在脂多糖诱导的炎症条件下，整体上，与不同质量浓度奥硝唑直接共培养后，人脐静脉内皮细胞中血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长的 mRNA 表达上调 ( 图4C，D)。共培养 1 d，与对照组比较，1-8 μg/mL 奥硝唑组血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子 mRNA表达均升高 (P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，P < 0.000 1)；共培养 3 d，与对照组比较，5，8 μg/mL 奥硝唑组血管内皮生长因子 mRNA 表达升高 (P < 0.000 1)，2-10 μg/mL 奥硝唑组碱性成纤维细胞生长因子 mRNA 表达均升高 (P < 0.000 1)。

Western blot 检测结果显示，在脂多糖诱导的炎症条件下，与对照组比较，2，5 μg/mL 奥硝唑组共培养 1 d、10 μg/mL 奥硝唑组共培养 3 d 血管内皮生长因子蛋白表达升高 (P < 0.05)，见图 4E，F。

牙髓是高度血管化的组织，含有包括成牙本质细胞、 成纤维细胞、干细胞、免疫细胞及内皮细胞在内的多种 细胞，主要负责牙齿的营养、发育和修复 [1-2]。临床上未 成熟恒牙牙髓坏死的治疗具有挑战性，传统的根管治疗至 今仍是牙髓根尖周病的主要治疗方法，但这种完全不可逆的方式会使牙齿丧失血供和神经，无法让牙根进一步 发育，还增加了继发性创伤或再次感染时牙齿脱落的风 险 [3-5]。血运重建是恢复牙髓活性或再生牙髓组织的前提 条件，血管生成和血液循环能为牙髓再生和根尖发育提供 营养和各种生长因子以及代谢支持 [6-7]。目前，根管内快 速血管化被认为是极具潜力的再生性牙髓治疗策略 [8-10]。 已有研究证实，诱导产生根尖血凝块后能在根管中观察 到牙髓样新生组织的形成 [11]。还有研究发现，在根管内 植入含因子、药物及功能干细胞的组织工程支架能诱导 牙髓再生及新血管形成 [12-15]。尽管如此，再生性牙髓治疗 距离替代传统根管治疗还需更多的证据支持，尤其是通 过药物或材料诱导根尖残余内皮细胞或募集内皮细胞介 导根管内血管化的机制尚待阐明。 

细菌是牙髓和根尖周围病变的关键始动因素 [16-17]。 牙髓失活通常由需氧菌引起，而其发展产生病变则主要归 因于厌氧或兼性厌氧菌感染 [18]。大多数到达牙髓并引起 根尖周疾病的微生物也是厌氧菌 [16，19]。许多学者在盖髓 材料或牙髓血运重建术中应用抗生素药物来控制厌氧菌 感染 [20]。使用三联抗生素糊剂 ( 甲硝唑、米诺环素及环丙沙星的混合物 ) 是目前常见且有效控制根尖感染的药物策略，但也存在使牙体变色及细胞毒性等问题 [21]。作为 最新的硝基咪唑类抗生素之一，奥硝唑具有优异的抗菌、 抗炎及抗感染能力，常被用于治疗厌氧菌感染 [22-23]。近 期研究将奥硝唑药物载于盖髓材料或血管化支架材料中， 发现其可控制牙髓感染 [20，24]。然而，目前根管常用的许 多抗生素如米诺环素被报道具有血管毒性，会抑制血管生 成，即抗生素在抗感染的同时可能会对牙髓再生造成负面 影响 [22]。临床上进行血运重建术等操作前通常会在根管 感染得到控制后再将抗生素去除，但最新研究发现抗生素 会在放射状排列的牙本质小管内大量残留，持续影响后期 血管化牙髓再生过程 [13，25-26]。不管是材料载药抗感染还 是抗生素残留问题，这些药物本身对根管内血管化的影 响都不容忽视，也是探讨药物作用机制并评价其潜在价值的重要依据。相较于目前常用抗生素糊剂中的甲硝唑， 奥硝唑具有更高的抗厌氧菌活性，并且不良反应更小 [27]。 尽管如此，将奥硝唑用于再生性牙髓治疗中仍需更多的证 据，仍须探明其介导根管内血管化和调控内皮细胞行为 的具体机制。髓腔感染及发生根尖周疾病时根尖常处于 炎症微环境，这意味着血管的再生常常在炎性环境下发 生 [28-29]。此次实验通过离体牙模型探讨奥硝唑药物在根管 内的残留情况与释放规律，探索不同质量浓度奥硝唑在 体外对内皮细胞增殖、迁移及成血管分化的影响及机制， 为奥硝唑药物在再生性牙髓治疗中的潜在应用提供科学依据。

