负载骨形态发生蛋白2水凝胶诱导牙髓干细胞的成骨分化

doi:10.12307/2025.449

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (16): 3301-3310.doi: 10.12307/2025.449

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负载骨形态发生蛋白2水凝胶诱导牙髓干细胞的成骨分化

伊斯拉尔古丽·麦麦提1，贾森2，刘佳1，3

1新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)儿童口腔科-口腔预防科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2西安医学院口腔医学院，陕西省西安市 710021；3新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2024-04-22 接受日期:2024-06-28 出版日期:2025-06-08 发布日期:2024-09-02
通讯作者: 刘佳，博士，主任医师，副教授，硕士生导师，新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院) 儿童口腔科-口腔预防科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:Liu Jia, MD, Chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Children’s Stomatology-Department of Stomatological Prevention, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (Affiliated Stomatological Hospital), Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Uyghur Autonomous Region Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
基金资助:
陕西省青年创新团队建设科研计划项目(21JP111)，项目负责人：贾森

Bone morphogenetic protein 2-loaded hydrogel induces osteogenic differentiation of dental pulp stem cells

Israrguli · Maimeti1, Jia Sen2, Liu Jia1, 3

1Department of Children’s Stomatology-Department of Stomatological Prevention, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (Affiliated Stomatological Hospital), Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2School of Stomatology, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, Shaanxi Province, China; 3Xinjiang Uyghur Autonomous Region Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2024-04-22 Accepted:2024-06-28 Online:2025-06-08 Published:2024-09-02
Contact: 伊斯拉尔古丽·麦麦提，女，1997年生，新疆维吾尔自治区喀什市人，维吾尔族，新疆医科大学在读硕士，主要从事儿童口腔学及牙齿再生方向的研究。
About author:Israrguli · Meimeti, Master candidate, Department of Children’s Stomatology-Department of Stomatological Prevention, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (Affiliated Stomatological Hospital), Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
Shaanxi Provincial Youth Innovation Team Building Scientific Research Program, No. 21JP111 (to JS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
牙髓干细胞：是来源于神经脊的间充质细胞，具有易获取、易培养、低免疫原性等特点，具有高度增殖能力和多向分化潜能，是目前组织再生应用最广泛的干细胞之一。
骨形态发生蛋白2：是转化生长因子β超家族成员之一，具有诱导未分化间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力，促进成骨细胞分化成熟，参与骨和软骨生长发育及其重建过程，进而加速骨缺损的修复。

背景：前期研究证明，甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质复合水凝胶支架可促进人牙髓干细胞的增殖及分化。水凝胶负载骨形态发生蛋白2被认为是骨修复中有前景的材料。
目的：观察负载不同质量浓度骨形态发生蛋白2的甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质复合水凝胶对人牙髓干细胞成骨向分化的诱导作用。
方法：制备含0，50，100，200 µg/mL骨形态发生蛋白2的甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质复合水凝胶，分别记为GelMA/TDM、BMP-2(50 ng/mL)GelMA/TDM、BMP-2(100 ng/mL)GelMA/TDM、BMP-2(200 ng/mL)GelMA/TDM，检测复合水凝胶对骨形态发生蛋白2的体外缓释性能。采用改良组织块酶消化法提取人牙髓干细胞，分别接种于4种水凝胶表面，采用CCK-8法检测细胞增殖，DAPI染色检测细胞黏附；对各组水凝胶表面的人牙髓干细胞进行成骨诱导，进行碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性检测与茜素红染色，采用RT-PCR法检测相关成骨基因(Runx2、骨形态发生蛋白2、骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原)表达。
结果与结论：①甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质复合水凝胶可持续释放骨形态发生蛋白2长达21 d，在第3-6天释放较快，第6天之后释放趋于平稳；②4种水凝胶均可促进人牙髓干细胞的增殖，其中以BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶的作用最明显；相较于GelMA/TDM复合水凝胶，BMP-2-GelMA/TDM复合水凝胶可促进人牙髓干细胞的黏附，其中以BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶的作用最明显；③相较于GelMA/TDM复合水凝胶，BMP-2-GelMA/TDM复合水凝胶可提升碱性磷酸酶活性、钙结节含量与相关成骨基因表达，综合分析显示BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶的作用更明显；④结果表明，BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶促进牙髓干细胞成骨向分化的能力更明显。
https://orcid.org/0009-0001-3375-6520 (伊斯拉尔古丽·麦麦提)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 人牙髓干细胞, 骨形态形成蛋白2, 细胞增殖, 细胞分化, 组织工程, 牙髓-牙本质再生

