小鼠胚胎脊髓神经干细胞提取与传代培养：3种常用消化酶优劣的比较与分析

doi:10.12307/2025.540

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (31): 6609-6615.doi: 10.12307/2025.540

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小鼠胚胎脊髓神经干细胞提取与传代培养：3种常用消化酶优劣的比较与分析

罗丹1，2，葛志林1，3，侯永辉1，2，王万舜1，3，詹吉恒1，2，侯宇1，2，林定坤1，2，陈树东1，2

1广州中医药大学第二附属医院，广东省广州市 510000；2 广东省中医药科学院，广东省广州市 510000；3广州中医药大学，广东省广州市 510000

收稿日期:2024-05-08 接受日期:2024-08-12 出版日期:2025-11-08 发布日期:2025-02-18
通讯作者: 陈树东，副主任医师，硕士生导师，广州中医药大学第二附属医院，广东省广州市 510000；广东省中医药科学院，广东省广州市 510000
作者简介:罗丹，女，1992年生，广东省广州市人，汉族，助理研究员，硕士，主要从事脊髓损伤疾病的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81704095)，项目负责人：陈树东；广州市基础研究计划基础与应用基础研究项目(202102020542)，项目负责人：陈树东；国家自然科学基金项目(82074451)，项目负责人：林定坤

Extraction and subculture of neural stem cells from mouse embryonic spinal cord: comparison and analysis on advantages and disadvantages of three commonly used digestive enzymes

Luo Dan1, 2, Ge Zhilin1, 3, Hou Yonghui1, 2, Wang Wanshun1, 3, Zhan Jiheng1, 2, Hou Yu1, 2, Lin Dingkun1, 2, Chen Shudong1, 2

1Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 2Guangdong Academy of Traditional Chinese Medicine Science, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 3Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China

Received:2024-05-08 Accepted:2024-08-12 Online:2025-11-08 Published:2025-02-18
Contact: Chen Shudong, Associate chief physician, Master’s supervisor, Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; Guangdong Academy of Traditional Chinese Medicine Science, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China
About author:Luo Dan, Assistant researcher, MS, Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; Guangdong Academy of Traditional Chinese Medicine Science, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81704095 (to CSD); Guangzhou Basic Research Program Basic and Applied Basic Research Project, No. 202102020542 (to CSD); National Natural Science Foundation of China, No. 82074451 (to LDK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脊髓神经干细胞：是存在于脊髓中的一类多能性干细胞，具有自我更新和分化为多种神经元和胶质细胞的潜力。
脊髓损伤：是一种神经损伤疾病，通常由外力作用引起，导致部分或全部脊髓组织受损，从而出现下肢功能障碍、尿失禁、排便困难等问题。

摘要
背景：在神经干细胞的研究及应用过程中，细胞的培养与传代是关键环节，直接影响到细胞的质量和实验结果。寻找一种最适宜的消化酶类，对维持胚胎小鼠脊髓神经干细胞的生物学特性并增强其传代效率，具有重要意义。
目的：探讨胚胎小鼠脊髓神经干细胞传代最适合的消化酶。
方法：显微解剖分离提取孕14 d C57BL/6胎鼠脊髓组织，用含有表皮生长因子、碱性成纤维生长因子及B27的DMEM/F12无血清培养基培养，待成球后进行Nestin与Sox2免疫荧光鉴定。神经干细胞传代培养过程中分别采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶以及TrypLETM Express酶消化结合吹打法制成单细胞悬液，观察细胞分散效果及成球情况，取第3代细胞进行碘化丙啶染色观察细胞死亡情况，通过计数细胞总数观察细胞增殖情况，通过免疫荧光染色、Western blot和RT-PCR检测Olig2、Tuj1、GFAP、NeuN蛋白和mRNA表达鉴定细胞分化情况。
结果与结论：脊髓组织细胞培养72 h后可形成悬浮生长的神经球，5-7 d后即可传代。与胰蛋白酶、木瓜蛋白酶相比，TrypLETM Express酶结合吹打法进行传代的细胞分散率高，活性较好，分化为NeuN与Tuj1的阳性神经元细胞较多。此研究优化了神经干细胞的培养和传代过程，为进一步开展脊髓疾病的干细胞移植治疗研究奠定了基础。

https://orcid.org/0000-0003-2156-7826(陈树东)；https://orcid.org/0000-0001-7892-9475(罗丹)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 神经干细胞, C57BL/6小鼠, 胚胎, 脊髓, 胰蛋白酶, 木瓜蛋白酶, TrypLETM Express酶, 工程化干细胞

