角质细胞无血清培养基促进大鼠毛囊干细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.015

中国组织工程研究

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

角质细胞无血清培养基促进大鼠毛囊干细胞的增殖

张志强，王玉杰，木拉提•热夏提，李佳

新疆医科大学第一附属医院泌尿外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2013-09-02 出版日期:2013-11-05 发布日期:2013-11-05
通讯作者: 王玉杰，博士，教授，主任医师，新疆医科大学第一附属医院泌尿外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 wangyj-mr@vip.sina.com
作者简介:张志强★，男，1986年生，汉族，新疆维吾尔自治区新源县人，新疆医科大学第一附属医院在读硕士，主要从事泌尿系统组织工程方面的研究。 526611494@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金(81160088)*；新疆医科大学第一附属医院科研专项基金

Keratinocyte serum-free medium promotes the growth of rat hair follicle stem cells

Zhang Zhi-qiang, Wang Yu-jie, Muratrixat, Li Jia

Department of Urology, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2013-09-02 Online:2013-11-05 Published:2013-11-05
Contact: Wang Yu-jie, M.D., Professor, Chief physician, Department of Urology, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China wangyj-mr@vip.sina.com
About author:Zhang Zhi-qiang★, Studying for master’s degree, Department of Urology, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China 526611494@qq.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81160088*; the Special Fund for Scientific Research of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, No. 2012ZZGC05*

摘要/Abstract

摘要：

背景：以往研究培养毛囊干细胞多使用DMEM/F12+体积分数10%胎牛血清培养基，而进年来开发出的角质细胞无血清培养基也可应用于毛囊干细胞的培养。
目的：观察3种不同培养基对大鼠毛囊干细胞增殖情况及干细胞纯度的影响。
方法：取大鼠触须部皮肤组织，体式显微镜下分离出毛囊组织，中性蛋白酶Ⅱ与胰蛋白酶和乙二胺四乙酸混合液“两步酶法”消化。所得细胞悬液按细胞数平均分为3份，分别使用角质细胞无血清培养基、DMEM/F12+体积分数10%胎牛血清及角质细胞无血清培养基+体积分数10%胎牛血清共3种培养基培养，Ⅳ型胶原差速贴壁法筛选毛囊干细胞，进行传代培养。
结果与结论：培养毛囊干细胞传至第3代，锥虫蓝染色计数法检测结果显示，此3组间细胞活率差异无显著性意义(P > 0.05)。CCK8比色法检测细胞生长曲线显示，培养前2 d，此3组细胞生长均较缓慢；培养4 d，细胞生长进入对数生长期，3种培养基培养的细胞增殖活性：角质细胞无血清培养基+10%胎牛血清组>DMEM/F12+10%胎牛血清>角质细胞无血清培养基(P < 0.05)。流式细胞仪检测显示，角质细胞无血清培养基组CD34的表达高于角质细胞无血清培养基+10%胎牛血清组(P < 0.05)。DMEM/F12+10%胎牛血清组中CD34、β1-整合素(CD29)及CK15标记物的表达低于其他2组(P < 0.05)。结果表明，角质细胞无血清培养基较DMEM/F12+体积分数10%胎牛血清能培养出纯度更高的毛囊干细胞，并且在此培养基培养的基础上加入血清，能够促进毛囊干细胞的增殖。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 毛囊干细胞, 培养, 角质细胞无血清培养基, 增殖, 生物活性, 生长曲线, 流式细胞术, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The hair follicle stem cells are usual cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12 containing 10% fetal bovine serum. Recently, keratinocyte serum-free medium has been used to culture hair follicle stem cells.
OBJECTIVE: To observe the effects of three different culture media on the proliferation and purity of hair follicle stem cells.
METHODS: After sterling, the skin of the rat’s beard was cut off, and the vibrissa follicles were dissected under a stereocroscope. The follicles were digested by Dispase Ⅱ firstly and by the mixture of trypsin and EDTA secondly. Cell suspension was divided into three pieces based on the average number of cells and respectively cultured by keratinocyte serum-free medium, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12 containing 10% fetal bovine serum and keratinocyte serum-free medium containing 10% fetal bovine serum. Hair follicle stem cells were selected by rapid adherence on collagen type Ⅳ, and passaged.
RESULTS AND CONCLUSION: Cultured hair follicle stem cells spread to the third generation, and trypan blue assay showed there was no difference in cell survival rate among the three groups (P > 0.05). Cell Counting Kit 8 assay showed that the cells grew slowly in the three groups in the first 2 days. At day 4, the hair follicle stem cells grew into the growth logarithmic phase, and the proliferative activity was ranked as follows: keratinocyte serum-free medium+10% fetal bovine serum > Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12+10% fetal bovine serum > keratinocyte serum-free medium with a significant difference between the three groups (P < 0.05). Flow cytometric examination showed the expression of CD34 in the keratinocyte serum-free medium+10% fetal bovine serum group was lower than that in the keratinocyte serum free medium group (P < 0.05). The expressions of CD34, CK15 and β1-integrin (CD29) in the Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12+10% fetal bovine serum were lower than those in the other two groups (P < 0.05). These findings indicate that we can obtain higher purity hair follicle stem cells in the keratinocyte serum-free medium+10% fetal bovine serum than in the Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12+10% fetal bovine serum.