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have shown that gelatin modified by methacrylic anhydride (GelMA)/treated dentin matrix (TDM) composite hydrogel scaffolds can promote the proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells. Hydrogels loaded with bone morphogenetic protein 2 are considered to be promising materials for bone repair.
OBJECTIVE: To observe the effect of GelMA/TDM composite hydrogels loaded with different concentrations of bone morphogenetic protein-2 on the induction of osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells.
METHODS: GelMA/TDM composite hydrogels containing 0, 50, 100, and 200 μg/mL bone morphogenetic protein 2 were prepared, denoted as GelMA/TDM, bone morphogenetic protein-2 (50 ng/mL) GelMA/TDM, bone morphogenetic protein-2 (100 ng/mL) GelMA/TDM, and bone morphogenetic protein-2 (200 ng/mL) GelMA/TDM, respectively, and the in vitro sustained release of bone morphogenetic protein 2 from the composite hydrogels was detected. Human dental pulp stem cells were extracted by the modified tissue block enzymatic digestion method and seeded on the surfaces of the four kinds of hydrogels. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay and cell adhesion was detected by DAPI staining. Human dental pulp stem cells on the surfaces of each group of hydrogels were induced to osteoblastically, and alkaline phosphatase staining, alkaline phosphatase activity detection, and alizarin red staining were performed. RT-PCR was used to detect the expression of related osteogenic genes (Runx2, bone morphogenetic protein 2, osteopontin, osteocalcin, and type I collagen).
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The GelMA/TDM composite hydrogel could continuously release bone morphogenetic protein 2 for up to 21 days, with a faster release from day 3 to day 6 and a steady release after 6 days. (2) All four kinds of hydrogels could promote the proliferation of human dental pulp stem cells, among which the bone morphogenetic protein-2 (100 ng/mL)-GelMA/TDM composite hydrogel had the most obvious effect. Compared with the GelMA/TDM composite hydrogel, the bone morphogenetic protein-2-GelMA/TDM composite hydrogel could promote the adhesion of human dental pulp stem cells, among which the bone morphogenetic protein-2 (200 ng/mL)-GelMA/TDM composite hydrogel had the most obvious effect. (3) Compared with the GelMA/TDM composite hydrogel, the bone morphogenetic protein-2-GelMA/TDM composite hydrogel could increase the activity of alkaline phosphatase, the content of calcium nodules, and the expression of related osteogenic genes. Comprehensive analysis showed that the effect of the bone morphogenetic protein-2 (100 ng/mL)-GelMA/TDM composite hydrogel was more obvious. (4) The results show that the bone morphogenetic protein-2 (100 ng/mL)-GelMA/TDM composite hydrogel has a more obvious ability to promote the osteogenic differentiation of dental pulp stem cells.

Key words: human dental pulp stem cell, bone morphogenetic protein-2, cell proliferation, cell differentiation, tissue engineering, pulp-dentin regeneration

中图分类号:

伊斯拉尔古丽·麦麦提, 贾森, 刘佳. 负载骨形态发生蛋白2水凝胶诱导牙髓干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(16): 3301-3310.

Israrguli · Maimeti, Jia Sen, Liu Jia. Bone morphogenetic protein 2-loaded hydrogel induces osteogenic differentiation of dental pulp stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(16): 3301-3310.