Abstract: BACKGROUND: In the research and application of neural stem cells, cell culture and passage are key links, which directly affect the quality of cells and experimental results. It is of great significance to find the most suitable digestive enzymes that can maintain the biological characteristics of embryonic mouse spinal cord neural stem cells and enhance their passage efficiency.
OBJECTIVE: To explore the most suitable digestive enzyme for passage of neural stem cells from the spinal cord of embryonic mice.
METHODS: Microscopic dissection was used to isolate and extract spinal cord tissue from E14 d embryonic mice, which was cultured in DMEM/F12 serum-free medium containing epidermal growth factor, basic fibroblast growth factor, and B27. After spherulation, Nestin and Sox2 immunofluorescence identification was performed. During neural stem cell passage and culture, single-cell suspensions were prepared using trypsin, papain, and TrypLETM Express enzyme digestion combined with blow molding. The cell dispersion and spheroidization were observed, and passage 3 cells were stained with propidium iodide to detect cell death. Cell proliferation was detected by counting the total number of cells. Immunofluorescence staining, western blot assay and RT-PCR were used to detect the expression of Olig2, Tuj1, GFAP, and NeuN at the protein and mRNA levels and to identify cell differentiation.
RESULTS AND CONCLUSION: After 72 hours of culture, E14 d embryonic mouse spinal cord tissue cells could form suspended neurospheres, which could be passaged after 5-7 days. Compared with trypsin and papain, TrypLETM Express enzyme combined with blow beating method was used for passage. The cell dispersion rate was high, the activity was good, and more NeuN- and Tuj1-positive neurons differentiated. This study optimized the culture and passaging process of neural stem cells, laying a foundation for further research on stem cell transplantation therapy for spinal cord diseases.

Key words: neural stem cell, C57BL/6 mouse, embryo, spinal cord, trypsin, papain, TrypLETM Express enzyme, engineered stem cell

中图分类号:

罗丹, 葛志林, 侯永辉, 王万舜, 詹吉恒, 侯宇, 林定坤, 陈树东. 小鼠胚胎脊髓神经干细胞提取与传代培养：3种常用消化酶优劣的比较与分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6609-6615.

Luo Dan, Ge Zhilin, Hou Yonghui, Wang Wanshun, Zhan Jiheng, Hou Yu, Lin Dingkun, Chen Shudong. Extraction and subculture of neural stem cells from mouse embryonic spinal cord: comparison and analysis on advantages and disadvantages of three commonly used digestive enzymes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(31): 6609-6615.

图/表（结果） 3

2.1 小鼠胚胎脊髓神经干细胞的形态 提取分离出的原代细胞为圆形的单个悬浮细胞，其边界清楚、折光性强，见图1；24 h后，部分细胞贴壁，单个或成对存在；48 h后，可见哑铃型的细胞分裂相；72 h后，数个到数十个细胞形成细胞集落，悬浮生长；随着时间的推移，细胞迅速增加，细胞集落不断增大呈球形的神经球；7-10 d后神经球长大至200 μm左右即可传代，见图2。
2.2 神经干细胞的鉴定结果 Nestin是一种中间丝类型的蛋白，是公认的一种神经干细胞的特征性标志物[16-17]，Sox2 也是神经干细胞的关键标记蛋白之一，对于维持神经干细胞的自我更新和多能性起着至关重要的作用。将Nestin与Sox2的荧光双标作为神经干细胞的鉴定依据。荧光显微镜下观察488标记Nestin发绿光，555标记的Sox2为红光，表明Nestin与Sox2免疫荧光染色为阳性，确定培养的细胞为神经干细胞，见图3。
2.3 神经干细胞的分化情况 将神经球分离为单细胞后接种于预先用多聚赖氨酸包被的24孔板中，用神经干细胞分化培养基诱导分化培养；细胞在培养24 h左右开始贴壁，2 d后细胞开始分化，有些细胞长出突起；随着时间的增加，突起逐渐增长，互相联系，分化出具有不同形态的神经细胞，其生长变化见图4。
2.4 不同酶传代对神经干细胞的影响 TrypLE TM Express酶消化后单细胞状态适宜，传代后球体大小适中，形态较好，背景干净；木瓜蛋白酶消化后仍有部分细胞小球无法消化成单个细胞，成球后易贴壁分化；胰蛋白酶虽能将神经球完全消化成单个细胞，但消化后的细胞活性差，成球速度慢，未成球的单个细胞较多，成球后部分贴壁分化，见图5。碘化丙啶不会染色质膜完整的活细胞，仅对死细胞染色。用545 nm激发，可观察到死细胞，TrypLETM Express酶组的死细胞比例明显低于其他两种酶组，差异有显著性意义，证明TrypLETM Express酶消化传代能减少神经干细胞的死亡率，保持细胞活性。见图6。

