胶质细胞源性神经营养因子基因修饰后间充质干细胞的生长与分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.017

中国组织工程研究

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰后间充质干细胞的生长与分化

黄成¹，杨建东¹，冯新民¹，徐薇²，李艺楠¹，肖海翔¹，顾加祥²

1扬州大学医学院，江苏省扬州市 225001；2江苏省苏北人民医院，江苏省扬州市 225001

修回日期:2013-10-14 出版日期:2013-11-05 发布日期:2013-11-05
通讯作者: 顾加祥，主任医师，副教授，硕士生导师，苏北人民医院，江苏省扬州市 225001 gujiaxiang69@163.com
作者简介:黄成★，男，1986年生，安徽省滁州市人，汉族，扬州大学在读硕士，主要从事脊柱外科方面的研究。 hc43210@126.com
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81071466)*

Proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells modified with glial cell line-derived neurotrophic factor

Huang Cheng¹, Yang Jian-dong¹, Feng Xin-min¹, Xu Wei², Li Yi-nan¹, Xiao Hai-xiang¹, Gu Jia-xiang²

1Medical School of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China; 2Northern Jiangsu People’s Hospital, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China

Revised:2013-10-14 Online:2013-11-05 Published:2013-11-05
Contact: Gu Jia-xiang, Chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Northern Jiangsu People’s Hospital, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China gujiaxiang69@163.com
About author:Huang Cheng★, Studying for master’s degree, Medical School of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China hc43210@126.com
Supported by:
the General Project of the National Natural Science Foundation of China, No. 81071466*

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来，研究表明外源性神经营养因子或化学诱导剂可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化，但外源性诱导剂诱导作用短暂且化学性物质不可避免的对细胞活力造成负面影响，一定程度上限制了骨髓间充质干细胞的基础研究与临床应用空间。
目的：以载胶质细胞源性神经营养因子和绿色荧光蛋白基因重组腺病毒(Ad-rGDNF-GFP)转染大鼠骨髓间充质干细胞，观察目的基因在靶细胞内的表达、对细胞的营养作用及对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的影响。
方法：转染组中以Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞，感染复数分别为10，50，80，100，150，200；对照组加入等量的培养液作为对照。转染后12 h，倒置荧光显微镜观察2组中绿色荧光蛋白的表达情况；转染后72 h，流式细胞仪测定转染组中转染效率；MTT法测定2组中细胞活力；转染后5，10 d，PCR检测转染组中胶质细胞源性神经营养因子mRNA的表达；转染后5 d免疫荧光鉴定2组中神经元烯醇化酶的表达情况，转染后10 d鉴定微管相关蛋白2的表达。
结果与结论：转染后12 h，细胞中可观察到绿色荧光蛋白的表达，随时间延长荧光强度逐渐加强。以感染复数=100时绿色荧光蛋白的表达强度、稳定性较好，转染后3 d，转染效率近90%；转染后转染组细胞活力增加；转染5 d后，骨髓间充质干细胞表达神经元烯醇化酶，细胞伸出神经样细胞突起；转染10 d后，胶质细胞源性神经营养因子mRNA表达显著增强，骨髓间充质干细胞表达神微管相关蛋白2，细胞突触样结构明显且相互连接成网，呈现典型神经样细胞形态。说明以Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞，感染复数=100时，可获得较高的转染效率，胶质细胞源性神经营养因子表达后明显提高了骨髓间充质干细胞活力，并诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞定向分化。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 重组腺病毒, 胶质细胞源性神经营养因子, 神经元, 分化, 基因修饰, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Exogenous neurotrophic factors or chemical induction can induce rat bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into neuron-like cells. However, exogenous inductors exert a short inducible action, and their chemical substances inevitably have a negative impact on cell viability to limit the application prospects of bone marrow mesenchymal stem cells to a certain extent.
OBJECTIVE: To investigate the effect of glial cell line-derived neurotrophic factor, green fluorescent protein gene transfection by adenovirus vector on biological characteristics of rat bone marrow mesenchymal stem cells, to observe the expression of glial cell line-derived neurotrophic factor and green fluorescent protein and the role of nutrition on bone marrow mesenchymal stem cells, and to explore the ability to differentiate into neuron-like cells induced by glial cell line-derived neurotrophic factor.
METHODS: The bone marrow mesenchymal stem cells at passage 3 were transfected by recombinant adenovirus (Multiplicity of infection=10, 50, 80, 100, 150, 200). The experiment had two groups according to target genes: bone marrow mesenchymal stem cells were transfected by Ad-GDNF-GFP in transfection group, and bone marrow mesenchymal stem cells were not transfected in control group. The expression of green fluorescent protein was detected by inverted fluorescence microscope. Transfection efficiency was calculated by flow cytometry. Cells viability and the morphological changes of cells were compared respectively by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide and inverted fluorescence microscope between the two groups. On days 5 and 10 after transfection, the expression of glial cell-derived neurotrophic factor mRNA was detected by PCR. On day 5, the expression of neuron-specific enolase was determined by immunofluorescence examination. On day 10, the expression of microtubule-associated protein 2 was identified.
RESULTS AND CONCLUSION: By the end of 12 hours after transfection, the green fluorescent protein expressed in cells, and the fluorescence intensity gradually increased with time. When the multiplicity of infection was 100, the fluorescence intensity was strong and stable, and the transfection rate was nealy 90% on day 3 after transfection. Cell viability in the transfection group was strengthened after transfection. On day 5 after transfection, bone marrow mesenchymal stem cells expressed neuron-specific enolase, and neuron-like protrusions gradually extended. On day 10 after transfection, bone marrow mesenchymal stem cells expressed microtubule-associated protein 2 and glial cell line-derived neurotrophic factor mRNA, and exhibited neuron-like morphology and interconnected synpases. The recombinant adenovirus, Ad-GDNF-GFP, can highly transfect bone marrow mesenchymal stem cells when the multiplicity of infection is 100, and glial cell line-derived neurotrophic factor can promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into neuron-like cells.