图/表（结果） 11

2.1 人牙髓干细胞培养与鉴定结果分离的牙髓组织通过改良组织块酶消化法接种5 d后，倒置显微镜下可观察有细胞从组织块周围爬出，以组织块为中心，呈放射状生长，细胞形态均一，呈长梭形；传代后 3代镜下可见细胞形态呈成纤维细胞样，较均一，呈放射状或者漩涡状生长。原代与第3代人牙髓干细胞的形态见图1。第 3代人牙髓干细胞高表达CD29(99.76%)、CD105(95.53%)，低表达CD34(0.10%)、CD45(0.11%)，见图2。

2.2 复合水凝胶人牙髓干细胞增殖的影响 CCK-8 检测结果显示，相同培养时间下，各复合水凝胶组细胞增殖吸光度值均高于空白对照组(P < 0.05，P < 0.005，P < 0.000 1)，其中以BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM作用最明显，见图3。

2.3 复合水凝胶人牙髓干细胞黏附的影响人牙髓干细胞在各组复合水凝胶表面的黏附情况，见图4A。定量分析结果显示，共培养4，24 h，BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶表面细胞黏附数量最多，与其他组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4B。

2.4 复合水凝胶人牙髓干细胞成骨向分化的影响
2.4.1 各组碱性磷酸酶染色结果随着诱导时间的延长，各组碱性磷酸酶染色强度增强，诱导 7，14 d后，BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM组碱性磷酸酶染色强度明显高于其他4组，见图5。

2.4.2 各组碱性磷酸酶活性定量检测结果诱导1 d后，BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM组碱性磷酸酶活性高于GelMA/TDM(P < 0.05)；诱导4，7，10，14 d后，BMP-2(50 ng/mL)-GelMA/TDM组、BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM组、BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM组碱性磷酸酶活性均高于GelMA/TDM组(P < 0.05，P < 0.005，P < 0.000 1)；诱导7，10，14 d后，BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM组碱性磷酸酶活性高于BMP-2(50 ng/mL)-GelMA/TDM组、BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM组(P < 0.05)，见图6。

2.4.3 各组茜素红染色和半定量检测结果钙结节形成为评价细胞成骨晚期的标志。诱导14 d后，茜素红染色结果显示，BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM组钙结节含量最多，其次为BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM组；诱导21 d后，BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM组钙结节含量最多，其次为BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM组，见图7A，B。茜素红染色定量分析结果显示，空白对照组诱导14，21 d后的钙结节含量低于其他4组(P < 0.000 1)，BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM组诱导14 d后的钙结节含量高于GelMA/TDM组、BMP-2(50 ng/mL)-GelMA/TDM 组、BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM组(P < 0.05)，BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM 组诱导21 d后的钙结节含量高于GelMA/TDM组、BMP-2(50 ng/mL)-GelMA/TDM组、BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM组(P < 0.05)，见图7C。

2.4.4 各组成骨相关基因表达检测结果诱导7 d后RT-PCR检测结果显示，与空白对照组比较，其他4组的碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、骨钙素、Runx2 mRNA表达均升高(P < 0.05，P < 0.005，P < 0.000 1，P < 0.000 01)；BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM组碱性磷酸酶mRNA表达高于GelMA/TDM组、BMP-2(50 ng/mL)-GelMA/TDM组、BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM组(P < 0.000 01)，BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM组骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、骨钙素、Runx2 mRNA表达均高于GelMA/TDM组、BMP-2(50 ng/mL)-GelMA/TDM组、BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM组(P < 0.05，P < 0.005，P < 0.000 1，P < 0.000 01)，见图8。

2.5 复合水凝胶扫描电镜观察结果扫描电镜下可见BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM及GelMA/TDM复合水凝胶的结构呈“蜂窝状”，如图9所示，孔径大小分别为 (213.703±20.128) μm和(242.137±30.885) μm，两组水凝胶间孔径比较差异无显著性意义(t=1.336，P=0.2525)。

2.6 BMP-2从BMP-2-GelMA/TDM复合水凝胶中的释放结果 BMP-2从BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM与GelMA/TDM 复合水凝胶中的释放结果，如图10，表2所示。随着时间的延长，BMP-2在两种复合水凝胶中总体呈现出先快后慢的释放趋势，其中第3-6天释放相对较快，此后 BMP-2释放相对较缓，在第21天，BMP-2在BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶中累计释放率为(84.38±1.70)%，明显高于GelMA/TDM复合水凝胶(P < 0.001)。

