怀珍养肝胶囊对碘乙酸钠致膝骨关节炎模型小鼠的关节保护效应

doi:10.12307/2025.770

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (26): 5579-5587.doi: 10.12307/2025.770

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怀珍养肝胶囊对碘乙酸钠致膝骨关节炎模型小鼠的关节保护效应

孙海亮1，2，庞坚1，2，3，史万忠1，石瑛1，2，3

1上海中医药大学附属曙光医院，上海市 201203；2上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心，上海市 201203；3上海市中医药研究院骨伤科研究所，上海市 201203

收稿日期:2024-09-03 接受日期:2024-10-16 出版日期:2025-09-18 发布日期:2025-02-25
通讯作者: 史万忠，博士，主任药师，上海中医药大学附属曙光医院，上海市 201203 共同通讯作者：石瑛，硕士，博士生导师，主任医师，上海中医药大学附属曙光医院，上海市 201203；上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心，上海市 201203；上海市中医药研究院骨伤科研究所，上海市 201203
作者简介:孙海亮，男，1990年生，江苏省连云港市人，汉族，上海中医药大学附属曙光医院在读硕士研究生，主要从事骨与关节疾病研究。
基金资助:
上海市“科技创新行动计划”生物医药科技支撑专项(22S21900700)，项目负责人：史万忠；华东片区及市级中医专科筋骨病损专科联盟建设，项目负责人：石瑛

Protective effect of Huaizhen Yanggan Capsule on knee osteoarthritis induced by sodium iodoacetate in model mice

Sun Hailiang1, 2, Pang Jian1, 2, 3, Shi Wanzhong1, Shi Ying1, 2, 3

1Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 2Shi Traumatology Center, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 3Institute of Traumatology & Orthopedics, Shanghai Institute of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Received:2024-09-03 Accepted:2024-10-16 Online:2025-09-18 Published:2025-02-25
Contact: Shi Wanzhong, MD, Chief pharmacist, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China Co-corresponding author: Shi Ying, MS, Doctoral supervisor, Chief physician, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; Shi Traumatology Center, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; Institute of Traumatology & Orthopedics, Shanghai Institute of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
About author:Sun Hailiang, Master candidate, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; Shi Traumatology Center, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
Supported by:
Biomedical Science and Technology Support Project of Shanghai Science and Technology Innovation Action Plan, No. 22S21900700 (to SWZ); East China Region and Municipal Chinese Medicine Specialty Muscle and Bone Injury Specialty Alliance Construction (to SY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨体积分数：在Micro CT的扫描成像上选择感兴趣区域，对皮质骨和松质骨的各种形态学特性进行分析，得到表征骨骼生长和发育水平的参数，其中骨体积分数是皮质骨和松质骨骨量评价的常用指标，能够反映骨小梁骨量的多少，骨体积分数增高说明骨合成代谢大于分解代谢，骨量增加，反之亦然，从而能够间接反映骨代谢状况。
氧化应激：指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基产生过多，氧化程度超出氧化物的清除能力，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。

