2.1   川陈皮素对BV2细胞存活率的影响   川陈皮素的化学结构见图1A。为了确定川陈皮素对BV2小胶质细胞的细胞毒性作用，首先采用CCK-8实验探究川陈皮素对BV2小胶质细胞的最佳药物浓度，结果显示：在0-25 μmol/L浓度下，BV2小胶质细胞活力无明显变化(P > 0.05)，说明此浓度范围内的川陈皮素对BV2小胶质细胞没有明显的毒性作用；在30 μmol/L及以上浓度条件下，BV2小胶质细胞活力明显降低(P < 0.01)，见图1B，表明该浓度范围的对川陈皮素BV2小胶质细胞有较为明显的细胞毒性作用。因此，选择20 μmol/L川陈皮素进行后续实验。
2.2   各组BV2小胶质细胞增殖活性检测   CCK-8实验结果显示，对照组、脂多糖组、脂多糖+川陈皮素组细胞活力分别为(99.19±3.73)%，(47.20±5.69)%，(80.26±5.17)%，组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.001)，见图2A。
2.3   各组BV2小胶质细胞活性氧含量检测   活性氧荧光探针检测结果显示，与对照组比较，脂多糖组细胞内活性氧含量升高(P < 0.001)；与脂多糖组比较，脂多糖+川陈皮素组细胞内活性氧含量降低(P < 0.01)，见图2B。




2.4   各组BV2小胶质细胞核因子κB p65、肿瘤坏因子α和白细胞介素1β的表达   Western blot检测显示，与对照组比较，脂多糖组细胞中p-核因子κB p65、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的蛋白表达水平均升高(P < 0.001)；与脂多糖组比较，脂多糖+川陈皮素组细胞中p-核因子κB p65、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的蛋白表达水平均降低(P < 0.001，P < 0.01)；各组核因子κB p65蛋白表达水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。
2.5   各组BV2小胶质细胞核因子κB p65、肿瘤坏因子α和白细胞介素1β的mRNA表达   qRT-PCR检测结果显示，各组细胞中核因子κB p65 mRNA表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)；与对照组比较，脂多糖组细胞中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β mRNA表达水平均升高(P < 0.001，P < 0.01)；与脂多糖组比较，脂多糖+川陈皮素组细胞中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β mRNA表达水平均降低(P < 0.001，P < 0.05)，见图4。

