独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的影响

doi:10.12307/2025.081

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (23): 4915-4926.doi: 10.12307/2025.081

• 干细胞外泌体 Stem cell exosomes • 上一篇下一篇

独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的影响

岳进茹1，张育敏1，刘静淑1，步亚男1，吴婧若1，陈佳1，王建茹2

1山西中医药大学，基础医学院，国家中医药管理局基因表达调控实验室，山西省晋中市 030606；2山西医科大学基础医学院，山西省太原市 030012

收稿日期:2024-02-21 接受日期:2024-05-18 出版日期:2025-08-18 发布日期:2024-09-28
通讯作者: 张育敏，博士，硕士研究生导师，山西中医药大学，基础医学院，国家中医药管理局基因表达调控实验室，山西省晋中市 030606
作者简介:岳进茹，女，1998年生，陕西省安康市人，汉族，山西中医药大学在读硕士，主要从事中医药防治风湿免疫疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82274365)，项目负责人：张育敏；山西省自然科学基金(20210302123301)，项目负责人：王建茹；山西省中医药科研基金(2023ZYYA031)，项目负责人：张育敏；国家中医药管理局基因表达调控实验室研究平台开放基金(2022JD-KF-13)，项目负责人：张育敏；山西中医药大学“青年科学家培训计划”(2021PY-QN-01)，项目负责人：张育敏

Effects of extracellular vesicles treated with Duhuo Jisheng Decoction on rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells

Yue Jinru1, Zhang Yumin1, Liu Jingshu1, Bu Yanan1, Wu Jingruo1, Chen Jia1, Wang Jianru2

1State Administration of Traditional Chinese Medicine Gene Expression Regulation Laboratory, School of Basic Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030606, Shanxi Province, China; 2School of Basic Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030012, Shanxi Province, China

Received:2024-02-21 Accepted:2024-05-18 Online:2025-08-18 Published:2024-09-28
Contact: Zhang Yumin, MD, Master’s supervisor, State Administration of Traditional Chinese Medicine Gene Expression Regulation Laboratory, School of Basic Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030606, Shanxi Province, China
About author:Yue Jinru, Master candidate, State Administration of Traditional Chinese Medicine Gene Expression Regulation Laboratory, School of Basic Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030606, Shanxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82274365 (to ZYM); Natural Science Foundation of Shanxi Province, No. 20210302123301 (to WJR); Shanxi Traditional Chinese Medicine Research Fund, No. 2023ZYYA031 (to ZYM); Open Fund of Gene Expression Regulation Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine, No. 2022JD-KF-13 (to ZYM); Young Scientist Training Program of Shanxi University of Chinese Medicine, No. 2021PY-QN-01 (to ZYM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细胞外囊泡：是直径在40-160 nm之间的小囊泡，来源广泛，结构稳定，包含蛋白质、核酸及代谢产物等多种不同类型的生物学分子，可以作为信息传递载体发挥细胞间物质通讯的作用。
类风湿关节炎滑膜成纤维细胞：是类风湿关节炎疾病过程中滑膜组织增生和炎症的主要效应器，具有异常增殖、迁移、黏附、侵袭和分泌的生物学特征。

摘要
背景：独活寄生汤是治疗类风湿关节炎的经典方剂，但具体作用机制尚不清楚，细胞外囊泡具有细胞间通讯及传递信号的强大功能，可能是该方剂发挥作用的信号载体。
目的：探讨独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。
方法：肿瘤坏死因子α体外诱导构建类风湿关节炎滑膜成纤维细胞模型，实验分为5组：正常组、模型组、独活寄生汤含药血清组、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡组、生理盐水血清细胞外囊泡组。采用CCK-8法筛选独活寄生汤含药血清及独活寄生汤含药血清细胞外囊泡作用的最佳浓度及时间；ELISA检测细胞上清炎症因子水平；划痕实验检测细胞迁移能力；Transwell实验检测细胞侵袭能力及迁移能力；Hoechst染色检测细胞凋亡情况；qRT-PCR及Western blot检测细胞凋亡相关基因及蛋白表达。

