大鼠椎间盘髓核来源间充质干细胞的体外分离及培养鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.018

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (49): 8576-8582.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.018

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

大鼠椎间盘髓核来源间充质干细胞的体外分离及培养鉴定

芮云峰¹，王善正¹，谢鑫荟¹，孙明辉²，林禹丞¹，李刚³，王宸¹

1东南大学附属中大医院骨科，江苏省南京市 210009
2南京大学附属鼓楼医院骨科，江苏省南京市 210008
3香港中文大学干细胞与再生医学实验室，香港特别行政区

修回日期:2013-09-28 出版日期:2013-12-03 发布日期:2013-12-03
作者简介:芮云峰☆，男，1977年生，江苏省宜兴市人，汉族，2011年香港中文大学毕业，博士，主治医师，副研究员，硕士生导师，主要从事肌腱、韧带和椎间盘的组织工程及再生医学修复研究。 ruiyunfeng@126.com
基金资助:
国家自然科学基金青年基金(81201422)*；江苏省自然科学基金青年基金项目(BK2012334)*；东南大学“创新基金”项目(3290002401)*

Isolation, culture and identification of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells from adult rats in vitro

Rui Yun-feng¹, Wang Shan-zheng¹, Xie Xin-hui¹, Sun Ming-hui², Lin Yu-cheng¹, Li Gang³, Wang Chen¹

1Department of Orthopaedics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
2Department of Orthopedics, Nanjing Drum Tower Hospital of Nanjing University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
3Laboratory of Stem Cells and Regeneration, the Chinese University of Hong Kong, Hong Kong Special Administrative Region, China

Revised:2013-09-28 Online:2013-12-03 Published:2013-12-03
About author:Rui Yun-feng☆, M.D., Attending physician, Associate researcher, Master’s supervisor, Department of Orthopaedics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China ruiyunfeng@126.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81201422*; the Natural Science Foundation of Jiangsu Province for the Youth, No. BK2012334*; the Innovative Foundation of Southeast University, No. 3290002401*

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前椎间盘髓核组织的细胞组成和特性仍未阐明。
目的：旨在建立大鼠椎间盘髓核来源间充质干细胞的体外培养体系，并对其体外多项分化潜能进行鉴定。
方法：体外培养SD大鼠盘髓核来源间充质干细胞，取第3代细胞进行三系诱导分化，将成骨、成脂和成软骨分化作为实验组，基础细胞培养作为对照组。
结果与结论：低密度培养获得的髓核来源细胞早期可形成葵花样细胞集落，克隆样生长。第3代后，细胞形态趋向均一，呈成纤维细胞样生长。成骨诱导28 d，实验组茜素红染色阳性，且RunX2、osteopontin及osteocalcin表达较对照组显著增高(P < 0.05)；成脂诱导21 d，实验组油红O染色阳性，C/EBPα及PPARγ2表达较对照组显著增高(P < 0.05)；成软骨分化诱导21 d，实验组番红O快绿染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性，aggrecan和Col2a1表达较对照组显著增高(P < 0.05)。可见成年SD大鼠椎间盘髓核组织中可分离培养出体外呈克隆样生长的细胞群，且有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞发生定向分化的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 椎间盘, 髓核, 间充质干细胞, 成骨细胞, 脂肪细胞, 软骨细胞, Ⅱ型胶原, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Currently, cellular composition and the features of the nucleus pulposus are still not to be clarified.
OBJECTIVE: To establish the in vitro culture system of rat nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells and to identify their multi-lineage differentiation potential.
METHODS: Mesenchymal stem cells from the nucleus pulposus tissues of Sprague-Dawley rats were cultured in vitro. Then, cells at passage 3 were induced to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes as experimental group. Cells cultured with basic culture medium served as controls.
RESULTS AND CONCLUSION: Cells isolated from rat nucleus pulposus could form the sunflower-like colonies and exhibit clone-like growth when they cultured at a low density. Cells at passage 3 became homogeneous and exhibited fibroblast-like morphology. After 28 days of osteogenic induction, arizarin red positive signals were detected in the experimental group. The mRNA expressions of RunX2, osteopontin and osteocalcin were significantly increased in the experimental group, compared to the control group (P < 0.05). After 21 days of adipogenic induction, oil red-O positive cells were detected in the experimental group. The mRNA expressions of C/EBPα and PPARγ2 were significantly increased in the experimental group, compared to the control group (P < 0.05). After 21 days of chondrogenic induction, safranin O/fast green staining was positive in the experimental group. The mRNA expressions of aggrecan and Col2a1 were significantly increased in the experimental group, compared to the control group (P < 0.05). Our findings in this study suggested that nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells could be isolated from the Sprague-Dawley rat nucleus pulposus and exhibited clonal-like growth when they were cultured in vitro. These cells were confirmed to have the potential to differentiate into adipocytes, osteoblasts and chondrocytes in vitro.

