一种同时取硬脑膜及颈深淋巴结的实验方法

doi:10.12307/2025.732

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (26): 5543-5548.doi: 10.12307/2025.732

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一种同时取硬脑膜及颈深淋巴结的实验方法

谌子龙，吴铭杰，陈晓婧，周西彬，周春祥

南京中医药大学中医学院，江苏省南京市 210000

收稿日期:2024-08-05 接受日期:2024-09-11 出版日期:2025-09-18 发布日期:2025-02-21
通讯作者: 周春祥，博士，教授，博士生导师，南京中医药大学中医学院，江苏省南京市 210000
作者简介:谌子龙，男，1998年生，湖南省安化县人，汉族，南京中医药大学在读硕士，主要从事中枢神经系统疾病的中医药治疗研究。
基金资助:
国家中医药管理局高水平中医药重点学科建设项目资助(国中医药人教函〔2023〕85号)，项目负责人：周春祥；
国家自然科学基金面上项目(82074504)，项目负责人：周春祥；江苏省研究生科研与实践创新计划项目(KYCX24_2194)，项目负责人：谌子龙

An experimental method for simultaneously extracting the dura mater and deep cervical lymph nodes

Shen Zilong, Wu Mingjie, Chen Xiaojing, Zhou Xibin, Zhou Chunxiang

College of Traditional Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China

Received:2024-08-05 Accepted:2024-09-11 Online:2025-09-18 Published:2025-02-21
Contact: Zhou Chunxiang, PhD, Professor, Doctoral supervisor, School of Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China
About author:Shen Zilong, Master’s candidate, School of Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the High-Level Traditional Chinese Medicine Key Discipline Construction Project of the National Administration of Traditional Chinese Medicine, No. [2023]85 (to ZCX); National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 82074504 (to ZCX); Jiangsu Graduate Research and Practice Innovation Program, No. KYCX24_2194 (to SZL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脑膜淋巴管：是中枢神经系统中一个至关重要的结构，在维持大脑健康稳态方面发挥着重要作用，它是将脑脊液和间质液中的代谢废物，包括大分子物质如β-淀粉样蛋白，运送到颈部淋巴结进行清除的重要通道，其功能障碍与阿尔茨海默病的发生和发展密切相关。
小脑延髓池注射：又称枕大池注射，是医学研究与临床实践中一项广泛应用的技术，该技术通过将药物、示踪剂或其他治疗物质以特定方式注入小脑延髓池(即枕大池)内，以实现治疗、研究或诊断的多种目的。在针对阿尔茨海默病等神经退行性疾病的研究中，研究人员利用枕大池注射技术引入特定药物或干预物质，以深入探索其治疗潜力和作用机制，为疾病的治疗提供新的策略和方向。