Key words: mesenchymal stem cells, adenoviridae, transfection, cytokines

中图分类号:

R394.2

黄成，杨建东，冯新民，徐薇，李艺楠，肖海翔，顾加祥. 胶质细胞源性神经营养因子基因修饰后间充质干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.017.

Huang Cheng, Yang Jian-dong, Feng Xin-min, Xu Wei, Li Yi-nan, Xiao Hai-xiang, Gu Jia-xiang . Proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells modified with glial cell line-derived neurotrophic factor[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.017.

图/表（结果） 6

2.1 Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞后绿色荧光蛋白表达 MOI=100，转染后3 d，倒置荧光显微镜观察发现，绿色荧光蛋白可强烈表达且无明显细胞病变效应；MOI<100，荧光较弱，表达绿色荧光细胞数量明显少于前者；MOI>100，荧光强度较强，骨髓间充质干细胞出现明显的病变效应，随MOI增高，细胞病变效应越明显；因此实验以MOI=100为备选最佳感染复数值。对照组MOI=0，无绿色荧光蛋白表达，见图1。

2.2 MOI=100时Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞的效率 MOI=100转染骨髓间充质干细胞，转染后 3 d，取细胞消化、离心重悬后，经流式细胞仪观察发现转染效率>86%，转染效率较高，可基本满足基因修饰、转导要求，见图2。

2.3 Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞后的细胞活力以MOI=100转染骨髓间充质干细胞。MTT检测发现，转染后24 h，转染组与对照组细胞活力差异无显著性意义(P > 0.05)。
转染后3 d，转染组细胞活力逐渐高于对照组(P < 0.05)，见图3。

