发综合治疗方案，以同时促进软骨和骨组织的修复。未来的研究可以基于这些发现，进一步探讨KGN在不同动物模型和临床样本中的作用，并评估在实际治疗中的效果。例如，进一步的体内实验和临床前研究可以帮助验证KGN在体内环境中的表现，优化其应用剂量和条件。此外，可以结合其他生物材料或生长因子，共同评估KGN在复杂再生医学应用中的综合效果[40-41]。通过这些研究，KGN可能成为未来治疗关节疾病和骨损伤的重要工具，为再生医学领域带来新的突破。
结论：该研究揭示了KGN对兔源和大鼠源骨髓间充质干细胞的不同分化作用。KGN在兔源骨髓间充质干细胞中主要促进成软骨分化，并抑制成骨分化，表现为成软骨基因Col2a1和Sox9的上调，而成骨基因Alpl、Col1a1、Runx2和Bglap的下调。相反，在大鼠源骨髓间充质干细胞中，KGN同时促进了成软骨和成骨分化，表现为成软骨基因Col2a1以及成骨基因Alpl、Col1a1、Runx2和Bglap显著上调。这些发现为理解KGN在不同种属骨髓间充质干细胞分化中的作用机制提供了新的视角，并可能对KGN在组织工程和再生医学中的应用具有重要的指导意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Kartogenin对大鼠和兔源骨髓间充质干细胞成软骨与成骨分化的差异性影响

Differential effects of kartogenin on chondrogenic and osteogenic differentiation of rat and rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

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