背景：脑膜淋巴管可引流脑脊液和β-淀粉样蛋白，促进T淋巴细胞运输以及归巢至颈深淋巴结。简单快捷、步骤明确的硬脑膜分离方法以及颈深淋巴结的准确定位，可以为神经退行性疾病的研究提供有力的支持。
目的：建立一种便捷实用的硬脑膜及颈深淋巴结剥取方法。
方法：取3月龄ICR小鼠，麻醉后于枕大池注射埃文斯蓝和示踪剂进行颈深淋巴结定位，于锁骨上方约5 mm作长约3 cm的中线切口后，钝性分离浅脂肪和筋膜，牵拉侧胸锁乳突肌，暴露颈深淋巴结，在体式显微镜下摘取淋巴结，-80 ℃冻存；随后剪断小鼠颈部，分离头部皮肤肌肉暴露出完整颅骨结构，使用剪刀自枕骨大孔处沿顶骨下沿离断一周，分离颅骨和脑组织，获取完整的颅骨顶部。分别将取下来的颅骨顶部泡在40 g/L多聚甲醛24 h，120 g/L多聚甲醛固定24 h，120 g/L多聚甲醛固定10，20，30，40 min后，剥离硬脑膜结构。分别采用示踪剂对脑膜淋巴管、颈深淋巴引流能力进行验证，淋巴管内皮透明质酸受体1免疫荧光法鉴定脑膜淋巴管。
结果与结论：①小鼠注射埃文斯蓝15 min后于颈深淋巴结内观察到明显蓝染。②颅骨置于120 g/L多聚甲醛固定24 h，可使硬脑膜与颅骨的连接不再紧密，剥离硬脑膜结构更为容易，且形状完整；与传统40 g/L多聚甲醛相比，120 g/L多聚甲醛固定的硬脑膜更具韧性，剥离时更能保持完整；120 g/L多聚甲醛短时间固定取脑膜以30-40 min较佳。③颈深淋巴结冰冻切片有明显示踪剂存在，硬脑膜可见完整的脑膜淋巴管存在，淋巴管尾端可见示踪剂；颈深淋巴结及硬脑膜淋巴管的淋巴管内皮透明质酸受体1免疫荧光染色均阳性。④结果说明，120 g/L多聚甲醛固定24 h为较佳的剥离浓度与时间，该浓度下硬脑膜形态舒展、韧性较好，剥离后较完整，利于后期使用；埃文斯蓝定位及示踪剂和免疫荧光验证的颈深淋巴结位置准确，可作为研究各类神经退行性疾病的基础。
http://orcid.org/0009-0005-6032-2786(谌子龙)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 硬脑膜, 颈深淋巴结, 脑膜淋巴管, 脑淋巴引流, 阿尔茨海默, 神经退行性疾病, 工程化组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Meningeal lymphatic vessels can drain cerebral spinal fluid and amyloid β-protein, promoting T lymphocyte to transport and home to deep cervical lymph nodes. A simple, quick and definite method of dural separation and accurate localization of deep cervical lymph nodes can provide strong support for the study of neurodegenerative diseases.
OBJECTIVE: To establish a convenient and practical method for exfoliating dural and deep cervical lymph nodes.
METHODS: ICR mice, 3 months old, were taken, anesthetized and injected with Evans blue and tracer in the occipital pool for localizing deep cervical lymph nodes. A midline incision of about 3 cm in length was made about 5 mm above the clavicle, the superficial fat and fascia were bluntly separated, and the lateral sternocleidomastoid muscle was pulled to expose the deep cervical lymph nodes, which were removed under a stereomicroscope and frozen at -80°C. Subsequently, the mouse head was cut and the skin and muscles of the head were separated to expose the entire skull structure. The skull and brain tissue were separated from the foramen magnum along the lower parietal bone with scissors, and the complete skull top was obtained. The skull was sequentially fixed in 40 g/L paraformaldehyde solution for 24 hours, 120 g/L paraformaldehyde for 24 hours, and 120 g/L paraformaldehyde for 10, 20, 30, and 40 minutes, and the dural structure was stripped. The drainage capacity of meningeal lymphatic vessels and deep cervical lymphatic vessels was verified by tracer, and the meningeal lymphatic vessels were identified by the lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 using the immunofluorescence method.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Obvious blue staining was observed in deep cervical lymph nodes 15 minutes after Evans blue staining. (2) The skull was sampled and fixed in 120 g/L paraformaldehyde for 24 hours, resulting in a less tight connection between the dura mater and the skull, and easier stripping of the dural structures with an intact shape. The dura mater fixed at 120 g/L concentration was more resilient and remained more intact during peeling compared with the conventional 40 g/L concentration; 120 g/L paraformaldehyde fixed meninges for a short time, and 30-40 minutes was preferred. (3) The frozen section of deep cervical lymph nodes showed the presence of the tracer, complete meningeal lymphatic vessels were visible in the dura mater, and the tracer was observed at the tail of lymphatic vessels. Immunofluorescence staining for endothelial hyaluronan receptor 1 was positive in the deep cervical lymph nodes and dural lymphatics. In summary, the best peeling concentration and time is 120 g/L paraformaldehyde fixed for 24 hours. At this concentration, the dura mater has a stretched morphology, a better toughness, and is more intact after peeling, which is conducive to later use. Verified by Evans blue, tracers and immunofluorescence, deep cervical lymph nodes are located accurately, which can be used as a basis for the study of various neurodegenerative diseases.

Key words: dura mater, deep cervical lymph nodes, meningeal lymphatic vessels, cerebral lymphatic drainage, Alzheimer’s disease, neurodegenerative disease, engineered tissue construction

中图分类号:

谌子龙, 吴铭杰, 陈晓婧, 周西彬, 周春祥. 一种同时取硬脑膜及颈深淋巴结的实验方法[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(26): 5543-5548.