背景：前期研究显示怀珍养肝胶囊有较好的抗炎、镇痛和抗氧化等作用，但具体药效产生机制和对膝骨关节炎的治疗效果尚未做详细阐述。
目的：评价怀珍养肝胶囊的抗炎镇痛作用及其对膝骨关节炎模型小鼠的关节保护作用。
方法：①实验一：以二甲苯致小鼠耳郭肿胀实验评价怀珍养肝胶囊对小鼠的抗炎作用，ELISA法检测耳郭组织中白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平，苏木精-伊红染色观察抗炎小鼠耳郭组织形态。②实验二：以小鼠热板镇痛实验评价怀珍养肝胶囊对小鼠的镇痛作用，ELISA法检测小鼠血清中5-羟色胺、前列腺素E2、缓激肽和β内啡肽水平。③实验三：以注射碘乙酸钠膝骨关节炎模型小鼠研究怀珍养肝胶囊对膝骨关节炎的治疗作用，采用步幅分析评价镇痛效果，总抗氧化能力试剂盒检测血清中总抗氧化能力，Micro-CT扫描分析骨微结构及骨体积分数，苏木精-伊红与番红O-固绿染色观察关节软骨组织形态，改良Mankin’s评分评估关节软骨损伤程度，免疫组织化学染色检测关节软骨中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和Ⅱ型胶原的表达。
结果与结论：①实验一：与空白组比较，怀珍养肝胶囊能显著抑制小鼠耳郭肿胀度(P < 0.05)，降低耳郭组织肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平(P < 0.05)；②实验二：与空白组比较，怀珍养肝胶囊中、高剂量组能明显提高痛阈值(P < 0.05)，降低血清中5-羟色胺、前列腺素E2、缓激肽水平(P < 0.05)，升高β内啡肽水平(P < 0.05)；③实验三：与模型组相比，怀珍养肝胶囊组小鼠的步幅明显增大(P < 0.05)，血清总抗氧化能力显著升高(P < 0.05)，Micro-CT扫描显示软骨下骨破坏得到抑制，骨体积分数明显增加(P < 0.05)，苏木精-伊红染色与番红O-固绿染色观察到关节软骨表面较平整，改良Mankin’s评分明显下降(P < 0.05)，免疫组织化学染色观察到Ⅱ型胶原表达增加(P < 0.05)，白细胞介素6和肿瘤坏死因子α表达减少(P < 0.05)；④整体实验结果表明，怀珍养肝胶囊具有抗炎、镇痛和关节保护效应，可减轻膝骨关节炎模型小鼠疼痛，增强机体抗氧化能力，改善软骨组织形态和软骨下骨微结构，抑制骨关节炎进展。
https://orcid.org/0009-0008-9895-502X(孙海亮)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 怀珍养肝胶囊, 河蚌多糖提取物, 抗炎, 镇痛, 膝骨关节炎, 软骨, 软骨下骨, 抗氧化, Micro-CT, 工程化组织构建

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have shown that Huaizhen Yanggan Capsule has anti-inflammatory, analgesic, and antioxidant effects, but the mechanism of drug efficacy and whether it has therapeutic effects on knee osteoarthritis have not been elaborated.
OBJECTIVE: To evaluate the anti-inflammatory and analgesic effects of Huaizhen Yanggan Capsule and its protective effect on knee osteoarthritis model mice.
METHODS: (1) Experiment 1: The anti-inflammatory effect of Huaizhen Yanggan Capsule on mice was evaluated by ear swelling induced by xylene. The levels of interleukin-6 and tumor necrosis factor-α in ear tissues were detected by ELISA. The morphology of ear tissues of anti-inflammatory mice was observed by hematoxylin-eosin staining. (2) Experiment 2: The analgesic effect of Huaizhen Yanggan Capsule on mice was evaluated by hot plate analgesia experiment. The levels of 5-hydroxytryptamine, prostaglandin E2, bradykinin, and β-endorphin in serum of mice were detected by ELISA. (3) Experiment 3: The therapeutic effect of Huaizhen Yanggan Capsule on knee osteoarthritis was studied by injecting sodium iodoacetate into knee osteoarthritis model mice. The analgesic effect was evaluated by step analysis. The total antioxidant capacity kit was used to detect the total antioxidant capacity in serum. Micro-CT scan was used to analyze bone structure and bone volume fraction. The tissue morphology of articular cartilage was observed by hematoxylin-eosin staining and safranin O-fast green staining. The injury degree of articular cartilage was evaluated by modified Mankin’s score. The expression of tumor necrosis factor α, interleukin 6, and type II collagen in articular cartilage was detected by immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In experiment 1, compared with blank group, Huaizhen Yanggan Capsule group could significantly inhibit the degree of ear swelling (P < 0.05), and decrease the levels of tumor necrosis factor α and interleukin 6 in ear tissue (P < 0.05). (2) In experiment 2, compared with blank group, Huaizhen Yanggan Capsule medium and high dose groups could significantly increase the pain threshold (P < 0.05), decrease the levels of 5-hydroxytryptamine, prostaglandin E2, and bradykinin in serum (P < 0.05), and increase the level of β-endorphin (P < 0.05). (3) In experiment 3, compared with the model group, the stride length of mice was significantly increased (P < 0.05); the serum total antioxidant capacity was significantly increased (P < 0.05); the subchondral bone destruction was inhibited by Micro-CT scanning, and bone volume fraction was significantly increased (P < 0.05) in Huaizhen Yanggan Capsule group. The surface of articular cartilage was flat and the modified Mankin’s score was significantly decreased by hematoxylin-eosin and saffrane-O-solid green staining (P < 0.05). The expression of type II collagen was increased by immunohistochemical staining (P < 0.05), and the expression levels of interleukin 6 and tumor necrosis factor α were decreased (P < 0.05). (4) The results suggest that Huaizhen Yanggan Capsule may have anti-inflammatory, analgesic and joint protective effects. It can relieve the pain of knee osteoarthritis model mice, enhance the antioxidant capacity of the body, and improve the cartilage tissue morphology and the bone microstructure of subchondral bone, inhibiting the progression of osteoarthritis.