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引言

龋病、牙创伤等可能引起牙髓损伤[1]。目前如何促进牙髓的再生并形成修复性牙本质成为了临床研究的热点问题。随着组织工程技术的发展，牙髓再生取得突破性进展。组织工程技术将细胞和生物活性材料相结合，构建细胞-生物材料复合体并移植到体内或体外特定部位，从而维持、修复、再生损伤组织和器官[2-3]。干细胞、支架材料和生长因子是目前组织工程领域的3大组成成分[4]，其中干细胞及生物支架材料是骨组织工程的核心。牙髓干细胞作为干细胞当中分化潜能最大的细胞之一[5]，最早被GRONTHOS等分离[6]，具有极强的增殖、成骨、成牙本质、成脂肪、成软骨及神经分化等能力。骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)作为BMPs家族中最具活性的信号蛋白之一[7-8]，能诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化。然而，传统的大剂量注射BMP-2存在半衰期较短、稳定性差、价格昂贵、易降解等问题[9]，
因此，选用合适的载体缓释BMP-2成为解决上述问题的方法之一。水凝胶作为物理或化学交联的三维亲水聚合物网络结构[10]，在搭载细胞、生物因子及构建组织支架等方面表现出良好的临床应用前景[11-12]。
三维支架材料在牙髓再生中能为细胞提供黏附、增殖和迁移的场所，可以通过不同材料特性达到控释细胞因子的作用，这样有助于细胞的成血管化和成牙本质分化[13]。多数研究显示，水凝胶负载BMP-2是骨修复中有前景的材料[14]。甲基丙烯酸酐改性明胶
(gelatin modified by methacrylic anhydride，GelMA)水凝胶性能优异[15-16]、生物相容性良好，不仅可容纳细胞，还可提供细胞生长的特殊类基质环境，能高效传送细胞所需的养分。经处理牙本质基质(treated dentin matrix，TDM)是一种脱矿牙本质粉，在基础实验和临床试验中均表现出骨诱导能力[17]。研究证明，脱矿牙本质粉可以为牙本质再生提供支架和诱导微环境，并进一步分化为牙髓-牙本质复合体，有助于修复损伤牙髓[18]。课题组前期研究证明，GelMA/TDM复合水凝胶可促进人牙髓干细胞的增殖及分化，并且GelMA与TDM质量比为1 ∶ 2 时复合水凝胶具有更优的生物活性和生物相容性[19]。此次实验主要探究负载不同质量浓度BMP-2的GelMA/TDM复合水凝胶对人牙髓干细胞增殖、成骨分化的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验，组间比较采用方差分析或t检验，组间两两比较采用tukey’s Honestly Significant Difference(HSD)测试法。
1.2 时间及地点实验于2023年10月至2024年4月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心干细胞实验室完成。
1.3 材料 α-MEM培养液(Hyclone，美国)；优等胎牛血清(BI，以色列)；0.25%胰蛋白酶(Gibco 公司，美国)；CCK-8(Dojindo，日本)；甲基丙烯酸酐明胶(阿拉丁，美国)；骨形态发生蛋白2(MCE，中国)；RT-PCR试剂盒(QIAGEN，德国)；鼠抗人CD34-FITC、Mouse Anti-Human CD45-FITC、鼠抗人CD29-FITC、鼠抗人CD105-FITC(BioLegend公司，美国)；流式细胞仪(DXflex，贝克曼)；正置倒置一体荧光显微镜(Revolve FL，美国)；DAPI染色液(索莱宝，中国)；引物序列(上海生物工程公司，中国)；反转录试剂盒(Takara，日本)；人相关干细胞成骨诱导分化试剂盒(Cyagen，美国)；碱性磷酸酶染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；茜素红染色液(索莱宝，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 人牙髓干细胞的分离与培养[9] 收集新疆医科大学第一附属医院口腔颌面外科门诊因阻生或者正畸而拔除的新鲜完整第三磨牙或前磨牙，供者年龄12-20岁，供者及家属对实验知情同意并签署了知情同意书。实验方案已通过新疆医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准，伦理审批号：K202311-17。
