经鼻给脐血间充质干细胞条件培养基治疗脑缺血再灌注损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.011

中国组织工程研究

• 脐带脐血干细胞 umbilical cord blood stem cells • 上一篇下一篇

经鼻给脐血间充质干细胞条件培养基治疗脑缺血再灌注损伤

沈丽萍¹，王帅帅¹，董丽果¹，沈霞¹，花放¹，叶新春²，崔桂云²

1徐州医学院，江苏省徐州市 221002；2徐州医学院附属医院神经内科，江苏省徐州市 221002

修回日期:2013-08-17 出版日期:2013-11-05 发布日期:2013-11-05
通讯作者: 崔桂云，博士，主任医师，副教授，硕士生导师，徐州医学院附属医院神经内科，江苏省徐州市 221002 cuiguiyun-js@163.com 并列通讯作者：叶新春，博士，主治医师，徐州医学院附属医院神经内科，江苏省徐州市 221002 xinchunye@foxmail.com
作者简介:沈丽萍★，女，1987年生，江苏省盐城市人，汉族，徐州医学院在读硕士，主要从事脑缺血再灌注方面研究。 shenliping1016@163.com
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81201025)*；江苏省卫生厅重大科研项目(Z201208)*

Intranasal administration of the conditioned medium of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells for treatment of cerebral ischemia-reperfusion injury

Shen Li-ping¹, Wang Shuai-shuai¹, Dong Li-guo¹, Shen Xia¹, Hua Fang¹, Ye Xin-chun², Cui Gui-yun²

1Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China; 2Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China

Revised:2013-08-17 Online:2013-11-05 Published:2013-11-05
Contact: Cui Gui-yun, M.D., Chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China cuiguiyun-js@163.com Corresponding author: Ye Xin-chun, M.D., Attending physician, Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China xinchunye@foxmail.com
About author:Shen Li-ping★, Studying for master’s degree, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China shenliping1016@163.com
Supported by:
the General Program of National Natural Science Foundation of China, No. 81201025*; the Major Science and Technology Research Program of Jiangxi Provincial Health Bureau, No. Z201208*

摘要/Abstract

摘要：

背景：人脐血间充质干细胞分泌细胞因子和神经营养因子对大鼠脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用，但经鼻给予人脐血间充质干细胞条件培养基治疗脑卒中的研究报道较少。
目的：观察经鼻给人脐血间充质干细胞条件培养基对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能恢复的影响。
方法：制备成年大鼠右侧大脑中动脉脑缺血再灌注模型，体外分离培养健康人脐血间充质干细胞，制备含有人脐血间充质干细胞分泌物质的条件培养基。造模后大鼠随机分为3组：对照组，单纯培养基对照组和条件培养基治疗组，各组每天经鼻给生理盐水、培养基DMEM/F12、条件培养基(10 mL/kg)治疗，术后1，7，14 d分别进行神经功能缺损评分、足错步试验。
结果与结论：术后第1天，各组神经功能缺损评分、足错步次数比较差异无显著性意义(P > 0.05)。术后第7，14天，对照组与单纯培养基组神经功能缺损评分、足错步次数比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。条件培养基治疗组神经功能缺损评分、足错步次数均明显少于对照组和单纯培养基组，差异有显著性意义(P < 0.05)。说明经鼻给人脐血间充质干细胞条件培养基可明显促进缺血再灌注后大鼠神经功能的恢复。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 人脐血间充质干细胞, 条件培养基, 经鼻给药, 脑梗死, 神经保护, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Cytokines and neurotrophic factors secreted from human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells secrete have neuroprotective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury, but there are few reports about intranasal administration of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell conditioned medium in the treatment of stroke.
OBJECTIVE: To investigate the protective effects of intranasal administration of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells-conditioned medium on neurologic function of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury.
METHODS: Adult rats were subjected to 2 hours of right middle cerebral artery occlusion and the human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were isolated from the postpartum human cord. We made the conditioned medium of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells. Ischemic rats were randomized and assigned to three groups and were treated by intranasal routine starting 24 hours after middle cerebral artery occlusion with: (1) saline for control group; (2) Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12 medium for medium control group; (3) conditioned medium treatment group (10mL/kg) daily for 14 days. Behavioral tests (foot fault test, and modified Neurological Severity Score) were performed before and at 1, 7, 14 days after middle cerebral artery occlusion.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no difference in the behavioral tests among the three groups at postoperatively 1 day (P > 0.05). Compared to the control and medium control group rats, respectively, rats in the conditioned medium group significantly improved functional outcome after stroke in days 7 and 14 (P < 0.05). There was also no significant difference in functional tests between the control group and medium control group in days 7 and 14 (P > 0.05). These results suggest that human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells-conditioned medium via intranasal administration can significantly improve neurologic functional outcome after cerebral ischemia-reperfusion injury.