Key words: Huaizhen Yanggan Capsule, mussel polysaccharide extract, anti-inflammatory, analgesia, knee osteoarthritis, cartilage, subchondral bone, antioxygenation, micro-CT, engineered tissue construction

中图分类号:

孙海亮, 庞坚, 史万忠, 石瑛. 怀珍养肝胶囊对碘乙酸钠致膝骨关节炎模型小鼠的关节保护效应[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(26): 5579-5587.

Sun Hailiang, Pang Jian, Shi Wanzhong, Shi Ying. Protective effect of Huaizhen Yanggan Capsule on knee osteoarthritis induced by sodium iodoacetate in model mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(26): 5579-5587.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析 112 只小鼠全部进入结果分析，无脱失。
2.2 实验一结果
2.2.1 怀珍养肝胶囊对二甲苯致小鼠耳郭肿胀的影响与空白组相比，怀珍养肝胶囊低、中、高剂量组耳郭肿胀度和肿胀率显著降低(P < 0.05)，见表1。

2.2.2 怀珍养肝胶囊对耳郭组织病理改变的影响空白组小鼠左耳耳郭较为狭窄，血管及肌肉组织分层明显；空白组小鼠右耳耳郭血管及周围纤维组织出现明显的充血、水肿，横纹肌纤维排列紊乱，存在大量炎症细胞浸润；怀珍养肝胶囊干预后，低剂量组仍可见明显的组织水肿，周围血管充血，横纹肌纤维排列紊乱，炎症细胞浸润，但与空白组右耳比较有所好转。随着怀珍养肝胶囊剂量的增加，组织水肿及充血情况得到明显改善，横纹肌纤维排列恢复，炎性细胞浸润减少；塞来昔布组也存在少量充血水肿及炎性细胞浸润，见图1。
2.2.3 怀珍养肝胶囊对耳郭组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平的影响各组小鼠耳郭组织中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平，见表2。结果显示，与空白组相比，塞来昔布组和怀珍养肝胶囊各剂量组均可以显著减少耳郭组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的分泌，其中怀珍养肝胶囊中、高剂量组与空白组相比在统计学上有显著性差异(P < 0.05)。

2.3 实验二结果
2.3.1 怀珍养肝胶囊对小鼠热板痛阈值的影响与空白组比较，怀珍养肝胶囊中、高剂量组能延长小鼠首次出现舔后足的时间，提高痛阈值，在2.0 h和3.0 h痛阈值变化明显(P < 0.05)，见表3。

2.3.2 怀珍养肝胶囊对血清5-羟色胺、缓激肽、前列腺素E2和β内啡肽水平的影响与空白组相比，怀珍养肝胶囊中、高剂量组能明显降低小鼠血清中5-羟色胺、缓激肽、前列腺素E2水平，提高β内啡肽水平(P < 0.05)，见表4。

2.4 实验三结果
2.4.1 怀珍养肝胶囊对膝骨关节炎实验小鼠步幅的影响与空白组相比，模型组小鼠步幅显著减小(P < 0.05)；与模型组相比，怀珍养肝胶囊组小鼠步幅显著增大(P=0.018)；怀珍养肝胶囊组和空白组小鼠步幅差异不显著(P=0.037)，见图2。
2.4.2 怀珍养肝胶囊对膝骨关节炎实验小鼠抗氧化能力的影响与空白组相比，模型组总抗氧化能力显著下降(P=0.006)；与模型组相比，怀珍养肝胶囊组总抗氧化能力显著升高(P=0.010)，见图3。
2.4.3 怀珍养肝胶囊对膝骨关节炎实验小鼠感兴趣区松质骨和皮质骨结构及骨体积分数的影响膝关节Micro-CT 2D和3D重建图像，模型组感兴趣区的皮质骨排列致密，松质骨骨小梁排列错乱无规则，网状结构发生变化，关节腔有游离体，关节内侧有骨赘；与模型组比较，怀珍养肝胶囊组骨破坏得到缓解，骨赘形成得到抑制，见图4。
与空白组比较，模型组感兴趣区的松质骨骨体积分数明显降低(P=0.020)；与模型组比较，怀珍养肝胶囊组骨体积分数明显增加(P=0.045)，见图5。虽然怀珍养肝胶囊组感兴趣区皮质骨骨体积分数(87.60±0.86)%大于空白组(87.35±1.15)%，模型组(87.73±1.65)%大于怀珍养肝胶