收集到的牙齿在1 h内转移到无菌实验环境中，用含有1%双抗的PBS冲洗3次；劈开牙冠，取出牙髓，用眼科剪剪去根尖约2 mm组织；将剩余牙髓组织浸泡于含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基中，剪碎牙髓组织，转移至含有3 mg/mLⅠ型胶原酶和 4 mg/mL中性蛋白酶的离心管中，37 ℃水浴消化30 min；1 000 r/min离心 5 min，弃上清，加入α-MEM培养液重悬细胞，接种于培养瓶中；将培养瓶置于37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中培养，每3 d换液1次。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，待细胞生长融合至培养瓶底约80%时加入0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。
1.4.2 人牙髓干细胞的鉴定取生长状态良好、细胞形态正常的第3代人牙髓干细胞，用0.25%胰酶消化细胞，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清，用PBS重悬，调整细胞浓度为 1×109 L-1，制备成单细胞悬液。根据试剂操作说明依次加入CD34、CD45、CD29、CD105抗体，避光孵育
30 min，用PBS洗涤除去未结合抗体，用PB重悬细胞，上流式细胞仪进行检测分析。
1.4.3 BMP-2-GelMA/TDM复合水凝胶的制备参考前期研究方法制备GelMA/TDM复合水凝胶[18]。
制备含不同质量浓度BMP-2的GelMA/TDM复合水凝胶：将10 µg BMP-2 冻干粉溶于1 mL醋酸溶液中，配制10 μg/mL BMP-2溶液。取20 μL BMP-2溶液加入到1 mL α-MEM培养液中，配制200 ng/mL BMP-2培养液，并加入GelMA/TDM复合水凝胶溶液中，避光条件下用波长为405 nm的蓝光光源手电筒照射1 min 成胶，得到BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶。按照等比稀释法配制得到BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM及BMP-2(50 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶。
1.4.4 复合水凝胶对人牙髓干细胞增殖的影响将4种复合水凝胶分别加入24孔板中，每孔1 mL；将1 mL生长状态良好的第4代人牙髓干细胞悬液接种于各复合水凝胶表面，细胞浓度为1×108 L-1，以未加入复合水凝胶的细胞为空白对照，每组6孔，各组平行，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。培养1，3，5，7 d后，弃原培养基，用PBS充分清洗3次，每孔加入1 mL CCK-8检测试剂37 ℃下孵育 2 h，用移液枪将每孔100 μL上清液转移到96孔板中，在 50 nm波长处测定吸光度值，绘制细胞生长曲线。
1.4.5 复合水凝胶对人牙髓干细胞黏附的影响将4种复合水凝胶分别加入24孔板中，每孔1 mL；将生长状态良好的第4代人牙髓干细胞接种于各复合水凝胶表面，细胞密度为1×105/孔，每组 6 孔，各组平行，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。培养4，24 h后，加入DAPI染色液孵育10 min，荧光倒置显微镜下观察水凝胶表面的细胞黏附。通过Aipathwell软件计数黏附细胞数量。
1.4.6 复合水凝胶对人牙髓干细胞成骨向分化的影响
实验分组与处理：将4种复合水凝胶分别加入6孔板中，每孔1 mL；将第4代人牙髓干细胞接种于各复合水凝胶表面，细胞密度为1×105/孔，以未加入复合水凝胶的细胞为空白对照，每组 6 孔，各组平行，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。观察细胞贴壁后更换为成骨诱导液，每3 d换液1次。
碱性磷酸酶染色：成骨诱导7，14 d后，弃孔内培养基，用PBS冲洗3次，使用4 ℃预冷40 g/L多聚甲醛室温固定1 h，用纯水冲洗3次，用碱性磷酸酶染色液避光染色30 min，使用纯水洗涤终止染色。倒置显微镜下观察碱性磷酸酶染色情况并拍摄图片。
碱性磷酸酶活性检测：成骨诱导 1，4，7，10，14 d后，用PBS冲洗1次，用0.1%TritonX-100裂解细胞膜片，反复吹打1 min。按碱性磷酸酶活性检测试剂盒说明进行操作，测定405 nm波长下吸光度值。
茜素红染色：成骨诱导14，21 d后，用PBS冲洗3次，40 g/L多聚甲醛室温固定1 h，弃固定液后用纯水冲洗，加入茜素红染色液反应30 min，弃染液后用纯水冲洗，直至清亮为止，显微镜下观察钙结节形态并拍照。同时，每孔加入 1 mL 10%氯化十六烷基吡啶溶液，置于水平摇床溶解1 h，溶解被染色的钙结节，然后吸取100 μL转移至96孔板中，于562 nm 波长处测定吸光度值。