Key words: stem cells, fetal blood, mesenchymal stem cells, culture media, conditioned, administration, intranasal, reperfusion injury, infarction, middle cerebral artery

中图分类号:

R394.2

沈丽萍，王帅帅，董丽果，沈霞，花放，叶新春，崔桂云. 经鼻给脐血间充质干细胞条件培养基治疗脑缺血再灌注损伤[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.011.

Shen Li-ping, Wang Shuai-shuai, Dong Li-guo, Shen Xia, Hua Fang, Ye Xin-chun, Cui Gui-yun. Intranasal administration of the conditioned medium of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells for treatment of cerebral ischemia-reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.011.

图/表（结果） 2

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引言

脑卒中是导致死亡和严重瘫痪的主要原因之一。尽管缺血性脑血管病研究取得很大的进展，但是到目前为止，只有重组组织型纤溶酶原激活剂作为有效的治疗急性缺血性脑血管病的药物被批准用于临床^[1]。急性期溶栓治疗由于受较短的治疗时间窗(发病4.5 h)的影响而在应用中受限^[2-3]。但是，受损脑组织的神经修复在脑缺血发生后数日甚至数周都一直活跃，这为脑缺血的保护性治疗提供了第二治疗时间窗。近20年来，干细胞治疗已作为一种新颖的治疗措施应用于脑卒中患者^[4]。干细胞改善脑缺血神经功能的可能机制有以下两点：①细胞替代机制：干细胞可以迁移至缺血区并分化为神经细胞和胶质细胞从而部分取代死亡的细胞^[5]。②营养支持机制(旁分泌)：干细胞释放神经营养因子支持缺血半暗带区残存细胞的存活、修复突触功能及促进血管新生^[6]；目前研究表明营养支持机制在干细胞移植治疗脑缺血损伤中可能扮演着更重要的角色。先前研究提示干细胞条件培养基同样具有促进血管新生^[7]，从而改善神经功能的作用。

从临床治疗角度来说，间充质干细胞条件培养基相比间充质干细胞有许多优势，如间充质干细胞移植可致肿瘤性，持续分泌的营养因子可促进肿瘤生长。间充质干细胞上清液可避免这些弱点，因为没有真正的细胞进入脑内，间充质干细胞上清液作用短暂^[8]。研究表明海马区星形胶质细胞上清可以促进人骨髓基质细胞和人皮肤干细胞在体外向神经元样细胞方向分化。海马区星形胶质细胞上清的这种功能可能与其中含有星形胶质细胞分泌的一些因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、脑源性神经营养因子以及一些来自星形胶质细胞的可溶性和膜性相关信号物质有关^[9]。