结果与结论：①独活寄生汤含药血清作用的最佳体积分数为10%，独活寄生汤含药血清细胞外囊泡作用的最佳质量浓度为10 ng/mL，二者作用的最佳时间均为24 h；②与模型组相比，独活寄生汤含药血清、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡及生理盐水血清细胞外囊泡均能抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的炎症因子表达(P < 0.05)、划痕愈合(P < 0.05)、迁移及侵袭(P < 0.05)，且独活寄生汤含药血清细胞外囊泡的抑制作用更为突出(P < 0.05)；③独活寄生汤含药血清及独活寄生汤含药血清细胞外囊泡均可促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的凋亡；④与模型组相比，独活寄生汤含药血清、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡及生理盐水血清细胞外囊泡均可增加促凋亡因子Caspase-3、Caspase-9、Bax表达(P < 0.05)，降低抑凋亡因子Bcl-2表达(P < 0.05)，且独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对凋亡相关因子的调节作用更显著。上述实验结果表明独活寄生汤含药血清细胞外囊泡可以抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的过度增殖、迁移、侵袭并促进其凋亡。

https://orcid.org/0009-0005-2029-2375 (岳进茹)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 独活寄生汤, 类风湿关节炎, 滑膜成纤维细胞, 细胞外囊泡, 增殖, 迁移, 侵袭, 凋亡

Abstract: BACKGROUND: Duhuo Jisheng Decoction is a classic prescription for the treatment of rheumatoid arthritis, but its specific mechanism is not clear. Extracellular vesicles have the powerful function of inter-cell communication and signal transmission, and may be the signal carrier for the Decoction.
OBJECTIVE: To explore the effects of serum extracellular vesicles treated with Duhuo Jisheng Decoction on the proliferation, migration, invasion, and apoptosis of rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells.
METHODS: The rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cell model was established by co-culturing with tumor necrosis factor-α in vitro. The experiment was divided into five groups: normal group, model group, serum treated with Duhuo Jisheng Decoction group, extracellular vesicles treated with Duhuo Jisheng Decoction group, and extracellular vesicles treated with normal saline group. The optimal concentration and time of drug-containing serum and extracellular vesicles were screened by CCK-8 assay. Expression of inflammatory cytokines in the supernatants of cells in each group was detected by ELISA. The migration ability of rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells was detected by scratch assay. The invasive ability of cells was measured by Transwell Invasion assay. Hoechst staining was adoped to detect cell apoptosis. The expression levels of apoptosis-related genes and proteins were detected by qRT-PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The optimal volume fraction of serum treated with Duhuo Jisheng Decoction was 10% and optimal mass concentration of extracellular vesicles treated with Duhuo Jisheng Decoction was 10 ng/mL; the optimal time for the interaction between the two was 24 hours. (2) Compared with the model group, serum treated with Duhuo Jisheng Decoction, extracellular vesicles treated with Duhuo Jisheng Decoction, and extracellular vesicles treated with normal saline could suppress the expression of inflammatory factors of rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells (P < 0.05), scratch healing (P < 0.05), migration and invasion (P < 0.05). Moreover, the inhibition of extracellular vesicles treated with Duhuo Jisheng Decoction was more significant (P < 0.05). (3) Drug-containing serum and extracellular vesicles treated with Duhuo Jisheng Decoction promoted the apoptosis of rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells. (4) Compared with the model group, serum treated with Duhuo Jisheng Decoction, extracellular vesicles treated with Duhuo Jisheng Decoction, and extracellular vesicles treated with normal saline could increase the expression of proapoptotic factors Caspase-3, Caspase-9, and Bax (P < 0.05) and decrease the expression of antiapoptotic factor Bcl-2 (P < 0.05). Moreover, extracellular vesicles treated with Duhuo Jisheng Decoction had a more significant regulatory effect on apoptosis-related factors. Above findings indicate that extracellular vesicles treated with Duhuo Jisheng Decoction can inhibit the excessive proliferation, migration, and invasion of rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells and promote their apoptosis.

Key words: ">Duhuo Jisheng Decoction, rheumatoid arthritis, synovial fibroblasts, extracellular vesicles, proliferation, migration, invasion, apoptosis

中图分类号:

岳进茹, 张育敏, 刘静淑, 步亚男, 吴婧若, 陈佳, 王建茹. 独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 4915-4926.

Yue Jinru, Zhang Yumin, Liu Jingshu, Bu Yanan, Wu Jingruo, Chen Jia, Wang Jianru. Effects of extracellular vesicles treated with Duhuo Jisheng Decoction on rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(23): 4915-4926.