囊组，但无统计学差异。
2.4.4 怀珍养肝胶囊对膝骨关节炎实验小鼠关节软骨形态的影响苏木精-伊红和番红O-固绿染色后关节软骨形态，见图6。图中A1-C1为股骨图像，A2-C2为胫骨图像。空白组(图6A1、A2)关节软骨表面光滑，结构完整，层次清晰，软骨细胞排列规则。与空白组相比，模型组(图6B1、B2)小鼠关节软骨存在明显破坏和裂隙，软骨表面不平整，软骨细胞数量明显减少且形态异常，软骨基质染色明显减少，蛋白多糖丢失较多，软骨纤维化增加；与模型组相比，怀珍养肝胶囊组(图6C1、C2)小鼠关节软骨表面较平整，软骨基质染色较好，蛋白多糖丢失较少；与空白组相比，怀珍养肝胶囊组小鼠关节软骨仍存在较明显的软骨细胞和基质破坏。
改良Mankin’s评分：空白组最低，怀珍养肝胶囊组次之，模型组最高，空白组与模型组相比差异有显著性

意义(P < 0.001)，模型组与怀珍养肝胶囊组相比差异有显著性意义(P < 0.001)，见图7。
2.4.5 怀珍养肝胶囊对膝骨关节炎实验小鼠关节软骨中Ⅱ型胶原、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达的影响与空白组相比，模型组关节软骨中Ⅱ型胶原表达减少(P=0.001)，肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达增多(P=0.002和P=0.010)；与模型组相比，怀珍养肝胶囊组关节软骨中Ⅱ型胶原表达增多(P=0.003)，肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达减少(P=0.005和P=0.049)，见图8，9。