将3种酶消化传代的细胞分别接种于24孔板，分化培养至第7天，利用免疫荧光法鉴定细胞分化情况，结果显示细胞分化为NeuN免疫反应阳性的成熟神经元、Tuj1免疫反应阳性的神经元骨架，GFAP免疫反应阳性的星形胶质细胞，Olig2免疫反应阳性的少突胶质细胞。3组之间GFAP信号强度无统计学差异；胰蛋白酶组Olig2标记的少突胶质细胞最多，其他两组无明显差异；胰蛋白酶组和木瓜蛋白酶组NeuN阳性细胞数及Tuj1标记的神经元骨架与轴突荧光强度相较于TrypLETM Express酶组明显减少，差异有显著性意义，见图7。
Western blot和RT-PCR结果也证明了TrypLETM Express酶组NeuN表达水平明显高于其他两组；胰蛋白酶组Olig2表达水平明显高于TrypLETM Express酶组，其他组间比较无明显差异；胰蛋白酶组GFAP表达水平明显高于其他两组，木瓜蛋白酶组GFAP表达水平高于TrypLETM Express酶组，见图8。结果表明3种酶消化均能保持神经干细胞的分化能力，其中TrypLETM Express酶消化后能促进神经干细胞向神经元分化，木瓜蛋白酶与胰蛋白酶消化能促进神经干细胞向胶质细胞分化。

在1，3，5，7 d时间点，通过计数细胞总数来评估神经干细胞的增殖情况，结果显示TrypLETM Express酶组细胞增殖数量最高，木瓜蛋白酶组次之，胰蛋白酶组最差，见图9。