RT-PCR检测成骨相关基因表达：成骨诱导7 d后，采用Trizol法裂解各组细胞，提取各组总RNA，然后反转录获得cDNA，进行PCR扩增反应：95 ℃预变形3 min，95 ℃变形10 s，60 ℃退火延伸25 s，40个循环，使用RT-PCR试剂盒检测相关成骨基因(Runx2、碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原)的表达量，引物序列见表1。最后将得到的CT值通过2-ΔΔCt法计算相对基因表达量并进行统计学分析。实验重复检测3次。

1.4.7 复合水凝胶的微观形貌通过上述实验得到负载BMP-2质量浓度最佳的GelMA/TDM复合水凝胶与GelMA/TDM水凝胶，置于-20 ℃放置24 h，置于-80 ℃冻干48 h，取出并切片，厚度为 1 mm，喷金后扫描电镜下观察水凝胶微观形貌。使用Image-Pro Plus 6.0软件测量水凝胶孔径。
1.4.8 复合水凝胶中BMP-2的释放将BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM，GelMA/TDM复合水凝胶分别置于24孔板内，每孔1 mL，每孔加入1 mL 1×PBS (pH=7.4)并用膜封闭好，每组6孔，各组平行，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中。于设定的时间点收集PBS，并补充对应体积的PBS，采用 BMP-2 ELISA试剂盒测量检测收集液中BMP-2水平，计算累计释放率。
1.5 主要观察指标负载不同质量浓度BMP-2的GelMA/TDM复合水凝胶对人牙髓干细胞成骨向分化的诱导
作用。
1.6 统计学分析采用SPSS 26.0统计软件对数据进行整理和分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析或t检验，组间两两比较采用tukey’s Honestly Significant Difference (HSD)测试法。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经新疆医科大学生物统计学专家审核。