图/表（结果） 2

2.1 独活寄生汤含药血清干预的最佳体积分数及时间 如图1所示，干预24 h各组的细胞抑制率均高于12 h及48 h；体积分数10%独活寄生汤含药血清对RA-FLS抑制作用高于体积分数5%，20%独活寄生汤含药血清(P < 0.05)，故选取体积分数10%独活寄生汤含药血清和干预24 h进行后续实验。
2.2 独活寄生汤含药血清细胞外囊泡干预的最佳质量浓度及时间 如图1所示，干预24 h各组的细胞抑制率均高于12 h及48 h；20，40 ng/mL独活寄生汤含药血清细胞外囊泡干预24 h后对细胞的抑制作用增强(P < 0.05)，其中20 ng/mL独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对RA-FLS的抑制作用最高(P < 0.05)，故选取10 ng/mL独活寄生汤含药血清细胞外囊泡和干预24 h进行后续实验。
2.3 ELISA检测RA-FLS上清中炎症因子水平 如图2所示，与正常组相比，模型组细胞上清中促炎因子白细胞介素1β及白细胞介素6水平升高(P < 0.05)，而抑炎因子白细胞介素10水平降低(P < 0.05)；与模型组相比，含药血清组、含药血清细胞外囊泡组白细胞介素1β及白细胞介素6水平降低(P < 0.05)，而白细胞介素10水平升高(P < 0.05)；与含药血清细胞外囊泡组相比，含药血清组白细胞介素6水平升高(P < 0.05)，生理盐水血清细胞外囊泡组白细胞介素1β、白细胞介素6水平升高(P < 0.05)，含药血清组及生理盐水血清细胞外囊泡组白细胞介素10水平降低(P < 0.05)。
2.4 各组RA-FLS整体迁移能力 如图3所示，与正常组相比，模型组细胞划痕愈合率明显升高(P < 0.05)；与模型组相比，含药血清组及含药血清细胞外囊泡组细胞划痕愈合率降低(P < 0.05)；与含药血清细胞外囊泡组相比，含药血清组和生理盐水血清细胞外囊泡组细胞划痕愈合率升高(P < 0.05)。
2.5 各组RA-FLS个体迁移能力及侵袭能力 如图4所示，与正常组相比，模型组迁移细胞数及侵袭细胞数显著增加(P < 0.05)；与模型组相比，含药血清组、含药血清细胞外囊泡组及生理盐水血清细胞外囊泡组迁移细胞数及侵袭细胞数减少(P < 0.001)；与含药血清细胞外囊泡组相比，含药血清组侵袭细胞数增多(P < 0.05)，生理盐水血清细胞外囊泡组迁移细胞数及侵袭细胞数均增多(P < 0.05)。

2.6 各组RA-FLS凋亡情况 如图5所示，正常组镜下可见散在高亮荧光细胞，模型组凋亡细胞几乎不可见；与模型组相比，含药血清组及含药血清细胞外囊泡组凋亡细胞数量明显增多，可见大片圆状或固缩状、团块状结构，且含药血清细胞外囊泡组细胞荧光更为明亮，生理盐水血清细胞外囊泡组视野中偶尔可见个别高亮凋亡细胞，说明含药血清细胞外囊泡组及含药血清组促凋亡的效果高于生理盐水血清细胞外囊泡组。
2.7 各组RA-FLS凋亡相关基因表达 如图6所示，与正常组相比，模型组促凋亡基因Caspase-3、Caspase-9及Bax表达降低(P < 0.05)，抑凋亡基因Bcl-2表达升高(P < 0.05)；与模型组相比，含药血清组、含药血清细胞外囊泡组及生理盐水血清细胞外囊泡组Caspase-3、Caspase-9及Bax表达升高(P < 0.05)，含药血清组及含药血清细胞外囊泡组Bcl-2表达降低(P < 0.05)；与含药血清细胞外囊泡组相比，含药血清组Caspase-3及Caspase-9表达降低(P < 0.05)，生理盐水血清细胞外囊泡组Caspase-3、Caspase-9及Bax表达降低(P < 0.05)，含药血清组和生理盐水血清细胞外囊泡组Bcl-2表达升高(P < 0.05)。
2.8 Western blot检测各组RA-FLS凋亡相关蛋白表达 如图7所示，与正常组相比，模型组促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9及Bax表达降低(P < 0.05)，抑凋亡蛋白Bcl-2表达升高(P < 0.05)；与模型组相比，含药血清组及含药血清细胞外囊泡组Caspase-3、Caspase-9和Bax表达升高(P < 0.05)；与含药血清细胞外囊泡组相比，生理盐水血清细胞外囊泡组Caspase-3、Caspase-9、Bax表达降低(P < 0.05)，Bcl-2表达升高(P < 0.05)。在凋亡相关蛋白的表达上，含药血清细胞外囊泡组的促凋亡作用优于生理盐水血清细胞外囊泡组，验证了凋亡基因表达的结果。