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脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统疾病，通常导致感觉和自主运动功能的丧失[1-2]。据统计，全球脊髓损伤发病率每年在25万人至50万人次之间，每位脊髓损伤患者一生的治疗总费用超过300万美元，高昂的治疗费用给患者家庭和社会带来了沉重负担[3]。脊髓损伤的病理生理过程包括原发性和继发性损伤，原发性损伤通常是由外部力量引起的机械性创伤，导致神经系统的直接破坏和细胞功能障碍，并且通过级联反应加剧损伤[4]；继发性损伤机制包括氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和微循环障碍[5]，这些病理变化之间相互作用，形成恶性循环，进一步加剧神经系统功能障碍。在过去几十年里，对脊髓损伤的治疗研究取得了一些进展，但仍面临挑战，因此寻找新的治疗策略和靶点具有重要意义。近年来，免疫调节和炎症抑制作为治疗脊髓损伤的关键领域受到广泛关注。炎症反应在脊髓损伤发展中扮演着重要角色，调节炎症反应可能是减轻神经损伤和促进功能恢复的关键。
BV2小胶质细胞来自永生化小鼠小胶质细胞系，是原代小胶质细胞最常用的替代品。小胶质细胞是中枢神经系统主要的先天免疫细胞，在神经炎症中发挥重要作用[6]。脊髓损伤后小胶质细胞的过度激活导致多种信号级联介导的促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等)的过量分泌以及活性氧的过度产生，进而可能放大炎症，加重继发性损伤[7]。同时，活化的小胶质细胞可通过核因子κB信号通路诱导脊髓损伤后的神经炎症反应，在神经炎症反应和免疫应答中发挥重要作用[8]。核因子κB作为一种重要的炎症转录因子也参与脊髓损伤后的炎症反应[9]。已有研究证实，核因子κB信号通路可调控脊髓损伤的炎症过程，抑制核因子κB信号通路可减轻炎症反应、改善细胞外环境、促进脊髓损伤后神经突再生，因此该途径可能是脊髓损伤后的治疗靶点[10-11]。
川陈皮素是从柑橘类植物中提取的一种无毒聚甲氧基黄酮类成分，具有多种生物学效应，如抗炎[12]、抗肿瘤[13]、抗氧化等[14]。LIN等[15]的研究发现，川陈皮素可通过抑制核因子κB信号通路抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症，减轻小鼠骨关节炎。QI等[16]的研究表明，川陈皮素可以改善脂多糖诱导的小胶质细胞异常激活、炎症因子的过度释放和氧化还原失衡，改善小鼠记忆障
碍[17]。但川陈皮素抑制脊髓损伤后炎症反应的作用机制尚不明确。此次实验拟通过脂多糖诱导小鼠BV2小胶质细胞建立体外炎症模型，探讨川陈皮素是否通过核因子κB信号通路抑制活化小胶质细胞的炎症反应，为脊髓损伤药物治疗提供理论基础和实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   体外细胞实验，采用单因素方差分析进行多组间比较。
1.2   时间及地点   实验于2023年2-7月在山东省济宁市第一人民医院肿瘤转化医学实验室及济宁市脊柱疾病防治与数字医学重点实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   小鼠BV2小胶质细胞购于普诺赛公司(货号：CL-0493)。
1.3.2   实验试剂   川陈皮素(纯度：99.52%)购于美国MedChemExpress公司(货号HY-N0155)；脂多糖、PVDF膜(进口分装，6.6 cm×8.5 cm，0.45 μm)购于上海碧云天生物技术有限公司(产品编号S1732-0.5 mg、FFP32)；BV2细胞专用培养基、PBS缓冲液(1×)购于武汉普诺赛生命科技有限公司(货号CM-0493、PB180327)；胰蛋白酶购于赛默飞世尔科技有限公司(货号25300054)；CCK-8 检测试剂盒购于日本同仁化学研究所(货号CK-04)；无蛋白快速封闭液(1×)、PAGE凝胶快速制备试剂盒(10%)、Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液(10×)、转膜缓冲液(10×)、TBS/Tween缓冲液(10×)、Western Blot一抗稀释液、Western Blot二抗稀释液购于上海雅酶生物医药有限公司(货号PS108P、PG112、PS105S、PS109S、PS103S、PS114、PS115)；重组Anti-核因子kB p65抗体、重组抗核因子kB p65(磷酸S536)抗体、重组Anti-肿瘤坏死因子α抗体、重组抗白细胞介素1β抗体、β-actin抗体、山羊抗兔IgG H&L(HRP)购于Abcam(英国)公司(货号ab32536、ab76302、ab183218、ab234437、ab8226、ab6721)；HiScript II One Step RT-PCR Kit试剂盒、FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2购于南京诺维赞生物科技有限公司(货号P611-01、RC112-01)。
1.3.3   实验仪器   细胞培养箱(型号：3111，赛默飞世尔科技有限公司生产，S/N：300209779)；全自动化学发光图像分析系统(型号：Tanon-4600，生产企业：天能，S/N：20T12NP64-12138)；基础电泳仪(型号：041BR321175，美国伯乐生命医学产品有限公司生产)。
1.4   方法   
1.4.1   BV2小胶质细胞培养  将细胞接种至6 cm细胞培养皿，每皿加入5 mL BV2细胞专用培养基，于体积分数5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。第3天进行细胞换液，当细胞生长至90%以上时可进行传代培养。
1.4.2   川陈皮素作用浓度筛选   将第3代BV2小胶质细胞接种至96孔板，细胞密度1 000个/孔，培养贴壁后弃掉原培养基，分别加入含不同浓度梯度川陈皮素的BV2细胞专用培养基，浓度梯度设置为0，5，10，15，20，25，30，35，40和45 μmol/L，每组含6复孔。置于细胞培养箱培养24 h后，去除上层培养基，用PBS洗涤2遍，每孔加入10 µL CCK-8 溶液，置于细胞培养箱中培养1 h，采用酶标仪检测各组在450 nm波长下的吸光度值，计算细胞活力。细胞活力(%)=(加药组吸光度值-空白组吸光度值)÷(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。空白组仅加入等量BV2细胞专用培养基，不加入细胞。
1.4.3   细胞分组及处理   取第3代BV2小胶质细胞，分3组培养：①对照组：加入5 mL BV2细胞专用培养基培养24 h，不予其余任何处理；②脂多糖组：在培养基中加入10 μg/mL脂多糖处理24 h[18-19]；③脂多糖+川陈皮素组：在培养基中先加入20 μmol/L川陈皮素处理6 h，然后加入10 μg/mL脂多糖处理24 h。每组设置8复孔。置于细胞培养箱内培养。
1.4.4   细胞增殖活性检测   取第3代BV2小胶质细胞悬液接种于96孔培养板，细胞密度1×103/孔，按实验设计分组处理。处理结束后去除上层培养基，用PBS洗涤2遍，每孔加入10 µL CCK-8 溶液，用PBS洗涤2遍，更换为含有10% CCK-8 溶液的培养基，置于细胞培养箱中培养1 h，使用酶标仪检测各组细胞在450 nm 处的吸光度值。
1.4.5   Western Blot法检测细胞内相关蛋白表达   取第3代BV2小胶质细胞悬液接种于6孔培养板，细胞密度1×105/孔，按实验设计分组处理。处理结束后，用4 ℃预冷的PBS溶液洗涤细胞3遍，使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解细胞，4 ℃下15 000 r/min离心15 min，取上清，使用BCA定量试剂盒检测蛋白浓度，并对样品进行定量分装。在100 ℃金属水浴锅中加入5倍浓度的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液并煮沸5 min，以使蛋白充分变性。对各组蛋白进行等量上样后进行电泳、转膜，用无蛋白快速封闭液(1×)封闭1 h，取出PVDF膜加入一抗(1∶1 000)在4 ℃下孵育过夜，一抗包括重组Anti-核因子kB p65抗体(稀释比1∶1 000)、重组抗核因子kB p65(磷酸S536)抗体(稀释比1∶1 000)、重组Anti-肿瘤坏死因子α抗体(稀释比1∶1 000)、重组抗白细胞介素1β抗体(1∶1 000)、β-actin抗体(稀释比1∶1 000)；回收一抗，用TBST溶液洗涤3次，加入相应二抗(稀释比1∶5 000)室温条件下孵育1 h；再次使用TBST溶液洗涤3遍，配置ECL显影液(比例为1∶1)，化学发光成像分析系统曝光显影，采集图像。利用Image J软件对蛋白条带进行灰度分析，最终结果以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值表达。
1.4.6   细胞内活性氧水平检测   取第3代BV2小胶质细胞悬液接种于96孔培养板，细胞密度1×103/孔，按实验设计分组处理。处理结束后去除原培养基，每孔加入10 μmol/L 2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐活性氧荧光探针100 μL，阳性对照组内加入活性氧阳性对照试剂(Rosup)100 μL作为对照，置于37 ℃恒温培养箱中孵育30 min，用预热的细胞培养基轻轻洗涤3次已染色的细胞，去除未被细胞摄取的活性氧荧光探针，随后于荧光酶标仪检测各种荧光强度(激发波长和发射波长分别在488 nm和525 nm处读取)。