Shen Zilong, Wu Mingjie, Chen Xiaojing, Zhou Xibin, Zhou Chunxiang. An experimental method for simultaneously extracting the dura mater and deep cervical lymph nodes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(26): 5543-5548.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析实验选用ICR小鼠30只，全部进入结果分析。
2.2 颈深淋巴结定位把5 μL 10%埃文斯蓝溶液以1 μL/min注射入小鼠小脑延髓池，15 min后小鼠颈深淋巴出现蓝染，见图2。
2.3 120 g/L多聚甲醛固定颅骨24 h与不固定对比在120 g/L多聚甲醛固定颅骨24 h后，在体式显微镜下按前

面所述的方法将硬脑膜与颅骨分离，将脑膜贴在载玻片上，大体可见硬脑膜舒展，形状完整，韧性较好；将颅骨取下后直接在体式显微镜下将硬脑膜剥离，此时硬脑膜较软，易破损，且易收缩，不利于后期进一步使用，见图3。

2.4 120 g/L多聚甲醛与40 g/L多聚甲醛取脑膜对比将包含硬脑膜的颅骨分别在120 g/L的多聚甲醛与40 g/L的多聚甲醛中浸泡24 h，在体式显微镜下剥离脑膜，可见在120 g/L多聚甲醛浸泡后的脑膜形态较为完整，淋巴管结构明显；40 g/L的多聚甲醛浸泡下的硬脑膜在剥离时容易出现破损，质地较软，形态较120 g/L的多聚甲醛差，与120 g/L多聚甲醛对比无明显优势，见图4。

2.5 120 g/L多聚甲醛短时间取脑膜对比对比了短时间泡120 g/L多聚甲醛取硬脑膜，测试了10，20，30，
40 min，将固定后的硬脑膜贴附于载玻片上，大体可见30-40 min的硬脑膜较为舒展，形态较好，测量多聚甲醛固定的硬脑膜长宽面积与直接剥离的硬脑膜予以对比，120 g/L多聚甲醛固定30 min有差异，40 min差异明显，24 h最佳；见图5，6。

2.6 颈深颈深淋巴结示踪剂引流情况(枕大池注射) 经枕大池注射示踪剂30 min后，取颈深淋巴结，切成冠状冷冻切片，切片内可见明显的示踪剂，示踪剂通过枕大池进入淋巴管，淋巴结位置无误，见图7。

2.7 颈深淋巴结示踪剂与LYVE-1免疫荧光淋巴结可见明显的示踪剂存在， LYVE-1免疫荧光染色阳性，淋巴结位置无误，颈深淋巴结内淋巴管存在，见图8。

2.8 硬脑膜LYVE-1免疫荧光染色结果显示，LYVE-1免疫荧光染色阳性，脑膜淋巴管形状明显存在，表明该方法免疫荧光染色结果良好，可作为后续实验使用，见图9。

2.9 硬脑膜淋巴管示踪剂荧光与LYVE-1免疫荧光染色脑膜淋巴管尾端可见明显的示踪剂，LYVE-1免疫荧光染色阳性，脑膜淋巴管形状明显存在，结果表明示踪剂可以通过枕大池进入硬脑膜淋巴管，可与免疫荧光染色同时进行，可作为后续实验使用，见图10。