Key words: stem cells, vibrissae, hair follicle, culture media, serum-free, proliferation(2012ZZGC05)*

中图分类号:

R394.2

张志强，王玉杰，木拉提•热夏提，李佳. 角质细胞无血清培养基促进大鼠毛囊干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.015.

Zhang Zhi-qiang, Wang Yu-jie, Muratrixat, Li Jia. Keratinocyte serum-free medium promotes the growth of rat hair follicle stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.015.

图/表（结果） 3

2.1 体外培养的大鼠毛囊干细胞形态第3代毛囊干细胞培养至第6天，镜下观察细胞折光性强，K-SFM组及K-SFM+体积分数10%FBS组细胞均匀一致，呈典型的“枭眼”状，且K-SFM+体积分数10%FBS组细胞明显较K-SFM组汇合率增高，DMEM/F12+体积分数10%FBS组中细形态不均一，可见较多其他种类细胞，见图1。

2.2 体外培养的大鼠毛囊干细胞存活情况第3代毛囊干细胞培养至第6天，各组毛囊干细胞存活率：K-SFM组为(93.9±2.5)%，K-SFM+体积分数10%FBS组为(95.3±2.3)%，DMEM+体积分数10%FBS组为(96.6± 2.0)%，3组细胞存活率差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.3 不同培养基对大鼠毛囊干细胞的增殖能力的影响 CCK-8法绘制第3代各组毛囊干细胞生长曲线，每组测定吸光度值均设8个复孔，以培养时间作为横坐标，以8个吸光度值的均数作为纵坐标，绘制生长曲线。结果显示，各组细胞接种前2 d处于生长缓慢，K-SFM+体积分数10%FBS组及DMEM+体积分数10%FBS组细胞于接种第4天开始进入对数生长期，DMEM+体积分数10%FBS组第5天开始进入对数生长期，K-SFM+体积分数10%FBS组细胞于接种第6天即进入了平台期，见图2。

CCK-8法检测各组细胞吸光度值，培养前2 d各培养基组之间吸光度值经统计学分析差异无显著性意义(P > 0.05)，这可能原因是这段时间内各组细胞浓度较小，细胞尚处于生长缓慢的潜伏期，细胞增殖不明显。培养第4-11天，3组之间细胞增殖能力差异均有显著性意义(P < 0.05)，K-SFM+体积分数10%FBS组及DMEM+体积分数10%FBS组的细胞增殖能力强于K-SFM组(P < 0.05)，K-SFM+体积分数10%FBS组较DMEM+体积分数10%FBS组增殖能力强(P < 0.05)，见图2。
2.4 大鼠毛囊干细胞CD34、β1整合素(CD29)和CK15的表达见表1。

培养第3代毛囊干细胞至第6天，流式细胞仪分别测定CD34、β1整合素(CD29)及CK15在3组细胞中表达的百分比。结果显示，K-SFM组及K-SFM+体积分数10%FBS较DMEM+体积分数10%FBS组CD34、β1整合素(CD29)及CK15表达高(P < 0.05)。但K-SFM组仅CD34表达较K-SFM+体积分数10%FBS组高(P < 0.05)，而β1整合素(CD29)和CK15K-SFM 及K-SFM+体积分数10%FBS比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

发生于膀胱的先天性及后天性疾病均可直接导致膀胱组织结构或功能丧失，而且不可修复，给患者带来极大的痛苦，而干细胞研究为疾病的治疗提供了崭新的思路^[1]。但在组织工程研究中，如何能够获得大量的种子细胞便成为了首要任务。