2.4 Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞后胶质细胞源性神经营养因子mRNA的表达 MOI=100转染骨髓间充质干细胞，转染后5 d，PCR凝胶电泳结果显示骨髓间充质干细胞已成功表达胶质细胞源性神经营养因子mRNA。
转染后10 d，细胞持续表达并较前增强，见图4。

2.5 Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞后神经样细胞标记物表达 Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞后5 d，免疫荧光发现神经元烯醇化酶表达，原梭形骨髓间充质干细胞胞体已发生收缩，部分细胞出现不规则突起。对照组未检测到神经元烯醇化酶表达，见图5。

Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞后10 d，成熟神经元标记物微管相关蛋白2表达，胞体向胞核收缩成锥形，有较多的长突起，细胞间或细胞自身的细长突起相互连接，末端产生多级分支，交织成网，呈现典型的神经元样细胞。对照组细胞未表达神微管相关蛋白2，见图6。

参考文献

[1] Osanai T, Kuroda S, Sugiyama T, et al. Therapeutic effects of intra-arterial delivery of bone marrow stromal cells in traumatic brain injury of rats--in vivo cell tracking study by near-infrared fluorescence imaging. Neurosurgery. 2012; 70(2):435-444.
[2] Çapk?n M, Çakmak S, Kurt FÖ, et al. Random/aligned electrospun PCL/PCL-collagen nanofibrous membranes: comparison of neural differentiation of rat AdMSCs and BMSCs. Biomed Mater. 2012;7(4):045013.
[3] Nie L, Yin YL, Liu YQ, et al. Ultrafiltration membrane extract mixture from Angelica sinensis and Hedysarum polybotrys induced transdifferentiation of BMSCs in mice: an experimental research. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2013;33(5):632-637.
[4] Zhang Y, Wu C, Friis T, et al. The osteogenic properties of CaP/silk composite scaffolds. Biomaterials. 2010;31(10): 2848-2856.
[5] Tang Z, Xie Y, Yang F, et al. Porous tantalum coatings prepared by vacuum plasma spraying enhance bmscs osteogenic differentiation and bone regeneration in vitro and in vivo. PLoS One. 2013;8(6):e66263.
[6] Yarak S, Okamoto OK. Human adipose-derived stem cells: current challenges and clinical perspectives. An Bras Dermatol. 2010;85(5):647-656.
[7] Salem HK, Thiemermann C. Mesenchymal stromal cells: current understanding and clinical status. Stem Cells. 2010; 28(3):585-596.
[8] 钟俊,刘卫平,龙乾发,等.两种诱导骨髓间充质干细胞向GABA 能神经元分化的比较[J].中华神经外科疾病研究杂志,2012, 11(2):141-144.
[9] Deng LX, Hu J, Liu N, et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 2011;229(2):238-250.
[10] 李涛,程焱.NGF基因修饰的BMSCs对SD大鼠海马区细胞凋亡及NMDAR1表达的影响[J].山东医药,2009,49(21):3-5.
[11] Horita Y, Honmou O, Harada K, et al. Intravenous administration of glial cell line-derived neurotrophic factor gene-modified human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebral ischemia model in the adult rat. J Neurosci Res. 2006;84(7):1495-1504.
[12] Wang Y, Chang CF, Morales M, et al. Protective effects of glial cell line-derived neurotrophic factor in ischemic brain injury. Ann N Y Acad Sci. 2002;962:423-437.
[13] Mohammad-Gharibani P, Tiraihi T, Mesbah-Namin SA, et al. Induction of bone marrow stromal cells into GABAergic neuronal phenotype using creatine as inducer. Restor Neurol Neurosci. 2012;30(6):511-525.
[14] Ye Y, Zeng YM, Wan MR, et al. Induction of human bone marrow mesenchymal stem cells differentiation into neural-like cells using cerebrospinal fluid. Cell Biochem Biophys. 2011;59(3):179-184.
[15] Sagara J, Makino N. Glutathione induces neuronal differentiation in rat bone marrow stromal cells. Neurochem Res. 2008;33(1):16-21.
[16] 娄远蕾,涂伟,汪泱,等.经阿魏酸钠定向诱导的骨髓间充质干细胞在脑缺血大鼠体内移植研究[J].中国微侵袭神经外科杂志,2010, 15(12):558-561.
[17] 陈兵,尹延庆,柯俊龙,等.川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞:最佳诱导剂量筛选[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(6):1072-1077.
[18] Lin LF, Doherty DH, Lile JD, et al. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 1993;260(5111):1130-1132.
[19] Garbayo E, Montero-Menei CN, Ansorena E, et al. Effective GDNF brain delivery using microspheres--a promising strategy for Parkinson's disease. J Control Release. 2009; 135(2):119-126.