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引言

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease)是老年人群体中一种频发的神经退行性病变，其晚期阶段常导致患者失去自我照护能力，进而给家庭构筑起沉重的经济和心理双重压力[1]。2012年，伊利夫教授团队发现类淋巴系统，它能通过脑脊液与脑组织液的交换以实现清除脑细胞间隙的β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)[2]。2015年，Louveau教授等[3]还有效证明了人脑膜淋巴管(meningeal lymphatic vessels，mLVs)的存在，这一研究更重新勾勒出中枢神经系统内β-淀粉样蛋白引流的生理结构图。以类淋巴系统和脑膜淋巴管为核心的脑淋巴引流系统实现了中枢神经系统内β-淀粉样蛋白的高效率清除，研究表明脑淋巴引流是脑细胞间隙β-淀粉样蛋白清除的重要模式[4-5]。自2015年证明了脑膜淋巴管的存在以来，研究者对脑膜淋巴管结构和功能的探索具有极高的热情[6-9]。但由于硬脑膜紧贴颅骨分布的特性，取材和标记具有一定难度。另外，对于脑膜淋巴管引流效率的观察常借助于小脑延髓池的示踪剂注射及观察，因此，对于脑膜淋巴管剥取的时间也有较高的要求[10-11]。然而目前尚未有一种步骤和条件明确、可复制且较为简单且迅速的取样及观察标准。
此次研究拟建立推广一种有效、简便的评价小鼠硬脑膜取样流程，以及小鼠颈深淋巴结的准确定位及鉴定，便于两者的同时摘取，方便后期进一步实验。通过对比不同质量浓度的多聚甲醛固定、较短时间
120 g/L多聚甲醛固定带脑膜的颅骨，以筛选合适的浓度、时间，来保证脑膜的延展性，有利于后期实验观察；使脑膜不至于过柔软、易损坏，又不会使脑膜过硬，不利于后期操作；同时，尽可能缩短取材时间，不需要经过反复的脱水复水，减少整体实验时间。颈深淋巴结位于小鼠左右胸乳突肌和锁乳突肌腹侧的深处，舌骨下方肌肉群的外侧，即颌下腹背深处，略近扁珠形[12]，在摘取时常不易找到其位置，实验先使用埃文斯蓝枕大池注射后，定位其解剖位置，再使用示踪剂与淋巴管内皮透明质酸受体1(lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1，LYVE-1)进行染色予以鉴定[13-14]。通过这一创新方法的建立与推广，可以尝试解决脑淋巴引流研究中的取材与标记难题，通过该方法或许可以促进相关领域的研究进展，为揭示脑淋巴管在神经系统疾病、免疫系统疾病及肿瘤转移等过程中的作用机制提供一定的技术支持，为临床诊断和治疗提供新的思路和策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计硬脑膜与颈深淋巴结取材，每个浓度选取5个硬脑膜，或者5个淋巴结。首先观察淋巴结埃文斯蓝染色情况，以及各浓度脑膜舒展情况，统计数据集进行分析；然后通过冰冻切片示踪剂引流情况与LYVE-1免疫荧光染色情况进行鉴定。
1.2 时间及地点实验于2024 年1-6月在南京中医药大学热病实验室与南京中医药大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 3月龄清洁级雄性ICR小鼠30只，体质量约30 g，购自南京卡文斯生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(苏)2020-0009；动物使用许可证号：SYXK(苏)2023-0077，动物质量合格证号：A202405060131。所有小鼠均在自然光照下自由饮食、饮水，环境温度25 ℃，动物房环境及鼠笼清洁、透气，由南京中医药大学动物实验中心SPF级屏障饲养。
实验获得南京中医药大学实验动物伦理委员会批准，备案编号202405A028。
1.3.2 主要试剂葡聚糖、Texas Red、3 000 MW、赖氨酸(Texas Red-dextran3，TR-d3；#D3328)购自美国ThermoFisher公司；LYVE-1 Polyclonal antibody一抗、 Alexa Fluor®488标记的山羊抗兔IgG购自 proteintech公司；埃文斯蓝、抗荧光衰减封片剂(含DAPI)、40 g/L多聚甲醛固定液购自索莱宝公司；多聚甲醛AR级分析纯购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氢氧化钠AR级分析纯购自国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白购自AlbuminBovine；通用型抗体稀释液购自新赛美生物科技有限公司；免疫荧光通透液购自碧云天生物技术有限公司；1%戊巴比妥钠为德国默克生物有限公司产品。