毛囊干细胞存在于毛囊中，属于成体干细胞，是毛囊中的原始细胞，具有多向分化的潜能，能通过自身的分裂增殖产生人体所需的细胞^[2]。毛囊干细胞因其易获得，易培养与扩增，具有高度多能性，不存在伦理问题而越来越受到国内外医学研究人员的青睐^[3]。最近研究发现毛囊干细胞在体外可向构成膀胱所必须的平滑肌^[4-5]、神经、尿路上皮细胞方向分化^[6]，从而给实验提供了膀胱组织工程所需的种子细胞。目前仍然未有一种国内外公认的，规范的毛囊干细胞特定的培养基。国内外研究者尝试着使用过许多不同类型的培养基进行培养大鼠毛囊干细胞，并且毛囊干细胞也能够在其中生长，其中包括DMEM+体积分数10%胎牛血清^[7-8]，DMEM/F12+体积分数10%胎牛血清等基础培养基^[9]，以及近年来研制出的角质细胞无血清培养基(keratinocyte serum-free medium，K-SFM)^[10]，具体哪种培养基最适合于毛囊干细胞的生长，且最能够保证毛囊干细胞的生物特性，目前尚不知晓。DMEM/F12是开发成为无血清培养基的基础，角质细胞无血清培养基经常用于食管上皮、表皮细胞、毛囊干细胞这些上皮来源细胞的培养。并且血清在培养毛囊干细胞中的作用也尚不明确，华云旗等^[11]认为毛囊干细胞对于血清有依赖性，但符刚等^[12]则认为血清成分具有不稳定性，并且有可能对毛囊干细胞产生诱导作用，从而改变其生物活性。

因此，实验加入了常规剂量血清的角质细胞无血清培养基与常规培养基相比较，研究角质细胞无血清培养基对毛囊干细胞增殖及生物学特性的影响，并且研究其中血清的作用。期望寻找一种最为适合毛囊干细胞生长的培养基，从而可以在最短的时间内可以获得最为大量的且纯度较高的毛囊干细胞，从而能更好的满足在组织工程中需要数目巨大的干细胞这一问题，为更一步探讨毛囊干细胞作为种子细胞在膀胱缺损疾病修复中的作用及机制做铺垫。

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：实验于2012年8月至2013年5月在新疆医科大学第一附属医院科技楼干细胞室完成。

材料：健康清洁级出生八九天的SD大鼠乳鼠15只，由新疆医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(新)2003-0001。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》^[13]。

大鼠毛囊干细胞体外培养实验相关试剂：

实验方法：

大鼠毛囊干细胞的培养及分组：麻醉后处死出生后八九天乳鼠，碘伏消毒触须部皮肤，眼科剪剪下触须部组织，触须部组织浸泡于体积分数75%乙醇中，带回洁净室。高浓度青、链霉素的PBS反复冲洗3次，超净台内在体视显微镜下分离出单个毛囊组织。将分离出的组织置于质量浓度0.25 g/L 的DispaseⅡ中，37 ℃摇床消化2 h，取出组织后PBS冲洗3遍，置于质量浓度2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L乙二胺四乙酸消化液中37 ℃摇床消化1 h，用200目钢网过滤^[14]，收集滤液，257×g离心5 min，弃上清，细胞计数后将细胞等分为3份，分别接种于3个Ⅳ型胶原包被的25 mL培养瓶中。实验分为3组，分别为K-SFM，K-SFM+体积分数10%FBS，DMEM/F12+体积分数10%FBS组，3组置于培养箱中静置30 min后，弃去未贴壁的细胞，再次加入培养液，置于体积分数5%CO₂、37 ℃孵育箱中继续培养，每隔两三天换液1次，待细胞浓度达70%-80%时采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸混合液消化传代，上述实验重复3次。

大鼠毛囊干细胞存活率的测定：分别取3组细胞胰酶消化第3代培养了6 d的待传代的贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释，细胞悬液与体积分数0.4%锥虫蓝溶液以9∶1混合混匀，在光学显微镜下于3 min内，分别计数活细胞和死细胞，实验重复8次。

细胞存活率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%

CCK-8比色法分析不同培养方式对大鼠毛囊干细胞增殖活性影响：取3组第3代毛囊干细胞按2.0×10³/孔分别接种到3块预铺Ⅳ型胶原的96孔板内，每组细胞仍使用原培养基培养。每隔24 h任取8个孔，每孔加入CCK-8液 10 μL，继续培养2 h后用酶联免疫检测仪测定吸光度值(A_{450 nm})结果进行统计学分析，并描绘出细胞增殖曲线。