[20] Li L, Lü G, Wang YF, et al. Glial cell-derived neurotrophic factor mRNA expression in a rat model of spinal cord injury following bone marrow stromal cell transplantation. Neural Regen Res 2008;3(10):1056-1059.
[21] Yaghoobi MM, Mahani MT. NGF and BDNF expression drop off in neurally differentiated bone marrow stromal stem cells. Brain Res. 2008;1203:26-31.
[22] Van Damme A, Vanden Driessche T, Collen D, et al. Bone marrow stromal cells as targets for gene therapy. Curr Gene Ther. 2002;2(2):195-209.
[23] 熊怀林,杨朝鲜,高小青,等.在GDNF 基因修饰的骨髓基质细胞与缺氧复氧神经细胞的共培养中神经细胞凋亡的变化[J].泸州医学院学报,2011,34(5):552-555.
[24] 熊怀林,杨朝鲜,高小青,等.胶质源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞与缺氧复氧神经细胞的共培养[J].中国组织工程研究,2011,15(49):9141-9145.
[25] 李娟,廖彦生,杨朝鲜.GDNF 基因修饰对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的影响[J].泸州医学院学报,2012, 35(5): 455-459.
[26] 管小俊,宋琳,郭雪君,等.携带绿色荧光蛋白基因慢病毒转染的大鼠骨髓间充质干细胞的干细胞特性检测[J].诊断学理论与实践, 2011,10(6):527-530.
[27] 李洋,田瑜,武志超,等.稳定转染增强型绿色荧光蛋白大鼠骨髓间充质干细胞系的建立[J].中国组织工程研究,2012;16(41): 7607-7611.
[28] Shen LH, Li Y, Chopp M. Astrocytic endogenous glial cell derived neurotrophic factor production is enhanced by bone marrow stromal cell transplantation in the ischemic boundary zone after stroke in adult rats. Glia. 2010;58(9):1074-1081.
[29] Heermann S, Spittau B, Zajzon K, et al. Schwann cells migrate along axons in the absence of GDNF signaling. BMC Neurosci. 2012;13:92.
[30] Wu J, Yu W, Chen Y, et al. Intrastriatal transplantation of GDNF-engineered BMSCs and its neuroprotection in lactacystin-induced Parkinsonian rat model. Neurochem Res. 2010;35(3):495-502.
[31] Gash DM, Zhang Z, Ovadia A, et al. Functional recovery in parkinsonian monkeys treated with GDNF. Nature. 1996; 380 (6571): 252-255.
[32] Chopp M, Li Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet Neurol. 2002;1(2):92-100.
[33] Cornejo M, Nambi D, Walheim C, et al. Effect of NRG1, GDNF, EGF and NGF in the migration of a Schwann cell precursor line. Neurochem Res. 2010;35(10):1643-1651.
[34] Pastor D, Viso-León MC, Jones J, et al. Comparative effects between bone marrow and mesenchymal stem cell transplantation in GDNF expression and motor function recovery in a motorneuron degenerative mouse model. Stem Cell Rev. 2012;8(2):445-458.
[35] Kitiyanant N, Kitiyanant Y, Svendsen CN, et al. BDNF-, IGF-1- and GDNF-secreting human neural progenitor cells rescue amyloid β-induced toxicity in cultured rat septal neurons. Neurochem Res. 2012;37(1):143-152.
[36] Liu Y, Zhang BA, Song Y, et al. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for treatment of spinal cord injury: an in vivo magnetic resonance imaging tracking study. Neural Regen Res. 2011;6(13):978-982.
[37] Wang D, Zhang JJ. Electrophysiological functional recovery in a rat model of spinal cord hemisection injury following bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation under hypothermia. Neural Regen Res. 2012;7(10): 749-755.
[38] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 2000;61(4):364-370.
[39] Edamura K, Kuriyama K, Kato K, et al. Proliferation capacity, neuronal differentiation potency and microstructures after the differentiation of canine bone marrow stromal cells into neurons. J Vet Med Sci. 2012;74(7):923-927.
[40] Sanchez-Ramos J, Song S, Cardozo-Pelaez F, et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Exp Neurol. 2000;164(2):247-256.
[41] Yang S, Gao Q, Bao L, et al. Striatal extracts promote the dopaminergic differentiation of GFP-bone mesenchymal stem cells. Neurosci Lett. 2012;530(2):115-120.
[42] Sanchez-Ramos J, Song S, Cardozo-Pelaez F, et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Exp Neurol. 2000;164(2):247-256.