1.3.3 主要仪器脑立体定位仪购自武汉微科精密仪器有限公司；体式显微镜购自上海测维光电技术有限公司；STELLARIS 8 DIVE激光共聚焦显微镜+双光子激光器购自德国徕卡集团；VS200数字玻片扫描系统购于OLYMPUS公司；-80 ℃低温冰箱购自日本SANYO公司。
1.3.4 配制溶液 120 g/L多聚甲醛：取2.4 g多聚甲醛分析纯，加入20 mL纯水，缓慢加入氢氧化钠，边加入边斡旋振荡，直至溶液内无颗粒存在。示踪剂：将葡聚糖、Texas Red、3000 MW以0.5%的浓度溶解在水相溶液PBS中。
1.4 实验方法
1.4.1 颈深淋巴结定位小鼠使用1%戊巴比妥钠以50 mg/kg腹腔注射麻醉，待小鼠完全麻醉后腹部向下固定，剃除颈部被毛，用碘酊和体积分数70%乙醇消毒，暴露小脑延池上方的枕后膜。把5 μL 10%埃文斯蓝溶液缓慢注射入小脑延髓池，注射完毕把注射器留在原处2 min，防止脑脊液回流。把小鼠置于电热毯上，15 min后观察颈深淋巴结是否蓝染。
1.4.2 示踪剂注射(ICM) 小鼠用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，脱毛并固定在脑立体定位仪上。然后，解剖肌肉层，暴露小脑延髓池。使用30 GA针头的微量注射针将总共10 μL示踪剂溶液通过注射泵以1 μL /min的速率注射到小脑池中。将注射针留在原处5 min以防止回流，同时让小鼠在加热垫上恢复30 min。
1.4.3 取颈深淋巴结麻醉后剖开小鼠胸腔，充分暴露心脏，自左心室心尖用灌注针进针，缓慢匀速灌注PBS，直至两肺及四肢血色褪去变白，换成40 g/L多聚甲醛继续灌注至全身僵硬，剃除颈部被毛，用碘酊和体积分数70%乙醇消毒，随后在锁骨上方约5 mm的颈部作一长约3 cm的中线切口后，钝性分离浅脂肪和筋膜，牵拉左侧胸锁乳突肌，暴露左侧颈深淋巴结，在体式显微镜下摘取淋巴结；使用同样的方法摘取右侧颈深淋巴结，-80 ℃冻存。
1.4.4 取硬脑膜及摸索取硬脑膜多聚甲醛质量浓度及固定时间取完淋巴结后迅速断头摘取颅骨，使用剪刀自枕骨大孔处沿顶骨下沿离断一周，小心分离小鼠的颅骨和脑组织，获取完整的颅骨顶部，分别将取下来的颅骨顶部泡在40 g/L多聚甲醛24 h，120 g/L多聚甲醛固定24 h， 120 g/L多聚甲醛固定10，20，30，40 min，每个时间点5只小鼠。在立体显微镜下使用眼科镊子将硬脑膜与颅骨分离，对比取脑膜方法。体式显微镜下取硬脑膜步骤见图1。
1.4.5 免疫荧光法鉴定颈深淋巴结将颈深淋巴结切成冠状冷冻切片，并在载玻片上展开，然后：①水化：切片置水5 min；②PBS冲洗3次，每次5 min；③封闭：滴加10%BSA血清封闭液，室温孵育30 min，甩去多余液体；④滴加适量Ⅰ抗，4 ℃过夜；⑤PBS冲洗3次，每次5 min；⑥滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，室温静置50 min；⑦PBS冲洗3次，每次5 min；⑧TSA染料：切片上滴加TSA荧光染料反应液，室温反应1-15 min(最佳时间5-10 min)；⑨PBS冲洗3次，每次5 min；⑩DAPI复染细胞核：切片稍微甩干后，滴加DAPI抗荧光淬灭剂后进行封固；⑪在扫片系统下观察并采集图像。
1.4.6 免疫荧光法鉴定脑膜淋巴管将分离的脑膜在PBS中冲洗，然后在含有2%牛血清白蛋白的0.3% Triton-X-100的PBS中孵育。随后脑膜与抗LYVE-1抗体(1∶200，proteintech，51011-1-AP)孵育过夜，并在第2天用荧光二抗染色。然后将脑膜小心地铺在载玻片上，在DAPI中孵育。
1.5 主要观察指标 ①小鼠注射埃文斯蓝后颈深淋巴结蓝染情况；②硬脑膜形态；③免疫荧光法鉴定颈深淋巴结淋巴管；④示踪剂在颈深淋巴结流动性验证及验证淋巴结位置；⑤免疫荧光法鉴定脑膜淋巴管；⑥示踪剂在脑膜淋巴管中流动性验证。
1.6 统计学分析数据采用Graphpad Prism 8绘图，多组间数据比较采用one-way ANOVA进行检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已经南京中医药大学统计学专家审核。