1.4.1  离体牙根管内奥硝唑药物残留与释放实验  如图 1所示，使用牙科高速涡轮手机打开牙髓腔，建立直线通道，使用拔髓针拔除牙髓，使用 20 mL 2.5% 次氯酸钠溶液、20 mL 超纯水结合超声振荡冲洗髓腔并进行根管预备，使用三用枪及棉球干燥髓腔，采用 Ceivitron 暂封膏和玻璃离子水门汀将 100 μL 奥硝唑溶液 (33 µg/mL) 封于髓腔中。将每颗离体牙浸泡于 15 mL Hanks 缓冲液中，置于 37 ℃摇床中孵育，隔天更换浸泡液。7 d 后再次打开髓腔，去除充填物及药物，先后使用 20 mL 2.5% 次氯酸钠溶液和20 mL 超纯水超声振荡冲洗髓腔并封入无菌水，再次使用暂封膏和玻璃离子水门汀封闭髓腔，重新放回摇床中，隔天更换浸泡液，定期使用 1 mL 注射器收集髓腔液体样品用于后续奥硝唑质量浓度检测。使用 Hanks 缓冲液配制奥硝唑的标准溶液，质量浓度分别为 0.25，0.5，2，2.5，5，10，20，25 及 50 µg/mL，使用微量核酸分光光度计检测在 322 nm 处吸光度 (A) 值，绘制标准曲线，采用比色法检测样品中奥硝唑质量浓度。

RT-PCR 检测成血管相关基因的表达：将人脐静脉内皮细胞接种于 6 孔板中，细胞密度为 1.6×105 / 孔，分别与不同质量浓度 (0，1，2，5，8 及 10 μg/mL) 奥硝唑直接共培养，或者加入 1 mg/L 脂多糖刺激 24 h 后分别与不同质量浓度 (0，1，2，5，8 及 10 μg/mL) 奥硝唑共培养。共培养 1，3 d 后，使用 Trizol 试剂盒提取细胞总 RNA，使用反转录试剂盒将其反转录为 cDNA，进行实时定量 PCR反应：95 ℃预变性 10 min，95 ℃保温 3-10 s，60 ℃保温10-30 s，共循环 40 次。通过荧光定量 PCR 仪检测成血管相关标志物血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的 mRNA 表达，以 GAPDH 为内参基因。引物序列见表 1。

Western blot 检测血管内皮生长因子蛋白表达：将人脐静脉内皮细胞接种于 6 孔板中，细胞密度为 1.6×105 / 孔，加入 1 mg/L 脂多糖刺激 24 h 后分别与不同质量浓度 (0，1，2，5，8 及 10 μg/mL) 奥硝唑共培养。共培养 1，3 d 后，用 RIPA 溶液裂解细胞后收集裂解液，4 ℃下 12 000 r/min离心 10 min，取上清液，用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度，进行归一化后加入上样缓冲液，置入水浴锅中 100 ℃加热。使用 SDS-PAGE 凝胶分离蛋白后转膜，用 5% 脱脂牛奶封闭膜孔，分别与血管内皮生长因子、GAPDH 溶液 ( 均为 1 ∶ 1 000 稀释比 ) 于摇床中 4 ℃孵育过夜，与对应的二抗溶液 (1 ∶ 2 000 稀释比 ) 在室温下孵育 2 h，用 ECL化学发光试剂盒孵育，使用凝胶成像仪曝光条带，通过Image J 1.53t 软件分析条带灰度值。

1.4.3  鸡胚绒毛尿囊膜实验评估奥硝唑的血管刺激性  将SBF 级 9 d 龄鸡胚随机分成 3 组，每组 6 个。用牙科弯镊去除气室的部分蛋壳及蛋壳膜，保证暴露的尿囊膜完整不受损伤；在尿囊膜上放置尼龙环，实验组尼龙环内分别加入 2，10 μg/mL 奥硝唑溶液 ( 生理盐水配制 )200 μL，对照组尼龙环内加入 200 μL 生理盐水；在 37 ℃、60% 湿度下孵育 1 h 后，用体式显微镜观察不同质量浓度奥硝唑对鸡胚血管变化的影响。