引言

骨髓间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞，具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，免疫原性弱等特点^[1-3]，体外在不同条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和神经样细胞等^[4-8]，且外基因转染效率高，能稳定高效表达外源性目的基因^[9-10]，近年来已被广泛应用于治疗神经系统损伤、退行性病变，组织损伤修复等多种疾病的研究^[11-12]。

目前，体外将骨髓间充质干细胞诱导为神经样细胞的诱导剂主要为4种：细胞因子、化学物质、传统中药以及细胞因子联合化学物质^[13-17]。其中，化学诱导剂诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞定向分化的速度较快，但诱导剂本身多具有一定的细胞毒性，造成分化后细胞存活率较低；细胞因子诱导剂虽避免了这一劣势，但细胞因子蛋白的提纯、合成过程较为复杂，一定程度上了限制了该方法在临床上广泛研究与应用；传统中药诱导方法虽有成功案例，鉴于中药成分复杂，不利于对分化机制的进一步探索。因此，探索新型的体外诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞定向分化的方法具有重要的临床科研意义和应用前景。

胶质细胞源性神经营养因子由Lin等^[18]首次从B49细胞系中分离，研究表明该神经因子可促进多巴胺能神经元、运动神经元、感觉神经元等多种神经元的存活，进一步研究认为胶质细胞源性神经营养因子对治疗神经损伤和神经退行性疾病具有良好的应用前景^[19-20]。

鉴于胶质细胞源性神经营养因子对多种神经样细胞的营养作用，以及骨髓间充质干细胞在治疗脑、脊髓及周围神经损伤中的重要意义，实验采用基因修饰方法，将对神经细胞有分化、营养作用的胶质细胞源性神经营养因子基因导入骨髓间充质干细胞，观察在内源性胶质细胞源性神经营养因子作用下骨髓间充质干细胞生长及向神经样细胞分化情况，为干细胞移植治疗神经系统损伤探索新的思路。

材料方法

设计：体外细胞学观察研究。

时间及地点：实验于2012年11月至2013年5月在扬州大学中心实验室及扬州大学医学院实验大型平台完成。

材料：

实验动物： SD大鼠5只，雌雄不限，体质量约100 g，由扬州大学比较医学中心提供，动物许可证号：SCXK (苏)2012-0004。实验中对动物的处理符合动物伦理学的要求。

病毒：载胶质细胞源性神经营养因子和绿色荧光蛋白基因重组腺病毒(Ad-rGDNF-GFP)由扬州大学医学院生化实验室、扬州大学医学院附属苏北人民医院脊柱外科、检验科进行构建及扩增。