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引言

类风湿关节炎是一种慢性自身免疫性疾病，全球发病率为0.5%-1.0%[1-2]。临床上，类风湿关节炎以关节的长期进行性疼痛、僵硬和肿胀为特点，最终可能导致关节畸形、功能障碍以及终身残疾[3-4]。类风湿关节炎发病机制复杂，包括炎症细胞浸润、滑膜组织增生、软骨损伤和骨侵蚀等[5]，类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells，RA-FLS)的过度增殖与凋亡比例失衡是滑膜组织过度增生的主要原因[6-7]。针对于类风湿关节炎的治疗，目前主要还是以预防为主，早期发病提倡采用各类药物进行综合治疗，以延缓疾病进展程度、减少关节功能损伤和提高患者的生活质量为主。作为传统医学的优势病种，中医药对于类风湿关节炎患者的病情缓解及关节功能维持成效显著。
补益肝肾中药独活寄生汤出自孙思邈的《备急千金药方》，共由15味药物组成，具有“祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血”的作用，是临床治疗“痹症”的经典方剂，常用来治疗椎间盘疾病、膝骨关节炎、骨质疏松症等，尤其是类风湿关节炎。现代药理学研究表明独活寄生汤具有抗炎、镇痛和提高免疫力等作用[8-9]，可缓解滑膜炎症、延缓滑膜组织异常增生及促进滑膜修复，进而维持关节局部稳态，延缓疾病进展[10-11]，但其发挥作用的具体机制还不明确。
细胞外囊泡是双层膜结构囊泡，可以转移包括DNA、mRNA、脂质、代谢物和蛋白质等多种物质[12]。它不仅可以介导不同组织和器官之间的细胞间通讯，还能够调节包括炎症和免疫反应在内的生物过程[13-14]。越来越多的研究表明，细胞外囊泡在骨关节炎、类风湿关节炎等炎症性骨病的发展中起着重要作用[15]，可以作为药物载体参与炎症性骨病的发生和进展，也可以将处理过的细胞外囊泡当做药物发挥疾病调控作用[16]。大量动物、细胞实验表明细胞外囊泡可以显著降低类风湿关节炎大鼠的炎症反应以及修复组织损伤，因此，可将细胞外囊泡作为干预类风湿关节炎相关病理改变的新治疗思路。
基于“整体观”的中医理念，类风湿关节炎患者服用独活寄生汤后可能通过“补肝肾”作用，刺激“肝”“肾”以及功能类似于中医理论“肝肾”的器官产生细胞外囊泡，通过循环到达关节部位，发挥关节局部的免疫调控及治疗作用，达到“强筋骨”的疗效。该实验对独活寄生汤含药血清细胞外囊泡进行富集与纯化，探究其对RA-FLS的作用，以期为细胞外囊泡局部治疗类风湿关节炎提供一定的实验基础，为“补肝肾-强筋骨”的中医理念提供现代医学证据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验，单因素方差分析。
1.2 时间及地点 实验于2023年3-12月在山西中医药大学中西医结合基础实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 第2代RA-FLS由山西中医药大学中西医结合基础实验室提供。
1.3.2 实验动物 20只6-8周龄SPF级健康雌性SD大鼠，体质量(160±10) g，购自北京斯贝福生物科技有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。实验大鼠饲养于山西中医药大学实验动物中心，温度(23±2) ℃，湿度(50±15)%，自由进食、饮水。大鼠适应性饲养1周后开始实验。该实验经山西中医药大学伦理委员会批准，审批号：2022DW066。实验过程遵循国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.3 实验仪器 细胞CO2培养箱(德国WIGGENS；型号：WCI-180)；超净工作台(Boxun；型号：SW-CJ-2D)；倒置荧光显微镜(日本Nikon；型号：Eclipse Ts2R)；电泳仪(美国BIO-RAD；型号：164-5050)；电泳槽(美国BIO-RAD；型号：164-6001)；凝胶成像系统(美国BIO-RAD；型号：ChemiDocTM )；酶标仪(美国Thermo Scientific；型号：1550)；反转录PCR仪(美国Thermo Scientific；型号：ProFlex)；实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Scientific；型号：QuantStudio 5)。