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引言

脊髓损伤后神经元无法再生，是脊髓损伤难以修复的关键[1-2]。神经干细胞概念的提出，打破了中枢神经系统神经元不能再生的传统观点，神经干细胞具有自我更新和分化成多种神经细胞的能力，为中枢神经系统损伤及中枢神经系统退行性疾病患者带来了新的希望[3-6]。理论上脊髓损伤区域植入神经干细胞，可分化成神经元和神经胶质细胞，建立新的神经通路，修复断裂的神经连接并促进神经功能恢复。目前，神经干细胞移植得到了国内外研究者的普遍关注，具有一定的发展前景[7-9]。
神经球是神经干细胞在非贴附条件下培养而形成的，通常由成千上万个紧密连接的细胞构成，并且这些细胞之间通过细胞外基质和细胞间连接(如黏附连接和紧密连接)建立起复杂的网络[10-11]，由于细胞外基质和细胞膜上有很多对酶敏感的分子，过度的酶处理可能会损伤细胞。细胞表面蛋白在细胞黏附、信号传递和细胞间交流等方面发挥着重要的作用，不同酶对细胞表面蛋白的切割特异性不同，可能会对细胞的表面受体、黏附分子等产生不同的影响，从而影响细胞的生存、增殖以及分化能力[12-13]。选择一种合适的消化酶对神经干细胞的培养至关重要，然而，目前对于神经球传代消化所选择的酶说法不一[14-15]。此研究从小鼠胚胎脊髓组织中成功分离出神经干细胞，使用最常见的3种酶进行至少3次消化传代，通过细胞分散和成球效果以及细胞增殖、死亡、分化情况，确定最适宜神经球传代用的消化酶，为进一步深入研究神经干细胞的结构和功能以及脊髓疾病的细胞替代治疗提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞实验。
1.2 时间及地点 实验于2023-2024年在广州中医药大学岭南医学研究中心骨伤科实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 孕14 d C57BL/6小鼠，体质量22-35 g，购自广州中医药大学动物中心，许可证号为SCXK (粤)2018-0034，SPF级环境中饲养。该实验获得广州中医药大学实验动物管理和使用委员会批准，批准号：20230407006。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 主要试剂和仪器 Hank’s平衡盐溶液(HBSS)、胰蛋白酶(2472358)、DMEM/F12(6123031)、L-谷氨酰胺(25030-081)、B27(2814919)、TrypLETM Express酶(2754041)(美国GIBCO公司)；木瓜蛋白酶(中国阿拉丁)；DNAse Ⅰ(瑞士Roche公司)；蔗糖(中国阿拉丁公司)；重组人碱性成纤维细胞生长因子(6062712)、重组人表皮生长因子(6062717)(美国Peprotech公司)；透明质酸酶、胰酶抑制剂、多聚赖氨酸(1003545121)、胎牛血清(A2689435CP)(美国Sigma公司)；Olig2(GR318848)、NeuN(1030423-1)一抗(英国Abcam公司)；GFAP(11cm28)一抗、FITC标记的山羊抗兔IgG(中国BOSTER公司)、驴抗小鼠IgG Alexa Fluor 488(美国Invitrogen公司)；Tuj1一抗(MAB1637)(美国Millipore公司)；碘化丙啶(中国索莱宝公司)；ECL显影液(170-5060)(美国BIO-RAD公司)；细胞培养箱、显微镜(美国Thermo Fisher Scientific公司)；倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)；全能型凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。
1.4 方法
1.4.1 小鼠胚胎脊髓神经干细胞的提取 0.3%戊巴比妥钠麻醉C57BL/6孕鼠，用高温高压灭菌过的手术器械于操作台内取出胎鼠，置于含PBS的培养皿中浸泡，解剖显微镜下逐个解剖分离出脊髓组织，放置新的含PBS的培养皿中，仔细剥去外层膜，将取出的脊髓放入含有500 µL HBSS(含Ca2+和Mg2+)的离心管中，用眼科剪剪成1 mm3的碎片，加入130 µL透明质酸酶、130 µL胰蛋白酶、25 µL DNAse Ⅰ，置于37 ℃水浴锅中消化30 min，其间每隔10 min取出1次离心管，用1 mL枪头吹打混匀，待消化结束后转移到15 mL离心管中，加入6 mL HBSS，380×g离心5 min，弃上清，用0.6 mL HBSS重悬，加入20 µL胰蛋白酶抑制剂，将40 µm细胞过滤器安装于50 mL离心管上，将细胞悬液用过滤器过滤到离心管内，用2.0-3.0 mL HBSS冲洗滤器，380×g离心5 min，弃上清，用2 mL蔗糖溶液重悬沉淀，750×g离心30 min，离心完成后缓慢将离心管从转子上移除，置于离心管架上，避免任何震动，用巴氏吸管吸除白色层的髓磷脂，用500 µL完全培养基(DMEM/F12+20 ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子+20 ng/mL重组人表皮生长因子+2% B27+1% L-谷氨酰胺)重悬细胞并进行计数。以1×109 L-1的细胞浓度接种于未包被的25 cm2培养瓶内，加入5 mL完全培养基。从取出胚胎开始计时，整个细胞提取过程不宜超过2 h，每隔2 d半量换液，以便补充新的重组人碱性成纤维细胞生长因子和重组人表皮生长因子。
1.4.2 神经干细胞的鉴定 取直径200-300 μm的原代细胞球置于离心管中静置，使细胞球自然沉降，弃上清，将细胞球接种于内置爬片的24孔板中(孔板用多聚赖氨酸包被过夜)，加入完全培养基，37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养2 h，显微镜下观察神经球已经贴壁生长。取出细胞爬片进行免疫荧光染色，操作如下：PBS洗2次，40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗2次，加入封闭液(PBS+1%Triton X-100+体积分数10%山羊血清)室温封闭1 h，加入按1∶200配置的Nestin、Sox2一抗，4 ℃孵育过夜，PBS洗3次5 min，加入1∶200配置的荧光二抗，室温避光孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min，用含DAPI的封片剂封固，荧光显微镜下观察并拍照记录。
1.4.3 神经干细胞的分化 将原代神经球消化成单细胞悬液，接种于预先包被多聚赖氨酸的内含细胞爬片的24孔培养板中，每孔细胞数为0.5×105个，细胞贴壁后，更换含血清的分化培养基(DMEM/F12+20 ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子+20 ng/mL重组人表皮生长因子+ 2%B27+体积分数2%胎牛血清+1% L-谷氨酰胺)，37 ℃、体积分数5%CO2培养箱培养7 d，每隔2 d半量更换分化培养基，每天观察细胞的分化情况并拍照记录。
1.4.4 神经干细胞的传代 原代神经干细胞在培养基中逐渐融合增殖成细胞球，两三天后细胞球迅速增长，当神经球达到约200 µm时，将神经球进行传代。将3瓶含有神经球的培养基分别转移至3个15 mL离心管，静置5 min，移出上清液，分别加入1 mL胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或TrypLETM Express酶于培养箱中消化3 min，并轻柔缓慢吹打2 min，加入4 mL含体积分数20%胎牛血清的HBSS终止消化，以380×g离心5 min，去除上清液，使用50%旧培养基和50%新鲜完全培养基重悬细胞，相同方式传代3次，观察上述3种方式传代后的细胞后续成球及分化情况。