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引言

膝骨关节炎是以退行性病理改变为基础的疾病，常见中于中老年人，表现为关节疼痛、僵硬和功能活动障碍，严重者可致残疾[1]，Kellgren-Lawrence(K-L)分级评估为Ⅱ-Ⅲ级的患者可进行保守治疗，包括中医中药[2-3]，临床就诊患者急需解决的问题是疼痛和功能障碍[4]。
膝骨关节炎的病理变化有透明关节软骨损伤、滑膜炎症、韧带改变、骨硬化和骨赘形成、半月板变性和髌内脂肪垫纤维化[5]。膝骨关节炎的病因尚不完全清楚[6]，但是炎症在骨关节炎发病中起着重要作用[7]。在分子水平上，骨关节炎的局部和全身促炎活性的改变可归因于肿瘤坏死因子α和白细胞介素6等含量变化[8]。骨关节炎发展过程中活性氧自由基也起着关键作用[9]，肿瘤坏死因子α和白细胞介素6可刺激线粒体产生活性氧进而导致关节软骨损伤[10]。
虽然局部应用非类固醇抗炎药和关节内糖皮质激素注射可以缓解疼痛，但由于禁忌证，其使用受到限制。对于补充治疗如软骨素或糖胺聚糖的有效性尚无共识[11]。中医中药治疗膝骨关节炎具有一定的优势，毒副作用少，疗效确切且安全可靠[12]。怀珍养肝胶囊(HZYGC)是上海中医药大学附属曙光医院院内中药制剂，临床上用于膝骨关节炎患者的治疗，成分为鲜河蚌肉中提取的河蚌多糖提取物。鲜河蚌肉具有清热滋阴、养肝凉血功效，怀珍养肝胶囊用于治膝骨关节炎早、中期，甚为恰当。研究报告显示河蚌多糖有较好的抗炎、镇痛和抗氧化等作用[13-15]，体外细胞实验发现怀珍养肝胶囊可降低软骨细胞β-连环蛋白和基质金属蛋白酶13基因的表达，对膝骨关节炎有潜在的治疗作用[16]，但对膝骨关节炎模型动物的具体药效和作用机制尚未做详细阐述。此次研究分别通过耳郭肿胀实验和热板法镇痛实验进一步观察其抗炎和镇痛作用，探讨怀珍养肝胶囊的药效和效应机制，进一步通过膝关节注射碘乙酸钠诱发膝骨关节炎小鼠模型，探索性研究怀珍养肝胶囊对膝骨关节炎模型小鼠的行为学和膝关节软骨、软骨下骨微结构的影响，为怀珍养肝胶囊新药研发和临床使用提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较用LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2024年1-5月在上海中医药大学附属曙光医院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物耳郭肿胀实验C57BL/6J小鼠50只，雄性，伦理编号：PZSHUTCM2401080011；热板法镇痛实验C57BL/6J小鼠50只，雌性，伦理编号：PZSHUTCM2403140008；膝骨关节炎治疗实验C57BL/6J小鼠12只，雄性，伦理编号：PZSHUTCM2311230003。小鼠均为SPF级，6周龄，体质量17-21 g，购于北京维通利华公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2021-0006。经上海中医药大学动物伦理委员会批准，由上海中医药大学实验动物中心饲养，实验动物使用许可证号：SYXK (沪)2020-0009。
1.3.2 药物及试剂怀珍养肝胶囊[批号：20240202，含总多糖79.93%(硫酸-蒽酮法)，蛋白质含量3.41%(Bradford法)]，上海中医药大学附属曙光医院制剂室自制；塞来昔布(批号：8156327)购自美国辉瑞制药有限公司；Ⅱ型胶原兔多克隆抗体(批号：1050102-11)购自英国Abcam公司；肿瘤坏死因子α兔多克隆抗体(批号：S98723060601)、白细胞介素6兔多克隆抗体(批号：AC240604039)均购自武汉塞维尔生物科技有限公司。
1.3.3 主要仪器 BIOTEK酶标仪购自美国博腾公司；LEICA RM2165全自动石蜡切片机、LEICA EG1150C包埋机均购自德国徕卡公司；布鲁克Skyscan1172高分辨率台式Micro-CT购自比利时SKYSCAN公司。
1.4 实验方法
1.4.1 实验一小鼠耳郭肿胀实验