研究提示骨髓基质干细胞可以促进神经发生、血管新生和突触重塑等^[10-12]，从而促进神经功能恢复^[13]。脑梗死一般发生在老年群体，故抽取自体骨髓行骨髓基质干细胞分离培养，获得干细胞数量少、活性低，分离和迁移及促血管新生能力下降，分离培养时间较长，且患者家属难接受。因存在上述问题，故进行脐血间充质干细胞移植治疗的相关研究^[14]。前期研究提示人脐血间充质干细胞可促进脑卒中后神经功能的恢复。但人脐血间充质干细胞上清液是否对脑卒中后神经功能有促进作用，目前尚未见报道。

人脐血间充质干细胞可分泌细胞因子和营养因子，这些细胞因子和营养因子参与脑组织可塑性，如血管再生、神经再生、突触发生及减少缺血半暗带区的细胞凋亡^[15-17]。尽管这些神经营养因子可促进神经再生，但是这些多肽类(分子质量5-30 ku)很难通过血脑屏障到达中枢神经系统。从扩散性、侵袭性、花费和安全性考虑，脑室内和脑内注射无法应用于临床^[18]。经鼻给药是一种非侵略性、方便、无初步代谢、创伤及不良反应小，可快速到达中枢神经系统的给药方法。相对于静脉注射和脑内注射，经鼻给药的优势在于其无侵略性，可以为患者最大化提供方便、舒适^[19-20]。经鼻给药的独特优点在于其绕过血脑屏障，经嗅球和三叉神经到达脑内^[19,21]。

实验拟探讨人脐血间充质干细胞条件培养基能否促进脑缺血再灌注大鼠的神经功能恢复。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012-04-01/2013-03-31在徐州医学院神经生物实验室完成。

材料：

实验动物：SD雄性大鼠19只，清洁级，体质量220- 250 g，由徐州医学院实验动物中心提供。

人脐血间充质干细胞条件培养基改善脑缺血再灌注大鼠神经功能实验所用主要试剂及仪器：

实验方法：

人脐血间充质干细胞的分离、培养及条件培养基的制备：脐带来源于健康、足月妊娠产妇，由徐州医学院附属医院产科提供。产妇签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。在无菌条件下取人脐血30 mL(肝素抗凝)，小心转入15 mL离心管，3 500 r/min离心20 min。取出上层血浆，收集界面层白细胞。用DMEM/F12培养基+体积分数为10%脐血清5 mL+刺激因子(表皮生长因子和碱性成纤维生长因子)+抗生素(庆大霉素)，接种于 5 cm×5 cm的培养瓶。放37 ℃、CO₂培养箱72 h换液，弃去上清更换新鲜培养基。发现有细胞集落生长，贴壁细胞融合50%-80%后，用0.25%胰酶消化传代，根据细胞数情况确定传代瓶数，为第1代细胞；贴壁细胞融合80%以后，用0.25%胰酶消化传代，扩增传代1次，为第2代。在第3-5代细胞长至80%融合时，吸去培养上清，用PBS洗2次，换入无血清的基础培养基(无条件培养基)，放37 ℃、CO₂培养箱，24 h后分别收集培养上清。同时用液相色谱仪标化条件培养基。

大脑中动脉缺血再灌注模型制备：正常健康成年SD雄性大鼠，用10%水合氯醛以3.5 mL/kg麻醉。参照Chen等^{[17, 22-24]}的线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉脑缺血再灌注模型。模型制备过程及术后维持大鼠体温在37 ℃左右。

实验分组：清洁级实验动物随机分为对照组7只、单纯培养基组6只与条件培养基治疗组6只。对照组未给予任何干预措施；单纯培养基组造模24 h后每日仅经鼻给DMEM/F12培养基，1次/d，每次10 mL/kg，共14 d；条件培养基治疗组造模24 h后每日仅经鼻给人脐血间充质干细胞条件培养基，1次/d，每次10 mL/kg，共14 d。

神经功能缺损评分^{[17,22-23,25]}：参照Chen等的改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score, mNSS)方法，于术前和术后1，7，14 d进行神经功能评分，总分为18分，1-6分为轻度损害，7-12分为中度损害，13-18分为重度损害。