转染间充质干细胞培养的主要试剂与仪器：

方法：

大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养：SD大鼠水合氯醛麻醉后处死，取股骨，剪除骨骺端，用含体积分数10%胎牛血清、1.0×10⁸ U/L青霉素、1.0×10⁸ U/L链霉素和2.0×10⁷ U/L DMEM冲洗骨髓腔，取混合骨髓液4 mL缓慢注入含6 mL淋巴细胞分离液的离心管内， 1 200×g离心30 min；取中间层单核细胞接种于 25 cm²培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温细胞培养箱静置培养。

4 d后首次换液，之后每隔3 d换液，培养10-14 d 后，细胞达90%左右融合度时，以0.25%胰蛋白酶消化传代，传至第3代备用。

病毒转染：取第3代大鼠骨髓间充质干细胞，每组按1×10⁵/孔浓度接种于6孔板，常规培养24 h，待细胞贴壁后吸去上清。转染组以Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞，每孔加入总体积为2 mL含不同体积分数的无血清DMEM培养液和重组腺病毒悬液，使感染复数(MOI)分别为10，50，80，100，150，200；对照组仅加入2 mL的无血清DMEM培养液。

2组细胞置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温细胞培养箱中孵育2 h后，均更换为2 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。

倒置荧光显微镜每12 h对细胞进行观察，以转染后的细胞不引起明显细胞病变效应(绿色荧光表达弱、细胞形态不完整且有明显细胞溶解反应)的最大MOI值作为本次实验最佳MOI值，并依此MOI值进行后续实验及相关检测。

流式细胞仪测定最佳MOI值转染效率：取第3代骨髓间充质干细胞，每组按1×10⁵/孔浓度接种于6孔板，以最佳的MOI值转染。转染后3 d，更换培养液，PBS清洗2次后，以含EDTA胰酶消化细胞，弃上清，100 μL PBS重悬后，转移至流式管中。

流式细胞仪测定流式管中细胞总数、表达绿色荧光蛋白细胞数，并计算绿色荧光蛋白阳性细胞占总细胞百分数，计为转染效率。

MTT测定转染后细胞的活力：以最佳MOI值转染第3 代骨髓间充质干细胞，每组按1×10⁴/孔浓度接种于4块96孔板，置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温细胞培养箱中孵育。

在培养1，3，5，7 d时间点每组取出一块96孔板，避光下加入20 μL MTT，恒温箱中孵育4 h后弃MTT，加二甲基亚砜150 μL/孔，振荡10 min，酶标仪检测，记录吸光度值，重复试验3次。

反转录PCR检测转染后细胞中胶质细胞源性神经营养因子mRNA的表达：取第3 代骨髓间充质干细胞，每组按1×10⁵/孔浓度接种于6孔板，以最佳MOI值转染，转染后置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温细胞培养箱中继续培养，分别于转染5，10 d后采用TRIzol法提取细胞的总RNA，反转录制备cDNA，以cDNA为模板，在反应体系中加入目的基因的引物，设定反应参数，进行目的基因的扩增。

rGDNF基因的引物序列：正义链：5’-ATG AAG TTA TGG GAT GTC GTG GC-3’；反义链：5’-CGT TTA GCG GAA TGC TTT CTT AGG A-3’。反应参数：94 ℃，4 min预变性；94 ℃，30 s变性，55 ℃，1 min退火，72 ℃，15 min延伸；最后72 ℃，10 min延伸；总循环数35，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