讨论

如何重建牙髓组织的形态与功能、形成修复性牙本质、提高牙髓再生治疗效果一直是临床医生所追求的目标。近年来，口腔医学工作者将材料学和组织工程学理论技术引入牙髓再生研究中。牙髓再生的效果由干细胞、生长因子和生物支架等组织工程3大要素共同决定[20-21]。选获取来源丰富且具有成牙/成血管潜能的种子细胞，使其在适宜的微环境下发育、分化，是最终实现牙髓组织再生的关键[13]。人牙髓干细胞取材简单、来源广泛，具有较强的分化潜能和自我更新能力[22]，也是组织工程最有前景的种子细胞。生长因子作为组织工程构成要素之一，不仅可以调节细胞活性，而且是前成骨细胞向成骨细胞分化增殖的必要因素。BMP-2作为骨形态发生蛋白家族中最有效的骨诱导剂之一，既可参与骨的生成与修复，又可异位诱导骨生成[23-24]。BMP-2通过增加Ⅰ型胶原的合成和骨钙素等基因的表达进而高效地促进骨组织形成[25]。研究表明，BMP-2对人牙髓干细胞有较强的骨诱导作用[26]。CHO等[27]证明应用BMP-2或其下游转录因子的激活因子，可通过上调牙本质涎磷蛋白基因的表达来增强再生牙本质桥的形成。虽然成骨向分化通常需要高剂量的BMP-2，但是减少BMP-2的剂量是可以避免各种不良反应的有效手段，例如炎症、异位成骨等。水凝胶具有三维网状结构，能够模拟细胞所处的三维微环境并参与信号分子释放，利于细胞增殖及分化[28-29]。目前水凝胶已被应用于皮肤、肝脏、血管、软骨、骨及肌肉组织等再生研究中。GelMA水凝胶的降解性能优、力学性能可控、生物相容性好，可促进人牙髓干细胞的附着和增殖[30-31]。TDM作为干细胞的生物活性支架，不仅可诱导干细胞形成牙体组织，而且能够促进细胞的黏附、生长、迁移、分化和组织再生[32-33]。有研究证明，TDM保留了牙本质的物理特性及细胞外基质蛋白，除含有BMP-2外，还含有骨桥蛋白、骨钙素、牙本质唾液蛋白等牙本质生成相关蛋白[34]，这些特异性蛋白能够诱导牙髓干细胞成骨向分化。课题组前期已经证明GelMA与TDM质量比为1∶2的复合水凝胶可促进牙髓干细胞的增殖及分化，该复合水凝胶不仅具有良好的生物相容性、孔隙率、机械强度及生物学性能，而且具有促进干细胞活性与特异性分化的能力[19]。GelMA/TDM复合水凝胶溶液与BMP-2光交联形成复合水凝胶后逐步释放BMP-2，可协同刺激牙髓组织的再生，起到修复成骨的作用。
BMP-2发挥生物效应很大程度上受其浓度影响，为了明确负载不同质量浓度BMP-2-GelMA/TDM复合水凝胶对牙髓干细胞成骨向分化和细胞增殖作用，此次实验将人牙髓干细胞与负载不同质量浓度BMP-2的GelMA/TDM复合水凝胶共培养，CCK-8细胞增殖检测结果显示，BMP-2-GelMA/TDM以及GelMA/TDM复合水凝胶均无细胞毒性(0-200 ng/mL)，并且BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶促进细胞增殖最明显。细胞黏附是细胞迁移、增殖、分化的前提。通过细胞黏附实现细胞相互之间、细胞与细胞外基质之间的信息交流，对于细胞维持形态结构与功能具有重要意义，黏附细胞数量也影响后续的成骨分化。细胞黏附实验结果显示，DAPI染色4，24 h，BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶组细胞黏附数量最多，细胞黏附呈BMP-2质量浓度及时间依赖性。碱性磷酸酶为成骨细胞开始分化的重要标志。此次实验碱性磷酸酶活性检测结果显示，随着诱导时间的延长，碱性磷酸酶活性升高，并且BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶组成骨诱导第7，10，14天的碱性磷酸酶活性高于其他组。钙结节是成骨成熟的标志，通过检测矿化结节含量可以分析成骨分化程度。茜素红染色结果表明，BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶组钙结节含最多，BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶组钙结节含量次之，定量分析同样印证了上述结果。 Runx2、碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原基因是衡量成骨不同阶段的重要指标。此次实验结果显示，成骨诱导培养第7天，与空白对照组及GelMA/TDM水凝胶相比，BMP-2-GelMA/TDM复合水凝胶组Runx2、碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原基因表达升高，说明加入BMP-2可以明显的升高GelMA/TDM复合水凝胶的成骨活性，并且以BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶组Runx2、骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原mRNA表达最高。
经过以上实验，确定了当负载BMP-2的质量浓度为100 ng/mL时GelMA/TDM复合水凝胶的促成骨分化能力最佳。为了明确复合水凝胶的孔径，对GelMA/TDM和BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶进行扫描电镜观察，显示两组复合水凝胶孔径无明显差异。对比两组复合水凝胶的体外缓释性能，发现BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶可更好地释放BMP-2，人牙髓干细胞在BMP-2的持续作用下增殖、成骨分化，最终实现新骨生长。
结论：实验结果表明，BMP-2质量浓度为100 ng/mL时BMP-2-GelMA/TDM复合水凝胶促进牙髓干细胞增殖及成骨向分化的能力最佳，该复合水凝胶在基于牙髓干细胞的牙髓-牙本质再生方面可能具有很好的应用价值。接下来通过动物体内实验来探究BMP-2-GelMA/TDM复合水凝胶的免疫原性以及促进体内干细胞成骨分化的具体机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

负载骨形态发生蛋白2水凝胶诱导牙髓干细胞的成骨分化

Bone morphogenetic protein 2-loaded hydrogel induces osteogenic differentiation of dental pulp stem cells

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