1.4.7   qRT-PCR法检测细胞内相关基因mRNA表达   取第3代BV2小胶质细胞悬液接种于6孔培养板，细胞密度1×105/孔，按实验设计分组处理。处理结束后，用PBS洗涤细胞3遍，采用TRIzol法提取各组细胞总RNA，使用反转录试剂盒按照操作步骤进行反转录获得cDNA，将扩增的cDNA与引物、荧光探针和qPCR Master Mix混合。根据qPCR的要求设置相应的PCR循环程序和参数，在实时PCR检测系统分析相应mRNA表达水平。以β-actin为内参，2-ΔΔCT 法计算各组核因子κB p65、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β mRNA 相对表达。实验重复3次。引物购于生工生物工程(上海)股份有限公司，序列见表1。

1.5   主要观察指标   ①各组BV2小胶质细胞的增殖活性、存活率；②各组BV2小胶质细胞中炎症因子及核因子κB信号通路相关因子的蛋白表达量；③各组BV2小胶质细胞中活性氧含量变化；④各组BV2小胶质细胞中炎症因子及核因子κB信号通路相关因子的mRNA表达。

1.6   统计学分析   实验数据采用SPSS 26.0软件进行分析，通过Graphpad Prism 9.0等软件进行图形设计、统计分析处理，实验数据以x±s表示，两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已通过济宁市第一人民医院生物统计学专家审核。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