足错步试验：使用足错步试验评估大鼠前肢功能不全。术后1，7，14 d，大鼠置于悬空的网格状(2.5 cm× 2.5 cm)上，记录大鼠双侧前肢移动的总数和左侧前肢脚趾错步到网格之间的次数，用错步的总数占双侧前肢移动的总数的百分比统计结果。

统计学分析：使用SPSS 16.0统计软件和广义估计方程软件进行统计分析，数据以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用DunnettT3法，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

在实验性脑梗死模型中，使用骨髓基质细胞治疗能够明显提高缺血半暗带区的轴突密度，同时增加缺血半暗带区的轴突纤维的长度和使这些增长的轴突的纤维在冠状位上沿着缺血半暗带边缘平行排列^[26-29]。由治疗引起的缺血半暗带区的轴突密度的增加能够至少保持到脑梗死后1年^[30]。骨髓基质细胞能够明显降低轴突生长抑制性蛋白的表达如reticulon(Nogo)而使神经轴突明显生长^[31]。这些结果提示，骨髓基质细胞治疗既能诱导星形细胞分泌许多生长因子，又能抑制轴突再生的抑制性基因的表达，从而增加了轴突的再生。

成熟的少突神经胶质细胞在缺血半暗带区组成新生轴突的髓鞘^[32-35]。骨髓基质细胞的移植治疗可以明显增加缺血侧大脑的胼胝体、纹状体和室管膜下区少突神经胶质前体细胞的数量和增加紧邻有髓鞘的轴突缺血半暗带区的成熟少突神经胶质细胞的表达^[28]。促红细胞生成素和西地那非治疗后可以显著增加缺血半暗带区的有髓鞘的轴突的表达^[36]。

1995年神经干细胞在啮齿类动物第一个被发现且在成年脑组织中最近已明确定义。神经干细胞可分化为神经元和其他类型神经细胞。然而，神经干细胞仅仅可以在胎儿脑组织内收集，因而限制了它的治疗发展。诱导多能干细胞是通过转基因技术将某些转录因子导入动物的体内，使体细胞直接重构为胚胎干细胞。诱导多能干细胞克服胚胎干细胞的伦理问题、骨髓间充质干细胞有限地分化问题、神经干细胞资源缺乏问题。然而，诱导多能干细胞可以产生肿瘤，提示在临床应用之前，诱导多能干细胞需进一步研究^[20]。

干细胞治疗神经系统疾病的难点在于缺少安全，有效的给药方式。然而，在成功移植干细胞方面有困难，例如血脑屏障阻碍干细胞进入神经系统。目前，任何一种使干细胞进入脑内的方法都是有创的，如侧脑室注射、静脉注射、动脉注射、鞘内给药，虽可直接到达脑内，但创伤较大，难通过血脑通透性，治疗效果不佳。因此，发展一种新型的干细胞给药途径是必要的^[20]。

血脑屏障由脑部微血管系统的毛细血管内皮、内皮间紧密连接、基底膜、足细胞及胶质细胞突起所组成。血脑屏障虽然也可以通过载体或受体介导的转运通路选择性地促进某些分子向中枢神经系统转移，以完成某些特殊的生理功能，但是血脑屏障的紧密连接，却阻止了大多数外源性大分子物质从血液循环进入脑实质。血脑屏障的存在使很多药物经传统给药方式难以到达中枢，为神经精神疾病的治疗造成极大挑战^[37]。近期研究表明经鼻给药可作为一种非常有潜力地方法移植干细胞进入脑内。它可以提供一种不同的入径，克服血脑屏障，治疗神经系统疾病^[20]。自Frey等于1989年首次提出经鼻给药可使药物绕过血脑屏障直接到达中枢神经系统。随后的大量动物实验及临床研究证实，难以通过血脑屏障的一些药物，如神经生长因子、胰岛素等生物大分子，经鼻给予后可进入中枢神经系统，进而发挥治疗中枢神经系统疾病的作用。经鼻给药可以直接运输多肽类、化学药物、金属、病毒、质粒、siRNA、细菌噬菌体入脑^[20]。药物可经嗅神经通路直接进入中枢神经系统^[38]，然而，当前细胞治疗受限，没有充分补足神经元，患者仍存在潜在神经系统疾病症状。目前研究提示经鼻给干细胞可绕过血脑屏障进入脑内治疗缺血缺氧脑病，帕金森病，脑卒中^[20]。经鼻路径给药具有无创、快速、方便、无首过效应、可降低全身严重不良反应等优点。课题组已经应用该技术进行了相关基础研究并在Brain Research中报道了经鼻给药技术可以明显改善脑创伤后神经功能恢复。本研究表明经鼻给予人脐血间充质干细胞可以有效避开血脑屏障，促进脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能恢复^[39]。