1.5  主要观察指标  奥硝唑在牙根管内的残留质量浓度，不同质量浓度奥硝唑对人脐静脉内皮细胞活性、迁移及分化的影响，以及不同质量浓度奥硝唑对血管的刺激性。

在牙髓治疗中，组织的再生修复和根尖的进一步发育依赖于血运重建以及细菌感染的有效控制 [31]。临床常 用抗生素控制根管感染。据报道，抗生素用于髓腔治疗 后会在髓腔内长期留存，除了起到潜在的控制感染和减 轻炎症作用外，还可能会干扰髓腔内微环境和组织再生，尤其是影响愈合初期的血管生成 [21，32-33]。已有研究报道， 残留高浓度的抗生素会对牙髓细胞产生毒性，不利于内皮 细胞参与血管再生与组织的修复 [22]。此次实验通过离体 牙模型证实了抗生素药物 ( 奥硝唑 ) 在根管中的残留，并探究了髓腔清理后残留药物的释放行为，发现经过初期 的大量释放 ( 接近 20 μg/mL) 后，奥硝唑仍在根管内长期 维持近 2 μg/mL 的释放水平。即使应用临床标准的根管冲 洗方法进行清理操作，起控制感染作用的抗生素仍会长期 残留在根管系统内并逐步溶出，形成低浓度的抗生素微 环境。这一方面提示了临床根管冲洗的重要性与局限性， 另一方面也提醒研究者对抗生素或其他治疗药物残留问题的关注。 

作为新一代硝唑类药物，奥硝唑具有优异的抗厌氧 菌活性，非常适用于根管的感染控制，尤其是牙髓失活发 展病变过程中的厌氧菌控制。有研究报道，奥硝唑用于 牙髓病及冠周炎治疗时有良好的效果[34-35]。最新研究表明， 根尖血管的形成及组织修复与炎症控制呈负相关，但使 用药物控制炎症时仍有抑制血管形成的报道 [22，31，34-35]。 尽管如此，考虑到根管内药物残留的问题，奥硝唑用作 再生性牙髓治疗潜在药物仍须考虑其对根管内血管化的 影响，例如对内皮细胞的增殖、迁移及成血管效应的影响， 即药物的应用策略应当考虑对内皮细胞活性的保护 [36]。 研究显示，在炎症微环境下，1-10 μg/mL(在药物溶出量级) 奥硝唑对人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移无显著抑制。 鸡胚绒毛尿囊膜实验是临床评估药物对血管刺激性的重 要指标 [37-38]。经奥硝唑刺激后，尿囊膜中未见出血、凝血、 血管溶解或蛋白质变性等现象，这表明奥硝唑在溶出质 量浓度范围内无细胞毒性及血管刺激性，即其对组织损 伤处的内皮细胞募集和存活以及血管再生无潜在毒性。

作为血管再生的标志物之一，血管内皮生长因子是胎儿和成人血管生成的重要媒介，在调节血运重建和人脐静脉内皮细胞血管化方面发挥关键作用 [39-40]。血管内皮生长因子的高表达可促进体内牙髓干细胞的成血管分化，增加根尖组织新生血管的量 [41]。另外，碱性成纤维细胞生长因子也有促进人脐静脉内皮细胞向受损组织迁移及血管化的功能，载碱性成纤维细胞生长因子和奥硝唑的静电纺丝膜可在体内起到良好的抗炎和促血管生成作用[20]。此实验显示，在奥硝唑直接刺激下，人脐静脉内皮细胞中血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的 mRNA表达整体上呈下调趋势；而在由脂多糖诱导的炎症微环境中，奥硝唑反而促进了血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的mRNA表达。推测即使在较低质量浓度(1-10 μg/mL) 下，奥硝唑依然对人脐静脉内皮细胞成血管活性具有一定的抑制作用；而在炎性微环境中，奥硝唑本身优异的抗炎作用减轻了人脐静脉内皮细胞的炎症反应及其他不利影响，相比之下反而促进人脐静脉内皮细胞成血管再生相关标志物的表达，并且并不影响细胞的增殖和迁移。因此，尽管在根管内应用奥硝唑后会存在药物长期残留及释放问题，但奥硝唑会在潜在的炎症微环境中发挥抗厌氧菌功能并促进内皮细胞成血管因子的表达，具体分子机制有待后续探究。

综上所述，髓腔载入奥硝唑后会在根管系统中长期残留并持续低质量浓度溶出 (< 20 μg/mL)。1-10 μg/mL 奥硝唑无细胞毒性及血管刺激性，可促进炎性内皮细胞中促血管生成相关基因及蛋白的表达，奥硝唑可作为一种潜在的治疗药物用于髓腔感染控制并促进根管内血管化。进一步研究将负载该药物于植入材料中或直接用在体内根管系统中，阐明其促进再生性牙髓再生的作用机制。

文题释义：