(1)动物分组及给药：选用健康雄性小鼠，按体质量均衡原则随机分为5组，即空白组、塞来昔布组和怀珍养肝胶囊低、中、高剂量组。怀珍养肝胶囊低、中、高剂量组分别给予人临床等效剂量1/2，1，2倍的怀珍养肝胶囊[0.206，0.411，0.822 g/(kg·d)]灌胃给药，每只2 mL，每日1次，连续3 d，塞来昔布组给予人临床等效剂量的塞来昔布[0.041 mg/(kg·d)]灌胃给药，每只2 mL，每日1次，连续3 d，以上均按照成人体质量60 kg，小鼠等效剂量为成人12.3倍计算。空白组给予等体积的蒸馏水，每只2 mL，
每日1次，连续3 d。末次给药60 min后，将40 μL二甲苯涂于小鼠右耳郭两面致炎，致炎后30 min，麻醉后安乐处死小鼠，用直径6 mm打孔器分别在左右耳郭对称处取下耳片，分析天平称质量[17]。
(2)小鼠耳郭肿胀度测量：分析天平称耳片质量，以左右耳片质量差为其肿胀度并计算耳郭肿胀率[小鼠耳郭肿胀率(%)=(右耳片质量-左耳片质量)/左耳片质量×100%]和耳郭肿胀抑制率[小鼠耳郭肿胀抑制率(%)=(空白组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/空白组平均肿胀度×100%][18]。
(3)ELISA法检测小鼠耳郭组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平：取部分右耳郭，称质量，剪碎组织，加入PBS，制成组织匀浆，离心10 min(相对离心力5 000×g)，收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书步骤进行检测，酶标仪检测波长450 nm处的吸光度值，拟合标准曲线，计算各组小鼠耳郭组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平。
(4)苏木精-伊红染色观察小鼠耳郭组织形态：取各组剩余右耳片和空白组左耳片置于40 g/L多聚甲醛中固定、脱水、石蜡包埋，切成7 μm的薄片，进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察。
1.4.2 实验二热板法镇痛实验
(1)动物分组及给药：选用健康雌性小鼠，控制实验室温度为20 ℃，水浴锅中热板温度为(55.0±0.5) ℃，将1 000 mL烧杯放入其中，使烧杯底部接触水面。每次取小鼠1只，放入烧杯内。记录自放入烧杯至出现舔后足所需要时间，作为该鼠的痛阈值。凡30 s内不出现舔后足者，弃之不用。取预试合格的小鼠，分组方式同“1.4.1小鼠耳郭肿胀实验”，再测痛阈1次，将2次痛阈的平均值作为该鼠给药前的痛阈值。给药剂量和方法同“1.4.1小鼠耳郭肿胀实验”，每日1次，连续3 d。
(2)小鼠痛阈测量：末次给药后0.5，1.0，2.0，3.0 h测小鼠痛阈值[19]。
(3)ELISA法检测小鼠血清5-羟色胺、缓激肽、前列腺素E2和β内啡肽水平：末次痛阈值测定后，摘除小鼠眼球取血，静置1 h，离心20 min(相对离心力1 000×g)，按照ELISA试剂盒说明书步骤检测，使用酶标仪检测波长450 nm处的吸光度值，拟合标准曲线，计算血清中5-羟色胺、缓激肽、前列腺素E2和β内啡肽水平。
1.4.3 实验三怀珍养肝胶囊对膝骨关节炎小鼠的药效及作用机制研究
(1)动物分组及给药：膝关节腔注射碘乙酸钠致膝骨关节炎模型，常用于保守治疗药物药效及作用机制研究，符合 K-L分级Ⅱ-Ⅲ级的膝骨关节炎模型。选用健康雄性小鼠，按体质量均衡原则随机分为3组，即模型组、空白组、怀珍养肝胶囊组，每组4只。腹腔注射1%戊巴比妥钠0.1 mL麻醉，剃除左右膝关节部位毛发，用碘伏消毒右膝关节部位，模型组和怀珍养肝胶囊组于髌韧带附着点内上方约0.5 cm处进针，注入10 mg/mL碘乙酸钠10 μL，活动小鼠膝关节使碘乙酸钠充分分布在关节腔内，空白组注射生理盐水。注射过程严格按照无菌操作要求。麻醉苏醒后将小鼠放回笼内，保证充足食物饮水和活动空间。造模第2天，观察小鼠右膝关节出现明显肿胀。连续14 d驱赶小鼠，每天2 h。造模4周后，怀珍养肝胶囊组灌胃怀珍养肝胶囊[0.411 g/(kg·d)]，每只2 mL，每日1次，连续28 d，空白组和模型组小鼠灌胃蒸馏水，每只2 mL，每日1次，连续28 d[20-21]。