研究发现间充质干细胞分泌生长因子和营养因子可促进突触形成，在预实验，发现脑卒中后缺血半暗带区突触蛋白表达量增加。间充质干细胞条件培养基比单独地血管内皮生长因子具有更强的血管再生作用，提示间充质干细胞条件培养基对血管再生具有重要作用。初步研究发现间充质干细胞条件培养基通过增加新生血管引导血管再生。人脐血间充质干细胞分泌因子可引导室管膜下区和脉络丛周围干细胞向损伤组织迁移、分化。缺血半暗带区最易受细胞凋亡影响，人脐血间充质干细胞分泌的生长因子如神经生长因子可减少细胞凋亡。作者推测在缺血半暗带区选择性减少细胞凋亡可以获得大脑重新分布。因此不能排除一系列细胞因子和生长因子刺激相应的脑细胞引起一系列反应促进神经功能恢复^{[17, 40]}。

人脐血间充质干细胞可分泌细胞因子和营养因子，如干细胞因子、白血病抑制因子、血小板生成素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、白细胞介素3、白细胞介素6、白细胞介素7、肿瘤坏死因子β1、肿瘤坏死因子β2、γ-干扰素、基质细胞衍生因子1、血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子、成纤维生长因子、肝细胞生长因子、神经生长因子。这些细胞因子和营养因子参与脑组织可塑性，如血管再生、神经再生、突触发生及减少缺血半暗带区的细胞凋亡^[15-17]。本研究表明人脐血间充质干细胞条件培养基可以改善脑卒中后神经功能恢复，可能与这些细胞分泌因子有关。

血管重构在成熟血管网建立和增加缺血半球脑血流量和促进功能恢复方面起关键作用^[41-43]。血管再生刺激神经再生，促进大鼠脑卒中后神经功能恢复。功能性微脉管系统重新建立可促进脑卒中后神经功能恢复^[44]。最初形成的血管丛通过发芽、分支、修剪、生长为内皮细胞，形成成熟的血管。血管生成素1属于内皮细胞生长因子家族成员，研究表明血管生成素1有促进内皮细胞增生、转移、成活和调节血管的再生作用^[45-46]。在血管成长和重构过程中，血管生成素1在促进血管平滑肌移位和增生方面起重要作用^[47]。通过基因转染办法使血管生成素1大量表达，提高血管的稳定性，阻止缺血半暗带区血浆渗出^[48-50]。在糖尿病视网膜病变中，Ang-Tie信号通路在调节周细胞缺损方面起一定作用^[51]。血管生成素1在增加病变处血管周围的周细胞，血管的塑形，成熟及稳定方面起重要作用^[52]，同时阻止梗死区的血液外渗^{[46, 48]}。血管生成素2是血管生成素1的拮抗剂。它能够抑制Ang1-Tie2信号传导通路从而降低新生血管的成熟和稳定性^[53]。Tie2和VEGFR2属于酪氨酸激酶，在血管再生方面起重要作用^[54-55]。