此次实验发现，脂多糖处理导致BV2小胶质细胞的增殖活性显著下降，并且伴随着p-核因子κBp65、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等炎症相关因子的显著增加，川陈皮素预处理具有逆转脂多糖诱导的BV2小胶质细胞增殖活性下降的能力。Western Blot检测结果显示，川陈皮素还能降低炎症相关因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的表达水平，并抑制核因子κB的磷酸化进程，但核因子κB p65蛋白表达在3组间无明显差异，进一步的量化结果显示脂多糖组p-核因子κB p65/核因子κB p65比值较对照组有明显差异，说明川陈皮素预处理能显著抑制核因子κB的磷酸化进程。一些研究也有相似发现，脂多糖介导了核因子κB p65的磷酸化，药物处理后抑制了核因子κB 磷酸化易位进入细胞核，量化分析结果显示与对照组总核因子κB p65蛋白表达量相比无明显差异，而p-核因子κB p65/核因子κB p65发生明显变化[20-21]。进一步通过查阅相关文献表明，核因子κB以p65亚单位存在于细胞中，平时处于非活化状态，脂多糖可以激活核因子κB信号通路促进炎症递质的产生[22]，细胞受到刺激后，脂多糖可被细胞膜表面Toll样受体4(TLR4)识别和结合，启动一系列信号传导的级联反应，引起κB抑制因子激酶(inhibitor of kappa B kinase，IKK)复合物激活，激活的IKK激酶复合物进一步导致IκB(核因子κB抑制因子)的磷酸化和降解，IκB的降解释放出被抑制的核因子κB，此时核因子κB可进入细胞核，并且结合到DNA上特定的启动子区域上，从而促进炎症相关基因的转录和表达，释放一系列炎症因子，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6等[23]，这些促炎因子能够招募其他免疫细胞到炎症部位，并进一步加剧炎症反应。此次实验证实，脂多糖可显著增加BV2小胶质细胞肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的表达，而川陈皮素可通过抑制核因子κB的磷酸化及降低核因子κB通路相关促炎细胞因子水平而发挥抗炎作用。QI等[16]研究也有类似发现，发现川陈皮素显著减轻了脂多糖诱导的核因子κB信号通路的激活及其下游炎症反应、缓解脂多糖引起的氧化还原失衡及线粒体膜电位紊乱、抑制与线粒体呼吸相关蛋白的表达。
此次实验采用脂多糖诱导小鼠BV2小胶质细胞神经炎症模型，旨在评估川陈皮素是否可以通过核因子κB信号通路抑制小胶质细胞的活化，从而抑制相关炎症因子的表达，为脊髓损伤的药物治疗提供实验依据。虽然BV2小胶质细胞是小鼠巨噬细胞系，但它们仍然可以提供有关小胶质细胞对于脊髓损伤相关性的提示和信息。脊髓损伤后，小胶质细胞可以通过释放促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等)和趋化因子引发免疫细胞的浸润，导致炎症反应加剧。小胶质细胞在神经系统疾病中扮演着关键角色，控制小胶质细胞的激活可能对神经系统疾病具有保护作用[24]。小胶质细胞的激活状态分为经典激活M1状态和交替激活M2状态[25]。M1状态可由脂多糖诱导，引发多种促炎细胞因子的释放[26]。激活的小胶质细胞释放炎性因子，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6等，这些因子吸引并激活其他免疫细胞。此外，YOU等[27]研究发现，激活的小胶质细胞还促进了一氧化氮(NO)和前列腺素E2等介质的生成。
脊髓损伤是一种严重的神经系统损伤，可直接导致感觉和运动功能的显著丧失，对患者的生理和心理功能都会造成重大影响[28]。脊髓损伤后炎症、氧化应激、神经元细胞凋亡是导致继发性损伤的关键因素[29]。继发性脊髓损伤后的慢性炎症刺激运动神经元和神经胶质细胞的过度活化，导致中枢神经系统功能障碍和瘢痕组织形成，阻碍脊髓损伤的修复过程[30]，因此能够调节炎症信号通路、改善功能恢复的药物可能在未来的脊髓损伤治疗中具有优势[31-32]。核因子κB是一条复杂的信号通路，在脊髓损伤后的炎症反应过程中起着重要作用，核因子κB信号通路的激活可以增加许多炎症递质和趋化因子的表达水平，形成炎症促进循环并进一步加速脊髓损伤进展。由于核因子κB是炎症反应背景下的重要转录因子，抑制核因子κB活性可显著减轻损伤后的炎症反应，促进神经功能的恢复。因此，核因子κB信号通路可能成为脊髓损伤治疗的潜在靶点，以减轻继发性损伤的进一步发展。现已发现多种天然化合物通过核因子κB信号通路减轻炎症反应，如MARK PETRASH等[33-34]研究发现连翘酯苷B可通过抑制核因子κB信号通路有效抑制内源性炎症因子的激活。JIA等[35]的研究也有类似结论，他们发现白藜芦醇能够通过抑制IKK的活性和核因子κB信号通路的激活，抑制炎症因子的产生。LI等[36]通过实验发现，黄苓苷可抑制脂多糖刺激的BV2小胶质细胞核因子κB上调和IκBα降解，增加核因子κB的磷酸化，提示黄苓苷可通过核因子κB信号通路抑制小胶质细胞的炎症反应，但他们并未检测各组之间活性氧水平的差异以评估细胞是否处于氧化应激状态、监测炎症治疗效果。川陈皮素是一种天然多甲氧基类黄酮，是一种多功能成分，能够通过血脑屏障对人和动物发挥多种作用，如抗癌、抗炎和抗氧化等。YANG等[37]的研究发现，川陈皮素通过抑制p38/MAPK和核因子κB/p65的磷酸化来调控p38/核因子κB信号通路的活性，抑制炎症细胞因子的侵袭和血管生成，对类风湿性关节炎有预防作用。LI等[38]研究发现，川陈皮素可通过调节肝脏氧化应激和线粒体功能障碍减轻非脂肪性肝炎小鼠模型中的肝细胞死亡、炎症和纤维化。但尚未有研究直接证实川陈皮素是否可以通过调节核因子κB信号通路抑制BV2小胶质细胞的炎症反应，是否具有潜在的神经保护作用？此次实验结果表明，川陈皮素可能通过调节核因子κB信号通路来减轻脂多糖介导的BV2小胶质细胞炎症反应，为开发治疗继发性脊髓损伤的新药物提供了实验证据。然而研究仍存在一些限制：首先，实验是基于体外细胞模型进行的，尚需进一步验证在体内模型中的效果；虽然川陈皮素在调控炎症反应中显示出潜力，但其具体作用机制尚需深入研究，包括是否涉及其他信号通路的调节。在脊髓损伤炎症中，核因子κB信号通路并不是单一发挥功能，核因子κB在此过程中是否与其他通路相互作用还有待进一步研究。
综上所述，实验阐明了川陈皮素可能通过调控核因子κB信号通路来抑制小胶质细胞的炎症反应，从而提供了一种潜在的神经保护机制，这为神经退行性疾病的治疗策略提供了新思路，但仍需要进一步研究以揭示其详细的分子机制。