免疫荧光检测转染后细胞中神经元烯醇化酶和微管相关蛋白2的表达：取第3代骨髓间充质干细胞，每组按1×10⁴/孔浓度接种于预先置有细胞爬片的24孔板中，常规培养24 h后吸去培养液、PBS清洗2遍后，转染组以最佳MOI值转染骨髓间充质干细胞，转染方法同前所述，对照组仅加入等量培养常规培养。转染后将培养板置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温细胞培养箱中常规培养。转染后 5 d，分别从2组中取出细胞爬片，PBS洗涤2次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，1 g/L Triton作用15 min，PBS洗涤3次，封闭血清工作液室温孵育 30 min，弃血清后分别加入抗神经元烯醇化酶(1∶200)一抗，置于湿盒中4 ℃过夜后，PBS洗3次，加入生物素标记红色荧光的二抗(1∶250)工作液室温孵育2 h，PBS洗涤3次后加入DAPI染色10 min，封固、倒置荧光显微镜观察神经元烯醇化酶表达情况。

转染后10 d，再次取出细胞爬片，免疫荧光鉴定微管相关蛋白2的表达，具体步骤同上，其中微管相关蛋白2一抗浓度为1∶800，绿色荧光二抗浓度为1∶250，倒置荧光显微镜观察鉴定结果。

主要观察指标：Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞后绿色荧光蛋白表达情况，最佳MOI的探索与其转染效率的测定，以及转染后细胞活力的评价，免疫荧光鉴定神经样细胞标记物神经元烯醇化酶与微管相关蛋白2在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达情况。

统计学分析：收集实验数据，用SPSS 17.0软件进行分析，采用单因素方差分析分进行统计学分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞是一种多功能干细胞，除可向骨、软骨细胞等分化外，亦可向神经样细胞分化，并在分化过程中分泌细胞因子，对神经细胞有营养支持作用^[21]。此外，该细胞易获取和体外大量扩增，Van Damme等^[22]报道指出骨髓间充质干细胞易于基因转染，可用于自体移植，是良好的转基因载体细胞。既往研究表明，腺病毒可作为介导基因转移和表达的重要工具，其感染靶细胞的范围广，感染靶细胞效率及感染后靶细胞目内基因表达率均较高，并可维持较长时间的转染效果^[23-26]。

实验发现当MOI=100转染骨髓间充质干细胞后，转染后12 h荧光显微镜即可观察到绿色荧光蛋白的表达，转染后3 d荧光显著增强，且流式细胞技术测定转染效率近90%，当MOI < 100，转染后3 d，荧光显微镜观察发现，荧光强度明显弱于较MOI=100转染组；此外，PCR结果发现，MOI=100，转染后10 d仍可检测到胶质细胞源性神经营养因子的表达，故本研究认为，以Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞，MOI=100时在获得高转染效率的同时，可实现目的基因的较长时间在靶细胞内表达，为内源性基因的持续性作用于靶细胞奠定基础。

另外，实验发现当MOI=150时，转染后3 d，骨髓间充质干细胞出现了明显的病变效应，MOI=200，多数细胞出溶解、现死亡，即病毒本身可对细胞活力产生负面影响，但MTT动态检测结果表明，以MOI=100转染骨髓间充质干细胞，在较长时间内细胞活力显著高于空白对照组，先前研究已证实胶质细胞源性神经营养因子对神经元有营养、促进的生长^[27-31]，综合这次实验MTT与PCR结果，可推测细胞活力的提高是由于胶质细胞源性神经营养因子持续性作用占据优势的结果。

近年来，国内外研究表明将大鼠骨髓间充质干细胞移植到脑或脊髓损伤区域后，发现损伤区面积较对照组明显减小，实验动物的运动功能较对照组也明显恢复^[32-38]，尽管对实现这些利好方面的机制研究并不统一，但已有研究证实胶质细胞源性神经营养因子能显著的影响运动神经元并选择性的保护黒质纹状体内多巴胺能神经元通路，其对神经元的营养保护作用强于目前已报道的其他几种神经营养因子^[12]。实验发现在转染后5 d，可检测到神经元特异性标记物神经元烯醇化酶的表达，观察细胞形态发现，在胶质细胞源性神经营养因子作用下细胞由原梭形逐渐收缩，部分细胞出现神经细胞突触样结构。转染后10 d，微管相关蛋白2的表达进一步的说明了骨髓间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子作用下的向成熟神经元分化。