1.3.4 药品与试剂 独活寄生汤共15味药材均购自山西中医药大学国医堂；DMEM高糖(含丙酮酸钠)购自武汉博士德生物工程有限公司(PYG0073)；胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司(11011-8611)；0.25%含EDTA的胰酶购自美仑生物(MA0232)；PBS(1×)缓冲液购自美仑生物(MA0015)；双抗灭菌液(青霉素/链霉素溶液)购自美仑生物(MA0110)；Cell Counting Kit-8试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(AR1160)；Transwell嵌套购自康宁(3422)；锥虫蓝染色细胞存活率检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(AR1175)；无血清非程序细胞冻存液购自美仑生物(MA0405)；Matrigel基质胶购自BD(356234)；组织/细胞RNA快速提取试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司(MF036-01)；Realtime PCR Super mix购自北京聚合美生物科技有限公司(MF013-01)；M5 Super qPCR RT kit with gDNA remover购自北京聚合美生物科技有限公司(MF166-01)；大鼠肿瘤坏死因子α购自PEPROTECH (400-01B-10)；全蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(BC3710)；GAPDH抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司(60004-1-lg)；Caspase-3抗体购自Cell Signaling Technology (9662s)；Caspase-9抗体购自Cell Signaling Technology ( 9508)；Bax抗体购自Abmart(T40051F)；Bcl-2抗体购自Santa(Sc-7382)；大鼠白细胞介素1β试剂盒购自上海酶联生物(ml037373)；大鼠白细胞介素6试剂盒购自上海酶联生物(ml064292)；大鼠白细胞介素10试剂盒购自上海酶联生物(ml037371)；细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒购自碧云天生物试剂有限公司(C0003)。
1.4 实验方法
1.4.1 药物制备 按照《备急千金药方》原方称取中药(独活9 g，桑寄生、杜仲、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防风、川芎、人参、甘草、当归、芍药、干地黄各6 g)，煎煮前蒸馏水浸泡药物30 min，浸泡好的药物放入陶罐中，加入2 000 mL蒸馏水，武火煮沸后文火慢煎约1.5 h，滤出药汁，再次加入500 mL蒸馏水同法煎制，将2次药汁混合后过滤药渣，置于旋转蒸发仪中浓缩为含生药质量浓度1 g/mL的药液，分装封瓶冻存于-20 ℃。
1.4.2 细胞培养 将冻存的RA-FLS(第2代)置于37 ℃水浴锅摇晃迅速解冻，待其完全解冻后加入含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM完全培养基，1 300 r/min离心5 min去除冻存液，弃上清后加入DMEM完全培养基轻柔吹打制成均匀的细胞悬液，接种到培养瓶中，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，定期观察细胞状态，取对数生长期细胞用于实验。
1.4.3 含药血清及细胞外囊泡的制备 将20只SD大鼠随机分为2组，含药血清组灌胃独活寄生汤15.2 g/(kg·d)[17]，生理盐水血清组灌胃等量生理盐水，连续给药7 d，末次给药2 h后异氟烷麻醉，经腹主动脉采血7 mL/只，离心分离血清后放入水浴锅，56 ℃灭活30 min，0.22 μm滤嘴过滤除菌后分装，得到独活寄生汤含药血清和生理盐水血清，-80 ℃保存，后续按实验浓度采用完全培养基稀释。采用细胞外囊泡提取及纯化试剂盒提取独活寄生汤含药血清细胞外囊泡及生理盐水干预血清细胞外囊泡，BCA测得所制备细胞外囊泡质量浓度为4.04 mg/mL。