(2)小鼠步幅测量：末次给药后2 h，采用足印分析法测定并分析小鼠步幅(步道长50 cm，宽7 cm，步幅为两个连续足印之间的直线距离，测量中间3次步幅，取平均值为步幅值)[22]。
(3)小鼠血清中总抗氧化能力：末次给药后第2天，摘除眼球取血，静置1 h，然后离心20 min(相对离心力1 000×g)，取血清，按照总抗氧化能力试剂盒说明书步骤检测，使用酶标仪检测波长414 nm处的吸光度值，拟合标准曲线计算血清中总抗氧化能力。
(4)小鼠Micro-CT扫描：取右膝关节标本，剔除皮肤，去除膝关节周围软组织和韧带，将标本置于40 g/L多聚甲醛固定液中48 h，PBS冲洗后进行Micro-CT扫描，设置电压80 kV、电流124 μA、分辨率9.92 μm对小鼠膝关节进行扫描。胫骨近端生长板以上部分为感兴趣区，分别计算各组感兴趣区松质骨和皮质骨的骨体积分数。
(5)小鼠膝关节苏木精-伊红与番红O-固绿染色和改良Mankin’s评分：将Micro-CT扫描完成的标本置于10%EDTA液中，振荡脱钙4周，脱水、包埋、切成4 μm的薄片，进行苏木精-伊红染色和番红O-固绿染色，显微镜下观察，采集图像。参照改良Mankin’s评分标准[23]，根据软骨结构、软骨细胞、基质染色和潮线完整性，得出各组Mankin’s评分平均值。
(6)免疫组化检测小鼠膝关节软骨中Ⅱ型胶原、白细胞介素6与肿瘤坏死因子α表达：石蜡切片于60 ℃烤片机上烤30 min，二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水；加热的柠檬酸钠抗原修复液进行抗原修复20 min；PBS洗3次，每次5 min，免疫组化笔在组织周围画圈，体积分数3% H2O2滴到圈内消除内源性过氧化物酶活性室温15 min；PBS洗3次，每次5 min，体积分数10%山羊血清封闭1 h；抗Ⅱ型胶原(1∶200)、白细胞介素6 (1∶100)与肿瘤坏死因子α(1∶100)一抗4 ℃冰箱中孵育过夜；PBST洗3次，每次5 min，山羊抗兔IgG (1∶200)二抗室温孵育45 min；DAB显色，在显微镜下观察组织切片显色程度，出现浅棕色，立即放入PBS终止显色；苏木精复染、脱水、透明、封固。光学显微镜下对每张切片随机截取3个×400倍镜下的视野拍照，Image J 1.54 f软件对胫骨软骨中Ⅱ型胶原、白细胞介素6与肿瘤坏死因子α图像进行分析，测定Ⅱ型胶原阳性表达面积和白细胞介素6与肿瘤坏死因子α阳性细胞占比(阳性细胞数占细胞总数的百分比)。
1.5 主要观察指标
(1)实验一：①小鼠耳郭肿胀度、肿胀率和肿胀抑制率；②ELISA法检测耳郭组织中白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平；③苏木精-伊红染色观察小鼠耳郭组织形态。
(2)实验二：①小鼠用药前后痛阈值；②ELISA法检测小鼠血清中5-羟色胺、缓激肽、前列腺素E2和β内啡肽水平。
(3)实验三：①小鼠步幅；②血清中总抗氧化能力；③Micro CT观察小鼠膝关节骨结构；④苏木精-伊红染色、番红O固绿染色观察各组膝关节软骨组织病理形态；⑤免疫组化观察小鼠膝关节软骨Ⅱ型胶原、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，结果以 x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较用LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已由上海中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