讨论

过去普遍认为大脑缺乏淋巴引流系统，而最近的研究表明硬脑膜内存在脑膜淋巴管[3，15-16]。脑膜淋巴管与经典淋巴管组织结构相似，被认为是从脑脊液到颈深淋巴结的重要引流通路[17]，具有清除大脑代谢物[18]、排出有毒蛋白质大分子，如β-淀粉样蛋白[19]、Tau蛋白和α-突触核蛋白[20-21]、参与免疫监视与免疫反应等作用[22]，参与多种神经系统疾病的发生与进展[23-24]。它们在预防和治疗神经障碍中起到保护作用[25]。增强脑膜淋巴管功能可缓解小鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤[26]、利用重组血管内皮生长因子C或腺病毒转染诱导血管内皮生长因子C表达增加的方法，通过增强脑膜淋巴管的功能缓解了阿尔茨海默病相关认知障碍[27-29]。淋巴内皮细胞特异性表达有rospero相关同源异形盒1(prospero-related homeo-box-1，PROX-1)[30]、LYVE-1[31-32]，且使用磁共振成像在人体研究中发现矢状窦旁的脑膜淋巴管是脑脊液的重点吸收部位[33]。因此，有一种简单、可复制且迅速的同时取硬脑膜及颈深淋巴结的方法对于中枢神经系统的研究尤为重要。
此次研究中使用了5 μL 10%埃文斯蓝枕大池注射[34-35]，对颈深淋巴结进行定位，在体式显微镜下可见明显蓝染，可提供直观的解剖位置。颈深淋巴结形态近似球形或卵圆形，颜色通常为淡黄色[36]，位于颈部的深层组织中，随着周围组织的挤压，可能呈现出轻微的扁平或不规则形状，较难直接找到，可使用牵拉钳将胸锁乳突肌向下牵拉，然后使用眼科镊在气管与胸锁乳突肌之间的三角周围寻找，通常可以找到[37]。在枕大池注射示踪剂后半小时，取小鼠淋巴结，做冰冻切片，在荧光显微镜下可看到示踪剂，证明示踪剂能经脑膜淋巴管进入到颈部淋巴结，LYVE-1荧光染色阳性表明颈深淋巴结内取材正确。脑膜淋巴管方面，文献中多数将剥出颅骨后将其放入40 g/L多聚甲醛中固定24 h[19，38-39]，但作者在实践过程中发现硬脑膜较为柔软，容易破损，且文献步骤大多写的较为模糊，不利于复制其操作，考虑多聚甲醛质量浓度增高，固定效果更强，能迅速固定组织中的蛋白质和其他分子，减少降解，使组织更加致密，保证其形态。在前期研究中，对不同质量浓度的多聚甲醛固定24 h后取硬脑膜剥取的比较，通过对比得出了120 g/L硬脑膜形态舒展、韧性较好，剥离后较完整，是其中综合表现上是最优的，进一步实验验证，发现该浓度对于示踪剂、荧光均无影响，故最后定为此浓度。并进一步摸索了该浓度短时间是否能取硬脑膜，将颅骨固定在120 g/L多聚甲醛10，20，30，40 min后，在体式显微镜下剥离，发现固定30-40 min的硬脑膜较为舒展，但较24 h相比较差，时间紧迫时可选择使用。
此次研究只采用了不同质量浓度多聚甲醛进行实验，120 g/L多聚甲醛浸泡的时间上的对比未能全面探索研究，有待进一步实验比较多聚甲醛浸泡的最佳时间点。有相关文献表明可以使用多聚甲醛+蔗糖+纯水将颅骨与硬脑膜分离[40]，虽然所提取的硬脑膜也较为完整，但考虑其处理时间较长，可能会影响荧光示踪剂的观察，故未采取此方法；短时间固定方法的组织较为挛缩，是否在切片等相关应用中有影响，有待进一步探索。在颈深淋巴结处理方面，有相关文献将淋巴结做石蜡切片[13]，或将取出的淋巴结放入40 g/L多聚甲醛中固定24 h，用20%和30%的蔗糖梯度脱水后连续冰冻切片(厚度10 μm)，然后OCT包埋[38]，其优势有待进一步比较。颈深淋巴结冰切有利于示踪剂的保存，石蜡包埋有利于LYVE-1、β-淀粉样蛋白等相关指标检测，可以根据对应的实验要求进行处理。
综上所述，此次研究摸索出一种可以复制的剥离硬脑膜方法，以及取颈深淋巴结定位并验证的方法，有助于减轻研究脑膜淋巴管的学者在这方面的摸索及后期的实验，对于研究脑膜淋巴管系统，阿尔茨海默，神经退行性疾病有一定的帮助。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

一种同时取硬脑膜及颈深淋巴结的实验方法

An experimental method for simultaneously extracting the dura mater and deep cervical lymph nodes

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