全文链接：

Key words: mesenchymal stem cells, intervertebral disk, osteoblasts, adipocytes, chondrocytes

中图分类号:

R394.2

芮云峰，王善正，谢鑫荟，孙明辉，林禹丞，李刚，王宸. 大鼠椎间盘髓核来源间充质干细胞的体外分离及培养鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(49): 8576-8582.

Rui Yun-feng, Wang Shan-zheng, Xie Xin-hui, Sun Ming-hui, Lin Yu-cheng, Li Gang, Wang Chen. Isolation, culture and identification of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells from adult rats in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(49): 8576-8582.

图/表（结果） 5

2.1 髓核来源间充质干细胞形态学观察 体外酶消化分离，低密度接种的髓核来源间充质干细胞呈克隆样生长，见图1A；低密度培养7-10 d，贴壁的髓核来源间充质干细胞早期可形成葵花样细胞集落，克隆样生长，见图1B。克隆生长呈异质性，原代细胞传代后(第1代)可见多种细胞形态，以圆形的巨噬样细胞和纺锤形的成纤维样细胞为主，见图2A。第3代后，细胞形态趋向均一，呈成纤维细胞样生长，见图2B。

2.2 髓核来源间充质干细胞体外成骨诱导分化结果 髓核来源间充质干细胞更换成骨诱导培养液后细胞增殖稍慢，诱导后5 d后，可见细胞形态逐渐改变，由长梭形变为类圆形、多边形或不规则形；1周后细胞开始呈簇状生长，2周时细胞团逐渐增大，诱导3周经茜素红染色呈红色结节，见图3；平行培养未经诱导细胞染色阴性，见图4。

髓核来源间充质干细胞成骨诱导28 d，成骨诱导组中Runx2、osteopontin及osteocalcin表达较对照组均显著增高(P < 0.05)，差异有显著性意义，见图5，说明髓核来源间充质干细胞通过体外诱导可以成骨分化。

2.3 髓核来源间充质干细胞体外成脂诱导分化结果 髓核来源间充质干细胞更换成脂诱导培养液后细胞增殖缓慢，诱导后5 d胞浆内出现少量脂滴并逐渐聚集，细胞形态亦逐渐由长梭形变为多边形、椭圆形。3 周时油红O染色阳性，细胞内出现大量红染颗粒，见图6；平行培养未经诱导细胞染色阴性，见图7；髓核来源间充质干细胞成脂诱导21 d，成脂诱导组中C/EBPα和 PPARγ表达较对照组显著增高(P < 0.05)，差异有显著性意义，见图8，说明髓核来源间充质干细胞通过体外诱导可以成脂分化。

2.4 髓核来源间充质干细胞体外成软骨诱导分化结果 髓核来源间充质干细胞成软骨诱导分化21 d后，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和番红O快绿染色均为阳性，见图9。

成软骨分化诱导21 d，成软骨诱导组中Col2a1和aggrecan的表达较对照组显著增高(P < 0.05)，差异有显著性意义，说明髓核来源间充质干细胞通过体外诱导可以成软骨分化。见图10。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2013年1至5月在东南大学医学院外科学实验中心完成。

材料：

实验动物：10只8周龄SD大鼠用于分离培养髓核来源间充质干细胞，雌雄不限，体质量为250-300 g。由江苏省农科院提供，许可证号：SCXK(苏)2007-0004。实验中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求^[8]。

大鼠椎间盘髓核来源间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定实验所用的试剂和仪器：

实验方法：

髓核来源间充质干细胞体外培养：无菌条件下取SD大鼠正常髓核组织，用Ⅱ型胶原酶(3 g/L)消化2 h。期间每隔20 min摇晃，用吸管轻轻吹打，将消化后的细胞及组织悬液用70 μm的滤器(Becton Dickinson)过滤形成并收集单细胞悬液。细胞以50/cm²培养接种到标准培养基中(LG-DMEM、体积分数10%胎牛血清、1%双抗)培养7-10 d，镜下观察克隆形成。