1.4.5 不同消化酶传代后细胞状态比较 按前述方法将经过3种酶消化后的第3代细胞球消化成单细胞悬液进行以下实验：①死细胞染色：取细胞接种于24孔板，每孔细胞数为2×105个，细胞贴壁后，PBS轻洗2次，加入0.5 g/L碘化丙啶染液，室温避光孵育30 min，加入0.5 mg/L DAPI避光孵育5 min，显微镜观察死细胞比例并拍照。②免疫荧光染色：按1×108 L-1的细胞浓度接种于预先包被多聚赖氨酸的内含细胞爬片的24孔培养板中，每孔细胞数为0.5×105个，待细胞贴壁后，更换含血清的分化培养基(DMEM/F12+20 ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子+20 ng/mL 重组人表皮生长因子+2%B27+体积分数2%胎牛血清+1% L-谷氨酰胺)，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱培养7 d，每隔2 d半量更换分化培养基，每天观察细胞的分化情况，7 d后取出细胞爬片，按上述免疫荧光操作步骤进行Tuj1与Olig2共定位、GFAP与NeuN共定位荧光染色，将细胞爬片置于荧光显微镜下观察并拍照。③Western blot检测：按1×108 L-1的细胞浓度接种于预先包被多聚赖氨酸的6孔板中，每孔细胞数为2×105个，贴壁后更换分化培养基，分化7 d后用含蛋白酶抑制剂的裂解液提取细胞蛋白，BCA测定蛋白浓度后，配制为20 μg/10 μL的上样体系，配制12%SDS-PAGE凝胶，电泳分离不同分子质量的蛋白，将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，Olig2(1∶1 000)、GFAP(1∶2 000)、NeuN(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，每次5 min，辣根过氧化物酶偶联的IgG二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，使用成像系统进行成像。④RT-PCR：按1×108 L-1的细胞浓度接种于预先包被多聚赖氨酸的6孔培养板中，每孔细胞数为2×105个，分化培养基培养7 d后提取细胞RNA，反转录为cDNA后进行RT-PCR扩增，引物序列见表1。⑤细胞增殖：将1 mL单细胞悬液(含1×105个细胞)接种到12孔板，接种后1，3，5，7 d用1 mL移液管收集所有神经球和培养液，转移到离心管，用3种酶分别在37 ℃下处理3 min，吹打2 min，380×g离心5 min，用细胞计数板计数细胞数量。实验至少重复3次。