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文题释义：

川陈皮素：是一种来自柑橘皮的聚甲氧基黄酮类化合物，常温下不易溶于水，不溶于非极性溶剂，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸、稀碱溶液及热水，具有抗炎、抗氧化和抗癌特性。#br#

核因子κB信号通路：是一种重要的细胞信号传导途径，可以通过多种途径被激活，例如病原微生物感染、细胞因子刺激、氧化应激、炎症等。核因子κB信号激活后可调节多种基因的表达，包括炎症递质、凋亡相关蛋白、细胞黏附分子和免疫相关基因等。

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川陈皮素是一种传统中药，已有研究证实其具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化应激等多种生物学作用。核因子κB是一种重要的转录因子，参与调控炎症反应和免疫应答。脊髓损伤后的炎症反应是导致进一步神经损伤和病情恶化的关键因素。此次研究发现川陈皮素通过抑制核因子κB信号通路的激活，包括抑制炎性因子的释放和抑制炎症相关基因的表达，抑制了BV2细胞的炎症反应，这一发现对于深入理解核因子κB信号通路在脊髓损伤后炎症反应中的作用具有重要意义，为川陈皮素的研究和应用提供了新的思路和基础。研究的亮点在于揭示了川陈皮素通过核因子κB信号通路抑制BV2细胞炎症反应的机制，并探讨其在脊髓损伤后炎症反应治疗中的潜在应用价值。

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