髓核来源间充质干细胞传代培养：分离培养的SD大鼠髓核来源间充质干细胞每隔3 d换液1次，第7-10天原代培养镜下观察细胞克隆形成。细胞克隆用PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化，细胞计数后以4×10³/cm²接种传代培养。倒置显微镜观察细胞生长情况。

髓核来源间充质干细胞多向分化实验：

成骨分化：取第3代髓核来源间充质干细胞消化后，以4×10³/cm²接种到六孔板，常规培养基培养直至细胞融合。随后分两组，一组继续以常规培养基培养，另外一组以成骨诱导培养基培养(LG-DMEM、体积分数10%胎牛血清、1 nmol/L地塞米松、20 mmol/L beta-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C)，28 d后，应用茜素红染色检测钙小梁形成(细胞先用体积分数70%乙醇固定10 min，随后用0.5%茜素红染色30 min)；行RT-PCR检测Runx2、osteopontin及osteocalcin的mRNA表达。

成脂分化：取第3代髓核来源间充质干细胞消化后，以4×10³/cm²接种到六孔板，常规培养基培养直至细胞融合。随后分两组，一组继续以常规培养基培养，另外一组以成脂诱导培养基(LG-DMEM、体积分数10%胎牛血清、500 nmol/L地塞米松、0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、50 μmol/L吲哚美辛、10 mg/L胰岛素)培养，21 d后，油红O染色检查脂滴形成(细胞先用体积分数70%乙醇固定10 min，随后用0.3%油红O溶液染色2 h)；行RT-PCR检测C/EBPα和PPARγ的mRNA表达。

成软骨分化：实验采用细胞三维微球培养检测髓核来源间充质干细胞成软骨分化。8×10⁵个细胞于15 mL离心管离心(450×g，10 min)后形成微团，分别予以基础培养基和成软骨培养基( LG-DMEM、10 μg/L转化生长因子β3、500 μg/L骨形态发生蛋白2、10^-⁷ mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸-2-磷酸酯、40 mg/L脯氨酸、100 mg/L丙酮酸)培养。21 d后，细胞微球分别行病理学固定，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，RT-PCR检测COL2a1和aggrecan的mRNA表达。

Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：细胞微球予以40 g/L多聚甲醛中固定，脱水，石蜡包埋切片脱蜡后，予以梯度乙醇脱水，予以体积分数3%过氧化氢室温下浸泡 20 min灭活内源性过氧化酶。然后，用2 g/L蛋白酶进行抗原修复以探测Ⅱ型胶原，30 min后，予以PBS冲洗剩余活性酶。室温用山羊血清封闭20 min后，切片予以小鼠抗大鼠Ⅱ型胶原抗体4 ℃孵育过夜。切片孵育过夜后用山羊抗小鼠Ig二抗室温孵育1 h，随后切片PBS冲洗，苏木精复染，梯度乙醇和二甲苯脱水，镜下观察。阴性组抗体用阻断剂替代，阳性组用来源于股骨髁的关节软骨作为对照。

实时荧光定量PCR分析：细胞消化后进行均一化处理，RNeasy mini试剂盒提取RNA。根据First Strand cDNA试剂盒说明将RNA转录为cDNA，通过测量 260 nm/280 nm吸光度值得到cDNA浓度。特异性引物PCR反应条件在不同的退火条件，通过PCR仪进行优化。循环条件如下：在95 ℃下变性10 min，在95 ℃ 10 s，45个循环，最佳退火温度(见表1)15 s，72 ℃ 20 s，最后在60-95 ℃(加热速率0.18 ℃/s)。实验结果通过Relative Quantification Software进行分析，靶基因以β-actin作为内参，相关基因表达通过 2^-△△CT公式计算。实验通过来自3只大鼠的细胞进行重复以验证结果。

主要观察指标：①原代及传代细胞形态学观察。②对髓核来源间充质干细胞体外成骨、成脂、成软骨分化潜能进行鉴定。

统计学分析：通过计算靶基因在诱导组和实验组的比值对比两组之间mRNA表达水平。比值为1表明两组间差异无显著性意义，数据采用Mann-Whitney U检验分析。所有数据分析均采用SPSS 17.0统计软件。