1.5 主要观察指标 ①神经干细胞的成球情况；②神经干细胞Nestin与Sox2免疫荧光染色结果；③神经干细胞贴壁分化情况；④神经干细胞消化传代后死亡情况；⑤神经干细胞分化后Tuj1、Olig2、GFAP、NeuN免疫荧光染色结果；⑥Western blot、RT-PCR检测神经干细胞分化后Olig2、GFAP以及NeuN的表达。
1.6 统计学分析 所有数据均以x±s表示，采用GraphPad Prism 8和SPSS 27.0软件进行数据处理，采用单因素方差分析和事后检验进行组间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。实验均重复3次。文章统计学方法已经通过广州中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

近年来，研究者们对神经干细胞的深入研究为脊髓损伤的治疗带来了新的希望[18-19]。脊髓神经干细胞是能够自我更新并且可以分化成多种神经元和胶质细胞的细胞群体[20]，这些干细胞起源于胚胎早期的中胚层，随着发育进程逐渐定位到脊髓中央管周围区域[21]。在成年人中，这些干细胞仍然存在于富含细胞增殖因子的微环境中，可通过特定的信号通路得以激活增殖并分化为神经元和胶质细胞。此外，在脊髓损伤后，脊髓神经干细胞的数量也会显著增加，这与其参与脊髓再生和修复有关[22-23]。
神经干细胞移植已在多种疾病中展现出治疗作用，如亨廷顿病、缺血性脑卒中和帕金森综合征等[24-27]。为了促进神经干细胞的增殖并使其保持未分化状态以实现干细胞移植治疗，需要进一步改进培养方法，以利于得到纯度更高、状态更好的神经干细胞，同时也需要深入探究神经干细胞增殖、分化和迁移的调控机制。
该研究成功提取出了胎鼠脊髓神经干细胞，其在无血清培养基中以1×109 L-1的细胞浓度接种于25 cm2培养瓶，采用悬浮培养法，每隔2 d半量换液，每7-10 d 传代1次(神经球直径约为200 μm)的培养条件下表现出优秀的生长和增殖特性。对于神经干细胞传代所用的酶说法不一，没有更详细的结果对其效果进行比较分析。在该研究中，采用TrypLETM Express酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶结合吹打法分离神经球，经过细胞培养、死细胞染色、细胞增殖以及神经干细胞分化实验，筛选出神经干细胞传代最为合适的酶，胰蛋白酶消化加机械吹打的方法，较容易分离神经球获得单细胞悬液，但传代后增殖能力明显下降，传代后细胞成球速度慢；木瓜蛋白酶加吹打的方式传代后有较多的神经小球难以消化成单个细胞，消化后的神经干细胞聚集成球，易贴壁分化；TrypLETM Express酶消化联合机械吹打的方法可以获得大量悬浮单细胞，细胞大小均匀、形状规则、胞质透光性好，培养基内细胞碎片和杂质较少，培养基较为透彻，背景清晰，传代后可观察到大量克隆神经球的形成，球体大小适中，形态较好，成球后不容易分化贴壁，死细胞比例低，保持神经干细胞的分化性能，免疫荧光、Western blot及RT-PCR结果均显示，相比于其他两种酶，TrypLETM Express酶消化传代后神经干细胞分化成神经元的比例高，研究结果表明TrypLETM Express 酶为神经干细胞传代最为合适的消化酶，为神经干细胞的培养奠定重要基础。
神经干细胞的提取和培养为脊髓损伤的治疗提供了新的视野，然而，这一策略的成功实施仍然依赖于科学界对干细胞生物学、神经生物学和组织工程的深入理解，以及这些知识如何转化为临床。虽然目前仍存在一些挑战和限制，但随着技术的不断进步和基础研究的加强，相信脊髓神经干细胞疗法将会成为治疗多种神经系统疾病的重要手段。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

小鼠胚胎脊髓神经干细胞提取与传代培养：3种常用消化酶优劣的比较与分析

Extraction and subculture of neural stem cells from mouse embryonic spinal cord: comparison and analysis on advantages and disadvantages of three commonly used digestive enzymes

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