1.4.4 CCK-8法筛选独活寄生汤含药血清及独活寄生汤含药血清细胞外囊泡干预的最佳浓度及时间 实验分为空白对照组(不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8)、阴性对照组(含细胞的培养基、CCK-8，无待测物质)和实验组(含细胞的培养基、CCK-8、待测物质)。将RA-FLS以1×104 /孔种于96孔板内，待12 h细胞贴壁后，阴性对照组和实验组用10 ng/mL肿瘤坏死因子α刺激24 h进行体外造模[18]，PBS润洗2次后将实验组旧培养基替换为含体积分数5%，10%，20%独活寄生汤含药血清的DMEM完全培养基，分别在培养的12，24，48 h加入CCK-8试剂，避光孵育30 min后检测520 nm处吸光度值，计算细胞抑制率=[(阴性对照组吸光度值-实验组吸光度值)/(阴性对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)×100%][19]。同法检测独活寄生汤含药血清细胞外囊泡干预的最佳质量浓度及时间，将1.4.3所制备的独活寄生汤含药血清细胞外囊泡经完全培养基稀释为10，20，40 ng/mL。
1.4.5 细胞分组 将RA-FLS分为5组：正常组(完全培养基培养，配置比例为：DMEM高糖∶胎牛血清∶双抗=89∶10∶1)；模型组(10 ng/mL肿瘤坏死因子α刺激24 h)；独活寄生汤含药血清组(简称含药血清组，10 ng/mL肿瘤坏死因子α刺激24 h后用体积分数10%含药血清干预24 h)；独活寄生汤含药血清细胞外囊泡组(简称含药血清细胞外囊泡组，10 ng/mL肿瘤坏死因子α刺激24 h后用10 ng/mL含药血清细胞外囊泡干预24 h)；生理盐水血清细胞外囊泡组(10 ng/mL肿瘤坏死因子α刺激24 h后用10 ng/mL生理盐水血清细胞外囊泡干预24 h)。
1.4.6 ELISA法检测RA-FLS上清液中炎症因子水平 取对数生长期细胞以5×104 /孔种于24孔板内，根据细胞分组进行干预，干预结束后留取细胞上清冻存于-80 ℃冰箱。采用ELISA试剂盒检测细胞上清液中白细胞介素1β、白细胞介素6及白细胞介素10水平，按照试剂盒说明书进行操作，设置标准品孔、空白对照孔及实验孔(2个复孔)，在酶标仪450 nm波长处测定吸光度值，绘制标准曲线并计算炎症因子水平。
1.4.7 划痕实验检测RA-FLS整体迁移能力 取对数生长期细胞以2×105 /孔接种于6孔板内，根据细胞分组进行干预，干预结束后用200 μL枪头沿着6孔板十字线划痕，PBS轻柔润洗2次，各孔加入无血清的DMEM高糖培养基，对培养0，24 h的划痕进行拍照(每组选择4个相同位点)，使用Image J软件对划痕面积进行分析，划痕愈合率=[(0 h的划痕面积-24 h的划痕面积)/0 h的划痕面积]×100%[20]。
1.4.8 Transwell法检测RA-FLS个体迁移能力及侵袭能力 取对数生长期细胞以1×105 /孔种于12孔板内，根据细胞分组进行干预，干预结束后用不含血清的DMEM高糖培养基调整细胞浓度为25×107 L-1。将Transwell小室放入24孔板中(侵袭实验时将基质胶和无血清培养基按照1∶8的比例混合均匀，每孔100 μL平铺于上室内，置于37 ℃孵箱待其凝固后使用)，下室加入750 μL DMEM完全培养基，上室加入200 μL细胞悬液，培养24 h后弃旧培养基，在上室及下室分别加入200 μL和750 μL多聚甲醛固定30 min，PBS润洗后上室及下室分别加入200 μL和750 μL甲醇渗透20 min，再用PBS润洗掉多余的甲醇，待小室略风干后使用0.1%结晶紫染色30 min，用PBS洗去多余的结晶紫，并用棉签擦掉上室中未迁移的细胞，待小室风干后显微镜200×镜下随机5个视野进行拍照，使用Image J软件对迁移(或侵袭)细胞的数量进行分析[21]。
1.4.9 Hoechst染色检测RA-FLS凋亡情况 取对数生长期细胞以5×104 /孔种于24孔板内，根据细胞分组进行干预，干预结束后弃旧培养基，每孔中加入500 μL细胞染色缓冲液重悬，加入2.5 μL Hoechst染色液，在4 ℃冰箱避光孵育25 min，用PBS洗去多余的染色液，在倒置荧光显微镜下用蓝色激发光随机选取3个视野进行拍照，观察各组细胞凋亡情况[22]。
1.4.10 qRT-PCR检测RA-FLS凋亡相关基因表达水平 取对数生长期细胞以1×106/皿种于6 cm细胞培养皿内，根据细胞分组进行干预，干预结束后采用细胞RNA快速提取试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测定RNA浓度及纯度，经M5 Super qPCR RT kit with gDNA remover反转录得到cDNA，随后进行扩增，通过2-∆∆Ct法计算各基因的表达量。所测基因的引物均由生工生物技术公司合成，见表1。