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讨论

椎间盘退变的病理机制目前仍未阐明。椎间盘退变的组织学研究发现，髓核组织中可见细胞增殖，细胞成群分布，同时可见细胞死亡(包括坏死和凋亡)增加。一般认为，椎间盘细胞的合成和分解代谢失衡导致椎间盘退变的发生；反之，椎间盘退变加重也影响椎间盘细胞维持的合成分解代谢的自然平衡。
当前，椎间盘退变的细胞生物学机制仍不明确，而椎间盘内的细胞种类仍存在一定争议。椎间盘内细胞在维持椎间盘基质合成中起到重要作用，在成人髓核中发现了一种体积较小的细胞，形态类似于软骨细胞。然而，髓核组织中也存在一类空泡样细胞，这类细胞体积较大，来源于脊索^[9]。髓核中这类脊索细胞大量丢失同时会伴随着椎间盘退变，提示这类细胞在椎间盘的稳态及自我更新中起到重要作用^[10-11]。人类的脊索细胞随着年龄和椎间盘退变而逐渐减少^[12]。基于以上的认识，推测椎间盘中应存在一类具备增殖分化潜能的祖细胞。

实验成功从SD大鼠椎间盘髓核组织中分离出一类祖细胞，这类细胞在传代后形态呈成纤维细胞样，类似于骨髓间充质干细胞，具备较强的增殖活性和分化潜能。因此，推测髓核中的软骨样细胞和脊索细胞均源于这些祖细胞，而这些祖细胞最终会分化成这两种细胞从而修复退变椎间盘。

成体干细胞在组织内以沉默态和激活态两种方式存在，且两种方式同时并存，在生理状态细胞发生更替或者组织遭受创伤时，对自身特异性组织中的已经分化的终末细胞具有维持，再生和替代的能力^[13-14]。因此，对正常组织的生理性稳态的维持和损伤组织的再生修复都具有重要作用。目前人们已成功从肌腱^[15-17]、骨髓^[18-19]、脂肪等组织中成功分离出成体干细胞^[20-21]。

实验从8周龄SD大鼠椎间盘髓核组织中，成功的分离出了一群独特的成体干细胞，进一步丰富了成体干细胞家族，为成体干细胞未来的研究提供了进一步的线索。实验获取的这些髓核来源细胞具备一般间充质干细胞的特性，包括克隆形成、低密度接种时高增殖活力、成骨、成脂和成软骨等多向分化潜能，将这些髓核组织来源细胞称之为髓核来源间充质干细胞。

实验结果表明，从8周龄SD大鼠中分离的髓核来源间充质干细胞在低密度接种时，表现出较高的增殖活性，这些克隆集落在大小和密度上具有着高度的一致性。这点同作者此前低密度接种肌腱干细胞结论相同，较低的接种密度即可促进细胞的增殖和富集^[22]。在髓核来源间充质干细胞处于P0和P1阶段，作者观察到不同的细胞形态，而细胞传代到P3时，观察到细胞形态逐渐统一，呈成纤维细胞样的细胞样形态。结果表明，髓核来源间充质干细胞于P3时可以用于干细胞分化和组织工程学研究。

在成体干细胞研究中，有报道称富血小板血浆可以激活肌腱干细胞向肌腱细胞分化^[23]。作者前期一项研究中，通过向兔退变椎间盘内注射PRP可以缓解甚至逆转椎间盘退变^[24]，前期推测其原因为PRP中的多种生长因子促进了椎间盘退变组织的修复，而根据此实验结论，其原因很可能为PRP激活了髓核来源间充质干细胞向髓核终末细胞分化，进而修复退变椎间盘。下一步研究将通过实验验证作者的假设。

髓核来源间充质干细胞的发现对于未来研究椎间盘退变的生物学修复具有着重大的意义。作为组织工程学种子细胞的选择，髓核来源间充质干细胞对于其他组织来源成体干细胞具有较大的优势。而利用激活剂，激活退变椎间盘中的髓核来源间充质干细胞，促进其增殖分化，产生细胞外基质填充组织缺损也无疑是一种理想的椎间盘退变早期干预方案。

综上所述，实验成功的从8周龄SD大鼠髓核组织中分离出髓核来源间充质干细胞，它表现出一般干细胞具有的特性，包括克隆形成，增殖潜能，多系分化潜能。而此类成体干细胞是否能够在老龄化SD大鼠中继续维持一定数量，促进椎间盘组织修复仍有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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