流式细胞仪检测不同培养方式下大鼠毛囊干细胞CD34、β1整合素，CK15表达情况：消化第3代毛囊干细胞，取1×10⁶个细胞，PBS离心洗涤2次，加PBS 100 μL重悬，分别加入的FITC anti-mouse β1整合素(CD29)和PE anti-mouse CD34各1 μL，避光反应30 min，加PBS至500 μL，另1×10⁶个细胞100 μL PBS重悬，按说明书加入细胞角蛋白15(Anti-Cytokeratin 15 antibody [LHK15]- BSA and Azide free ab80522)一抗孵育1 h，PBS洗涤2次，弃上清，加入二抗FITC-羊抗小鼠IgG，避光孵育30 min，PBS洗涤2次，另取1×10⁶个细胞不加任何抗体作为空白对照，上机检测，每组上述每个抗体均检测8次。

主要观察指标：大鼠毛囊干细胞培养后细胞形态，生长曲线，β1整合素(CD29)，CD34，CK15的表达。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，由第一作者用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，组间均数差异的比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

毛囊干细胞是是存在于毛囊中的具有多向分化潜能的干细胞。毛囊干细胞在培养下可以向软骨、骨骼，脂肪等细胞分化^[15]，在体内膀胱及周围组织环境作用下有可能向膀胱组织最主要的两种组成细胞(尿路上皮细胞和平滑肌细胞)分化^[16-18]，从而成为泌尿系统组织工程的种子细胞，具有广阔的研究前景。

应用于毛囊干细胞的培养基种类居多，但目前，尚未研究出标准的培养大鼠毛囊干细胞的培养基，其中最为常见的有DMEM/F12+体积分数10%FBS，K-SFM，K-SFM+体积分数10%FBS这3种。DMEM/F12营养成分复杂，含有多种微量元素，经常被应用于干细胞的培养。K-SFM为无血清角质细胞培养液，其为Gibco公司所设计的专为培养上皮细胞所使用的无血清培养基，其中除了细胞生长所需的常规营养物质外，还加入了人重组表皮生长因子和牛脑垂体提取物(BPE)等适合上皮来源细胞生长的细胞因子^[19]。史明艳等^[20]的研究也发现生长液中添加表皮生长因子有利于毛囊干细胞的体外培养，表明表皮生长因子对于毛囊干细胞的生长有促进作用。

实验中生长曲线显示不同培养基中干细胞细胞生长速率结果显示：K-SFM+体积分数10%FBS > DMEM/ F12+体积分数10%FBS >K-SFM，表明血清是促进毛囊干细胞生长的一个重要因素。无血清培养液在设计时，便没有克服其培养细胞的很多缺点，其中包括不易贴壁，缺乏胰酶抑制剂等，并且即使添加了血清的主要成分，且含有表皮生长因子及牛脑垂体提取物等成分促进上皮生长的成分，其中的营养物质仍然不及添加血清丰富^[21]，考虑K-SFM中缺乏一些毛囊干细胞生长所必须的营养物质。血清中含有多种生长因子可促进细胞的繁殖，具有抗胰酶活性防止消化后残留的胰酶对细胞产生损伤，含有附着因子可促进细胞之间的黏附及细胞与Ⅳ型胶原等细胞基质之间的黏附^[22]，从而使毛囊干细胞更加容易贴壁。因此K-SFM生长最慢，而加入了血清DMEM/F12则生长稍快，营养物质最为丰富的K-SFM+体积分数10%FBS组，则生长最为迅速，因此表明含有多种生长因子及营养物质的血清与含有EGF及BPE的K-SFM的共同作用下，最适宜毛囊干细胞的快速增长。