1.4.11 Western blot检测RA-FLS凋亡相关蛋白表达水平 取对数生长期细胞以1×106/皿种于6 cm培养皿内，根据细胞分组进行干预，干预结束后采用全蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度并用裂解液将各组蛋白浓度调平，通过十二烷基硫酸钠将蛋白进行变性后储存于-80 ℃，随后进行SDS-PAGE凝胶电泳，12.5%的浓缩胶80 V电泳15 min后转120 V电泳35 min，280 mA湿转35 min将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST清洗后将PVDF膜与Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9一抗(稀释比例为1∶1 000)和GAPDH一抗(稀释比例为1∶15 000)在4 ℃孵育过夜，TBST清洗后与相应二抗室温孵育2 h，TBST清洗后使用超敏ECL即用型发光底物显色，采用化学发光凝胶成像系统进行成像和拍照，以GAPDH作为内参，通过Image J软件对灰度值进行分析。

1.5 主要观察指标 ①CCK-8检测独活寄生汤含药血清及其细胞外囊泡作用于RA-FLS的最佳浓度及时间；②ELISA检测RA-FLS上清中白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素10水平；③划痕实验检测RA-FLS迁移能力；④Transwells实验检测RA-FLS迁移能力及侵袭能力；⑤Hoechst染色检测RA-FLS凋亡现象；⑥qRT-PCR检测凋亡基因Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2表达；⑦Western blot检测凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2表达。

1.6 统计学分析 所有数据分析均使用GraphPadPrism 6.0和SPSS 21.0软件。数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间比较采用SNK检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过山西中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