此外，与既往Woodbury等^[38-40]为代表的利用抗氧化剂作为诱导剂相比较，化学诱导剂虽成功的促使骨髓间充质干细胞呈现出神经样细胞形态变化，并检测到骨髓间充质干细胞相关表达了神经元烯醇化酶和微管相关蛋白2等相关神经元标记物，但诱导分化效率不高，在诱导过程中细胞出现了较明显的死亡^[39-41]，而实验发现在胶质细胞源性神经营养因子的作用下，细胞呈现典型的神经样细胞形态、表达神经元特异性标记物的同时，MTT结果证实细胞分化过程中保持了较高的活力；Yang等^[41-42]发现富含多种细胞因子的脑组织提取物、脑脊液可诱导骨髓间充质干细胞向神经元分化，但外源性生长因子无法持续诱导骨髓间充质干细胞分化和营养神经元，同时诱导剂成分混杂，无法确定在骨髓间充质干细胞分化过程中起关键作用的因素，而作者这次研究发现将胶质细胞源性神经营养因子基因导入骨髓间充质干细胞 5 d后，细胞表达了神经元特异性标记物神经元烯醇化酶，10 d后，表达了成熟神经元标记物神微管相关蛋白2，而对照组未发现神经元标记物的表达，由此认为胶质细胞源性神经营养因子在骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化过程中起到重要作用。

因此，腺病毒载胶质细胞源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞胞后，细胞可较稳定、持续性的表达目的基因，在胶质细胞源性神经营养因子基因持续作用下骨髓间充质干细胞可向神经元分化，为治疗脑、脊髓损伤疾病提供进一步的实验依据。

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰后间充质干细胞的生长与分化

Proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells modified with glial cell line-derived neurotrophic factor

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[2]	赵春涛, 卿明松, 余浪波, 彭笳宸. 运动学对线和机械力学对线指导全膝关节置换效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1435-1442.
[3]	陈强, 卓鸿武, 夏天, 叶哲伟. 不同质量浓度异烟肼对体外培养乳鼠成骨细胞的毒性作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1162-1167.
[4]	涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.
[5]	张聪, 赵岩, 杜小宇, 杜欣瑞, 庞廷娟, 付怡凝, 张浩, 张步洲, 李筱贺, 王利东. 青少年特发性脊柱侧凸腰主弯患者腰椎-骨盆的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1155-1161.
[6]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[7]	陈劲松, 王中汉, 常非, 刘贺. 多种特殊状态下关节软骨缺损修复的组织工程技术[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1272-1279.
[8]	乔雪松, 陈霓, 杨风英, 牛燕媚. 运动调控间充质干细胞来源骨髓脂肪细胞的作用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1293-1298.
[9]	费静, 郑红弟, 余莉亚, 李雷激. 胶质细胞源性神经营养因子/PI3K/AKT通路参与电针促进面神经压榨损伤模型兔的面神经再生 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1094-1100.
[10]	张圣敏, 刘超. 生物支架材料诱导脂肪来源干细胞成骨分化的最新热点[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1107-1116.
[11]	王田田, 王建忠. 骨髓间充质干细胞治疗早期股骨头坏死的应用与前景 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1117-1122.
[12]	王张玲, 余丽梅, 赵春华. 间充质干细胞线粒体转移治疗修复组织损伤的作用 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1123-1129.
[13]	邓俊豪, 李苗, 张里程, 唐佩福. 三维悬滴法培养间充质干细胞在组织损伤修复中的应用及优势[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1101-1106.
[14]	任春梅, 刘玉芳, 许诺, 邵苗苗, 何建亚, 李晓杰. 非编码RNAs在人牙髓干细胞中的调控作用及机制 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1130-1137.
[15]	黄文文, 李硕, 侯宗柳, 王文举. 炎症性肠病发病机制及间充质干细胞治疗的作用与问题 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1138-1143.