3.1 膝骨关节炎与中医理论中医学认为，膝骨关节炎属“骨痹”“骨痿”范畴，机体随着天葵竭，形体衰，正气失盈，肝肾日渐不足，肾主骨，肝主筋，膝为筋之府，筋骨失养，腠理空虚，又感风寒湿邪浸淫，致经络阻痹，关节肿痛。此病属本虚标实、虚实夹杂之证[24]。鲜河蚌肉味甘咸，性微寒，入肝肾两经，中医认为甘能缓急止痛，咸寒可软坚散结、清热滋阴、消肿止痛，对膝关节炎可起标本兼顾的治疗效果。
3.2 怀珍养肝胶囊的抗炎和镇痛机制耳郭肿胀实验是评价药物抗炎药效的经典实验，致炎物质二甲苯涂于耳上使某些炎症递质如组胺、激肽和纤维蛋白溶解释放，引起毛细血管通透性增加，炎症细胞浸润，造成耳部急性渗出性炎症水肿[25]。一项研究显示河蚌多糖可能是通过机体调整炎症病灶生理变化或抑制致炎因子的产生而缓慢发挥作用的[26]。肿瘤坏死因子α、白细胞介素6与炎症严重程度有关[27-29]。耳郭肿胀实验结果显示，与空白组相比，连续3 d灌胃不同剂量怀珍养肝胶囊均能显著降低小鼠的耳肿胀度及肿胀率，提高肿胀抑制率。对怀珍养肝胶囊作用机制进一步研究发现，怀珍养肝胶囊不同剂量组均可降低耳郭组织中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平，病理结果显示怀珍养肝胶囊可抑制二甲苯诱导实验小鼠出现的组织充血、水肿、横纹肌纤维排列紊乱、炎性细胞浸润等炎症反应，药效具有剂量依赖性，提示怀珍养肝胶囊对二甲苯诱导的急性炎症具有一定抑制作用，可适用于炎症为主要病理改变的膝骨关节炎患者。
热板实验是常用评价药物镇痛药效的经典实验，炎症因子前列腺素E2可诱导外周和中枢疼痛[30-31]，5-羟色胺在中枢和外周疼痛的进展和调节中也起着至关重要的作用[32]，缓激肽是神经干细胞迁移和神经源性分化的重要调节因子，调节痛觉离子通道的表达[33]，β内啡肽是一种内源性阿片肽，具有强效镇痛作用，人体释放β内啡肽能力下降会导致血管活性物质增加，从而上调对疼痛的敏感性[34]。前列腺素E2、5-羟色胺、缓激肽和β内啡肽均是疼痛应激反应相关的标志性指标[35-36]，热板实验结果显示，与空白组相比，连续3 d灌胃怀珍养肝胶囊中、高剂量组均能显著提高小鼠痛阈值，并且在2 h后最明显。进一步研究发现，与空白组相比，怀珍养肝胶囊中、高剂量可以抑制血清中前列腺素E2、5-羟色胺、缓激肽释放，促进β内啡肽的表达，药效具有一定的剂量依赖性，提示怀珍养肝胶囊可能通过抑制致痛物质表达和促进镇痛物质表达双向调控机制达到镇痛效应，可治疗或缓解膝骨关节炎患者疼痛。
怀珍养肝胶囊能降低整个机体关节炎症病理反应和提高痛阈，进一步研究发现怀珍养肝胶囊可改善膝关节因疼痛引起的功能障碍，提高机体抗氧化能力，影响关节软骨细胞、基质成分、软骨组织形态和软骨下骨的骨微结构。
3.3 怀珍养肝胶囊对膝骨关节炎模型小鼠步幅的影响和抗氧化作用膝骨关节炎患者遭受疼痛会出现明显的步幅改变[23]，膝骨关节炎治疗实验中，与空白组相比，模型组小鼠步幅明显下降，与模型组相比，怀珍养肝胶囊干预后小鼠步幅明显上升，提示怀珍养肝胶囊可以改善膝骨关节炎模型小鼠因膝部疼痛引起的功能障碍；氧化应激反应可导致软骨细胞和细胞外基质严重受损，加速骨关节炎的进展[7]，与空白组相比，模型组血清中总抗氧化能力显著降低，与模型组相比，怀珍养肝胶囊组总抗氧化能力显著升高，这说明怀珍养肝胶囊干预能够提高机体的抗氧化能力，改善小鼠的氧化应激。
3.4 怀珍养肝胶囊对关节的保护作用 Micro-CT扫描可对全关节进行整体评估，2D和3D图像显示模型组软骨表面受到不同程度的损伤，软骨下骨的微结构遭到破坏，关节腔内甚至见游离体和形成的骨赘，怀珍养肝胶囊组以上损伤均有不同程度的改善；骨体积分数反映骨量的变化，与空白组相比，模型组骨量减少，与模型组相比，怀珍养肝胶囊组骨量增加。苏木精-伊红染色和番红O-固绿染色结果显示模型组软骨组织损伤，软骨细胞排列紊乱，软骨层变薄，甚至软骨层脱落，怀珍养肝胶囊组软骨组织形态较模型组有所恢复。Micro-CT与苏木精-伊红染色和番红O-固绿染色提示怀珍养肝胶囊可改善损伤软骨和软骨下骨微结构，抑制骨关节炎进展。
关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质组成，前期体外细胞实验发现怀珍养肝胶囊含药血清可降低软骨细胞β-catenin基因表达，抑制基质金属蛋白酶13基因表达，发挥对软骨细胞的保护作用[16]。软骨细胞是关节软骨中唯一负责细胞外基质生成的细胞类型[37]，细胞外基质退化也被认为与膝骨关节炎进展密切相关[38]，细胞外基质起支撑和稳定细胞外环境的作用，细胞外基质中的蛋白质大部分都属于胶原类，众多胶原中占比最大的是Ⅱ型胶原[39]。肿瘤坏死因子α和白细胞介素6是骨关节炎发展的主要促炎因子，可增强基质金属蛋白酶的表达，促进软骨细胞外基质降解[40]，诱导前列腺素的产生，抑制软骨中Ⅱ型胶原蛋白合成[41]。肿瘤坏死因子α和白细胞介素6还可促进软骨细胞分泌纤维蛋白溶酶，直接或间接诱导炎症反应[8]。怀珍养肝胶囊干预膝骨关节炎治疗实验中，通过免疫组织化学染色对软骨中炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6与细胞外基质Ⅱ型胶原定量检测，与空白组相比，模型组小鼠关节软骨中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达均显著增加，Ⅱ型胶原表达显著减少，说明膝骨关节炎模型小鼠关节软骨存在炎症反应状态和软骨基质成分改变，而与模型组相比，怀珍养肝胶囊组小鼠关节软骨中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达减少，Ⅱ型胶原表达增加，提示怀珍养肝胶囊可改善关节软骨细胞外基质的稳态，降低炎症反应，延缓膝骨关节炎进展。
综上所述，通过小鼠耳郭二甲苯致炎实验、热板法镇痛实验，较为系统地评价和分析了怀珍养肝胶囊抗炎镇痛作用及其作用机制，结果显示抗炎镇痛作用明显，且具有量效关系。在此基础上，探索性研究中剂量怀珍养肝胶囊治疗膝骨关节炎模型小鼠的作用，结果表明，怀珍养肝胶囊能减轻膝骨关节炎模型小鼠疼痛，增强机体抗氧化能力，改善软骨组织形态和软骨下骨微结构，对膝关节炎具有明显的关节保护效应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

怀珍养肝胶囊对碘乙酸钠致膝骨关节炎模型小鼠的关节保护效应

Protective effect of Huaizhen Yanggan Capsule on knee osteoarthritis induced by sodium iodoacetate in model mice

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