类风湿关节炎是一种慢性疾病，主要以持续性滑膜组织增生、多发性关节炎和进行性骨和软骨变性为特征[23]。滑膜组织在类风湿关节炎患者免疫反应的启动和进展中起着关键作用[24]。健康的滑膜细胞形成滑膜下层，并与常驻的巨噬细胞产生独特的内衬，以维持滑膜的生理功能[25]。RA-FLS表现出类似肿瘤的生物学行为，如快速增殖、迁移和侵袭能力增强，以及抵抗凋亡、诱导滑膜增生，并驱动致病性炎症递质的产生，促进局部炎症、软骨侵袭和降解，最终导致关节功能丧失[26-28]。RA-FLS的增殖与凋亡失衡是类风湿关节炎发生发展的重要原因之一，对RA-FLS增殖与凋亡状态的调控是治疗类风湿关节炎的新思路[29]。采用体外肿瘤坏死因子α刺激RA-FLS，更接近体内的炎性刺激环境[30]，CCK-8实验结果表明肿瘤坏死因子α刺激可促进RA-FLS增殖，独活寄生汤含药血清及其细胞外囊泡干预可抑制RA-FLS增殖。独活寄生汤含药血清及其细胞外囊泡可通过调节RA-FLS的增殖与凋亡平衡状态，延缓类风湿关节炎进程。
独活寄生汤是临床用于治疗久痹导致肝肾两虚、气血不足的常用方[31]。大多由于机体正气不足，适时感受外邪而患痹证，日久邪气入里侵及人体根本，累及肝肾，耗损气血所成[32]。外来邪气客于肢体关节，阻塞经络，以致气血运行不畅，不通则痛，故见肢体疼痛或红肿，日久则关节僵硬、活动受限[33]。此类证型为正虚邪实，治宜扶正与祛邪兼顾，在祛散外邪的同时补益肝肾气血[34]。
许多学者对独活寄生汤治疗类风湿关节炎的机制和临床疗效进行了研究，结果表明独活寄生汤能够减少RA-FLS的炎症递质产生，抑制其恶性增殖，促进其凋亡[35-36]。ELISA检测结果表明，独活寄生汤含药血清、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡及生理盐水血清细胞外囊泡均可抑制RA-FLS的炎症反应，降低促炎因子白细胞介素1β及白细胞介素6水平，增加抑炎因子白细胞介素10水平。白细胞介素1β和白细胞介素6是类风湿关节炎发病过程中的关键致炎因子，具有刺激滑膜细胞、骨细胞增殖分化的潜能，同时也是多个炎症通路的关键激活因子[37-38]。而白细胞介素10是类风湿关节炎发生发展过程中的保护性因子，能够抑制促炎因子的合成，减少淋巴细胞浸润以及巨噬细胞活化，从而降低炎症水平[39]。
在细胞凋亡过程中Caspase起着至关重要的作用，细胞凋亡本质是Caspase家族不可逆的有限水解底物的级联扩增反应[40]。细胞凋亡是由配体和受体相互作用引起的，这种相互作用受到高度调控，并与发生凋亡的细胞吞噬作用紧密耦合[41]。细胞凋亡参与类风湿关节炎的进展，其机制包括RA-FLS的形成和存活增加，凋亡抵抗增强和异常增殖。Caspase-9作为细胞凋亡的关键启动因子，首先启动其自身的同源激活，通过异源激活水解下游的Caspase，放大凋亡信号，同时将死亡信号向下传递，最终完成整个凋亡过程[42]。Caspase被激活后，细胞内死亡过程被启动，Caspase-3是执行下游细胞凋亡过程的最终效应酶[43]。此外，Bcl-2家族在细胞凋亡过程中也起着重要作用[44]。Bcl-2家族包括两类，以Bcl-2为代表的抗凋亡基因和以Bax为代表的促凋亡基因。Bax除自身的促凋亡作用外，还可通过与Bcl-2联合形成二聚体，抑制Bcl-2的抗凋亡作用[45]。qRT-PCR和Western blot结果表明独活寄生汤含药血清、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡及生理盐水血清细胞外囊泡可增加促凋亡因子Caspase-3、Caspase-9、Bax表达，降低抑凋亡因子Bcl-2表达，独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对凋亡基因Caspase-3及Caspape-9的调节作用优于含药血清及生理盐水血清细胞外囊泡，而独活寄生汤含药血清及独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对于Bax及Bcl-2表达的调节作用无差异，可能是由于独活寄生汤含药血清中含有部分细胞外囊泡，因此能在实验过程中对RA-FLS产生刺激，产生与独活寄生汤含药血清细胞外囊泡相同的作用。独活寄生汤含药血清细胞外囊泡可激活细胞凋亡进程，Caspase-9是其调节凋亡的关键因子，通过Caspase-9激活Caspase家族，发挥Caspase-3凋亡执行作用，作用于Bax及Bcl-2等凋亡因子，调控凋亡因子参与的相关生物学过程，促进RA-FLS凋亡、抑制过度增殖，从而达到对于类风湿关节炎的治疗作用，说明独活寄生汤含药血清细胞外囊泡可作为独活寄生汤的媒介单独影响RA-FLS的凋亡过程。
划痕实验常用来检测细胞的迁移能力，依据细胞体外培养时单层生长特性，在均匀生长的细胞中间制造一个无细胞的“划痕”，观察划痕周围细胞向划痕内生长的情况，以细胞覆盖划痕的速度和密度判断其整体迁移能力。Transwell实验可对特定环境下细胞迁移能力及侵袭能力进行测定，迁移实验通常采用双层的培养小室，小室中间通过聚碳酸酯膜隔开，上室为实验细胞，下室为高营养的培养液或可诱导细胞移动的物质，统计穿过膜的细胞数量判定细胞的个体迁移能力；迁移实验是在聚碳酸酯膜上覆盖特定的物质(如基质胶)模拟体内环境，统计穿过膜的细胞数量判定细胞的个体侵袭能力。此次实验采用划痕实验及Transwell实验检测细胞的群体迁移能力、个体迁移能力及侵袭能力，更能全面反映对细胞迁移及侵袭的影响。结果表明，独活寄生汤含药血清、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡及生理盐水血清细胞外囊泡均可抑制RA-FLS的迁移及侵袭能力，独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对RA-FLS的抑制作用优于独活寄生汤含药血清及生理盐水血清细胞外囊泡。RA-FLS的增殖能力与侵袭能力增强是类风湿关节炎持续进展及病情恶化的重要原因，独活寄生汤含药血清细胞外囊泡可抑制RA-FLS的增殖与侵袭，阻断其对关节结构和功能的破坏，延缓类风湿关节炎病情进展及恶化。
综上所述，独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对RA-FLS的干预作用优于独活寄生汤含药血清及生理盐水血清细胞外囊泡，故独活寄生汤含药血清细胞外囊泡可作为独活寄生汤在体内的信息载体，通过促进RA-FLS凋亡，抑制其过度增殖来达到对于类风湿关节炎的干预及治疗作用。另外，研究仍存在一些局限性，独活寄生汤含药血清细胞外囊泡作用于RA-FLS的机制尚未可知。实验后期将对以上不足继续探究，以期为类风湿关节炎的治疗提供一种新的方法，为“补肝肾-强筋骨”的中医理念提供一定实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的影响

Effects of extracellular vesicles treated with Duhuo Jisheng Decoction on rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells

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