血管内皮生长因子是一种有效的渗透性指标，在正常成年大鼠低水平表达。血管内皮生长因子在调节梗塞区血管通透性方面起重要作用，血管内皮生长因子诱导血管生成素1的产生。血管内皮生长因子或炎症因子诱导血管生成素1的产生从而降低血管通透性，内源性血管生成素1可通过维持血管生成素1和血管内皮生长因子的平衡性来维持生理环境下的血管通透性的完整性。血管生成素1通过降低血小板内皮黏附因子1和血管内皮钙黏蛋白，增强内皮细胞紧密连接来抑制血管内皮渗透性^[48]。功能性微脉管系统重新建立可促进卒中后神经功能恢复。最初形成的血管丛通过发芽，分支，修剪，生长为内皮细胞，形成成熟的血管，补充支持细胞如周细胞和平滑肌细胞。通过血管内皮生长因子和其受体及Ang1/Tie2系统调节血管再生及成熟。在血管生长和分化方面，多肽生长因子激活内皮受体酪氨酸激酶(RTKs)占很大作用^[55]。增加血管再生可促进脑卒中后神经功能的恢复。血管稳定性和成熟性在功能性血管再生方面起重要作用。血管重塑是一个与血管内环境稳定性遭破坏后血管重构相关的复杂现象^[56]。微脉管和神经干细胞分泌营养因子刺激脑组织重塑，减少神经元退化，促进神经元可塑性，调节神经胶质反应，降低脑组织炎症反应。脑卒中后神经元和星形胶质细胞表达血管生长因子诱导微脉管生长。血管内皮生长因子和血管内皮生长因子受体2启动了血管再生的过程^[54]。推断条件培养基引起的神经功能恢复可能与促进缺血半暗带区血管新生有关系。

在脑卒中患者中发现，脑血流量和神经功能改善之间存在紧密联系。通过增加灌注，直接为梗死组织提供新陈代谢的需要。新形成的微脉管系统通过释放生长因子如脑源性神经营养因子，作用于脑实质细胞。在缺血半暗带区，新形成的微脉管通过释放基质细胞衍生因子1、血管内皮生长因子、金属蛋白酶2、金属蛋白酶9，创造一个迁移、神经元分化的微环境。

脑组织缺血区与一系列免疫细胞的诱导有一定的联系，如循环系统的中性粒细胞、单核细胞的渗透、小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞的激活。这些细胞表达，释放细胞因子如肿瘤坏死因子、白细胞介素1，6^[57]。

在发展和成熟脑中，细胞凋亡占重要作用，通过凋亡机制，大部分稳定产生的新生血管被淘汰。人脐血间充质细胞可减少细胞凋亡，提高新生血管存活，从而改善神经功能恢复^[58]。

人脐血间充质干细胞可提高室管膜下区神经干细胞增殖、突触产生、增加缺血半暗带区血管密度，减少凋亡细胞死亡，以至提高脑卒中后神经功能的恢复^[59-60]。目前研究提示人脐血间充质干细胞通过促进缺血半暗带区神经形成、突触形成及血管再生来保持局部血流量，促进神经功能的恢复。人脐血间充质干细胞增加缺血半暗带区突触小泡蛋白免疫原性，提示人脐血间充质干细胞促进突触形成^[58]。因此，突触产生也可能是人脐血间充质干细胞条件培养基促进脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能恢复的原因之一。

结论：经鼻给人脐血间充质干细胞条件培养基可促进大鼠脑卒中后神经功能恢复。人脐血间充质干细胞分泌的细胞因子及营养因子可能促进内因性的血管及神经再生、增强血管重构，从而促进神经功能恢复。外周给人脐血间充质干细胞分泌的细胞因子及营养因子可作为一种新颖的治疗方法应用于脑卒中患者。

经鼻给脐血间充质干细胞条件培养基治疗脑缺血再灌注损伤

Intranasal administration of the conditioned medium of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells for treatment of cerebral ischemia-reperfusion injury

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