目前，有关毛囊干细胞培养及增殖的相关研究如下(CNKI：按主题排序)：

由于毛囊中含有许多除毛囊干细胞以外不同种类的细胞，因此使用消化酶法培养毛囊干细胞中，不仅要考虑细胞的增殖速率，还要尽可能的保证干细胞的纯度。实验使用了显微分离法+两步酶法联合差速贴壁法提取毛囊干细胞，从而尽可能的在细胞提取方面保证干细胞的纯度较高^[23]，在实验方法均相同的情况下，细胞培养基的不同，便成为了决定细胞纯度不同的因素。通常认为的毛囊干细胞的标记有CD34，keratin15，Ck15，CD200，β1整合素等^[24]。其中CD200主要在人类毛囊干细胞中表现为阳性^[25]，而鼠类毛囊干细胞则不表达，Oh等^[26]发现CK15是一个人类及鼠类毛囊干细胞共用的标志。CD34是一个相对分子质量105 000-120 000的糖蛋白，在人造血组细胞中及鼠类毛囊干细胞中高表达^[27]，而在人类的毛囊干细胞中低表达^[28]。Zhang等^[29]成功的使用了β-整合素1作为了毛囊干细胞的标记物，此后β-1整合素广泛应用于毛囊干细胞的鉴定。实验挑选其中公认的CD34，Ck15，β1整合素3个指标对毛囊干细胞进行鉴定^[30]。DMEM/F12+体积分数10%FBS可以应用于很多细胞的培养，因此毛囊组织中毛囊干细胞以外的细胞也能在其中很好的生长。K-SFM为专为上皮细胞培养设计的培养基，毛囊干细胞位于毛囊外根鞘隆突部，属于上皮细胞来源，因此能在其中能较好的生长。而毛囊中真皮来源的细胞，如毛乳头细胞，内根鞘细胞的生长则会受影响。曾志勇等^[31]发现K-SFM培养中，成纤维细胞的生长明显受抑制，因此K-SFM培养基对毛囊干细胞也起了筛选作用。

作者这次实验中，K-SFM组细胞形态均一，且经流式细胞仪鉴定，其CD34，Ck15，β1整合素3个标记物表达均最高。而DMEM/F12+体积分数10%FBS组中，枭眼状的毛囊干细胞中混杂了大量的梭型细胞，并且CD34，Ck15，β1整合素3个标记物的表达最低。加入血清后，K-SFM组仅CD34表达较K-SFM+体积分数10%FBS组高，而β1整合素和CK15K-SFM 及K-SFM+体积分数10%FBS比较差异无显著性意义，原因可能为血清与K-SFM的共同作用下，毛囊干细胞迅速生长，从而间接导致其余细胞生长空间变小，生长也受到了相对的抑制。所以对于细胞纯度方面，K-SFM+体积分数10%FBS组较K-SFM组比较基本相同。

因此，培养毛囊干细胞中，K-SFM培养基明显强于传统使用的DMEM/F12+体积分数10%FBS，并且加入血清后，干细胞能更好的生长且基本不改变其生物学性状，从而给实验提供了一个很好的培养毛囊干细胞的培养基，以便今后应用于毛囊干细胞的培养，从而使毛囊干细胞在组织工程研究中能发挥更大的作用。

角质细胞无血清培养基促进大鼠毛囊干细胞的增殖

Keratinocyte serum-free medium promotes the growth of rat hair follicle stem cells

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[1]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta 分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(在线): 3-.
[2]	赵春涛, 卿明松, 余浪波, 彭笳宸. 运动学对线和机械力学对线指导全膝关节置换效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1435-1442.
[3]	陈强, 卓鸿武, 夏天, 叶哲伟. 不同质量浓度异烟肼对体外培养乳鼠成骨细胞的毒性作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1162-1167.
[4]	涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.
[5]	占龙, 孟农钦, 农桔安, 李小峰, 杨渊, 余雪. 原儿茶酸可减轻退变软骨细胞的损伤[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1149-1154.
[6]	张聪, 赵岩, 杜小宇, 杜欣瑞, 庞廷娟, 付怡凝, 张浩, 张步洲, 李筱贺, 王利东. 青少年特发性脊柱侧凸腰主弯患者腰椎-骨盆的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1155-1161.
[7]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[8]	方雯, 李泽, 柳昭明, 冯红. 中等强度训练干预大鼠骨骼肌抗增殖蛋白PHB1表达及线粒体呼吸功能的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1207-1212.
[9]	张远圆, 张杉杉, 常旭, 赵朋伟, 余孝先, 吴学东. 机械法与机械-酶消化法制备大鼠膈肌组织单细胞悬液的比较[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1213-1217.
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[11]	乔雪松, 陈霓, 杨风英, 牛燕媚. 运动调控间充质干细胞来源骨髓脂肪细胞的作用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1293-1298.
[12]	张圣敏, 刘超. 生物支架材料诱导脂肪来源干细胞成骨分化的最新热点[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1107-1116.
[13]	王田田, 王建忠. 骨髓间充质干细胞治疗早期股骨头坏死的应用与前景 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1117-1122.
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