骨髓间充质干细胞中软骨调节素Ⅰ的稳定上调表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.005

中国组织工程研究

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

骨髓间充质干细胞中软骨调节素Ⅰ的稳定上调表达

周连仲¹，崔成华²，冯亚³，邢双春³，翟立杰³

1天津市第四中心医院&天津市耳鼻咽喉头颈外科医院，天津市 300161；2北京大学肿瘤医院&北京市肿瘤防治研究所，北京市 100036；3大连医科大学附属第一医院，辽宁省大连市 116011

修回日期:2013-04-27 出版日期:2013-11-05 发布日期:2013-11-05
通讯作者: 翟立杰，教授，硕士生导师，大连医科大学附属第一医院，辽宁省大连市 116011 lijiezhai@yahoo.com.cn
作者简介:周连仲★，男，1985年生，辽宁省开原市人，满族，2011年大连医科大学毕业，硕士，医师，主要从事软骨组织工程研究。zhoulianzhong18@126.com
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81271720 2012)*；辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2012326 2012)*

Stably upregulating expression of chondromodulin-Ⅰ in bone marrow mesenchymal stem cells

Zhou Lian-zhong¹, Cui Cheng-hua², Feng Ya³, Xing Shuang-chun³, Zhai Li-jie³

1Otolaryngology Head and Neck Surgery Hospital of Tianjin, Tianjin 4th Centre Hospital, Tianjin 300161, China; 2Beijing Cancer Hospital & Beijing Institute for Cancer Research, Peking University, Beijing 100036, China; 3First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, Liaoning Province, China

Revised:2013-04-27 Online:2013-11-05 Published:2013-11-05
Contact: Zhai Li-jie, Professor, Master’s supervisor, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, Liaoning Province, China lijiezhai@yahoo.com.cn
About author:Zhou Lian-zhong★, Master, Physician, Otolaryngology Head and Neck Surgery Hospital of Tianjin, Tianjin 4th Centre Hospital, Tianjin 300161, China zhoulianzhong18@126.com
Supported by:
Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81271720 2012*; the General Program of Science Research of Liaoning Educational Bureau, No. L2012326 2012*

摘要/Abstract

摘要：

背景：软骨调节素Ⅰ是一种糖蛋白，主要在软骨中表达，而在骨髓间充质干细胞中少量表达。结合课题组的前期研究，推断软骨调节素Ⅰ在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中可能会起促进作用。
目的：构建软骨调节素Ⅰ表达载体，使其在大鼠骨髓间充质干细胞中稳定上调表达。
方法：在大鼠软骨组织中获取软骨调节素Ⅰ目的基因，使用pcDNA3.1(+)质粒表达载体构建pcDNA3.1(+)/ChM-I表达载体。密度梯度离心法和贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞。用脂质体法将构建的pcDNA3.1(+)/ChM-I表达载体转染大鼠骨髓间充质干细胞，使用G418稳定筛选转染细胞，用RT-PCR 及Western blot 检测软骨调节素Ⅰ在细胞株内的表达。
结果与结论：对阳性克隆的双酶切鉴定及测序和分析对比，结果显示与软骨调节素Ⅰ基因长度相符并且序列无误，且读码框正确。RT-PCR及western blot检测结果显示，软骨调节素Ⅰ的mRNA及蛋白在骨髓间充质干细胞中稳定的高表达。实验成功构建了pcDNA3.1(+)/ChM-I表达载体，并成功将其转染到大鼠骨髓间充质干细胞中，最终使软骨调节素Ⅰ在大鼠骨髓间充质干细胞中稳定上调表达。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 软骨调节素Ⅰ, 骨髓间充质干细胞, 软骨细胞, 载体, 生物因子, 组织工程, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Chondromodulin-Ⅰ is expressed mainly in the cartilage, but it is little expressed in mesenchymal stem cells. Combined with the previous study of our group, we concluded that chondromodulin-Ⅰ maybe play an important role in inducing mesenchymal stem cells into chondrocytes accurately.
OBJECTIVE: To construct an expression plasmid stably carrying chondromodulin-Ⅰ to up-regulate the expression of chondromodulin-Ⅰ in bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Specific primers were designed in rat cartilage for chondromodulin-Ⅰ gene, then the pcDNA3.1 (+) plasmid expression vector was digested by enzyme and directional connected gene to construct pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ expression vector. Bone marrow mesenchymal stem cells were obtained from rats using the method of density gradient centrifugation combined with adherent culture. Recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ was transfected into rat bone marrow mesenchymal stem cells with liposome method, and G418 selection was used for stable screen of transfected cells. Reverse transcription-PCR and western blot were used to detect chondromodulin-Ⅰ expression in cell lines.
RESULTS AND CONCLUSION: The positive clones were digested by enzyme and were identified and sequenced. The results showed that the reality length and sequence of chondromodulin-Ⅰ gene were consistent with the theoretical values, and reading frame was correct. Reverse transcription-PCR and western blot results showed that the expressions of chondromodulin-ⅠmRNA and protein were markedly up-regulated in bone marrow mesenchymal stem cells. Recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/ChM-I was successfully constructed, and transfected into rat bone marrow mesenchymal stem cells. After G418 selection, expression of chondromodulin-Ⅰ was up-regulated stably in rat bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, chondrocytes, glycoproteins

中图分类号:

R394.2

周连仲，崔成华，冯亚，邢双春，翟立杰. 骨髓间充质干细胞中软骨调节素Ⅰ的稳定上调表达[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.005.

Zhou Lian-zhong, Cui Cheng-hua, Feng Ya, Xing Shuang-chun, Zhai Li-jie. Stably upregulating expression of chondromodulin-Ⅰ in bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.005.

图/表（结果） 6

2.1 大鼠软骨调节素Ⅰ目的基因凝胶电泳结果将获得的软骨调节素ⅠPCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳分离得到的软骨调节素Ⅰ目的片段在1 100 bp处可看到较清晰的条带，与所设计引物应得到的产物长度相符。见图1。

挑取的两个阳性克隆，提取质粒，双酶切质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物，结果显示两个阳性克隆株的细菌提取的质粒均已连接了目的基因。
2.3 阳性克隆的测序鉴定重组质粒送至天津赛尔生物技术公司进行测序，测序结果显示序列无误，且读码框正确。见图3。

2.4 大鼠骨髓间充质干细胞形态观察结果单细胞悬液接种48 h后换液，倒置显微镜观察并拍照：可于培养皿底部见到呈梭形或三角形的贴壁细胞，数量很少；5 d后，贴壁细胞逐渐增多，每3 d更换培养基；7 d后细胞生长加快，大量增殖；培养11-13 d后培养皿底部细胞密度达到90%以上，用0.25%的胰酶消化，以1∶2传代。传代后的细胞贴壁较快，5-7d内细胞密度可达到90%。细胞形态逐渐单一，到P3可见细胞呈成纤维细胞样生长，折光性较强，可呈鱼群样生长。见图4A，B。

2.5 大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定结果流式细胞仪鉴定结果：骨髓间充质干细胞表面抗原CD90、CD29、CD45、CD11b/c的表达率分别为99.79%、98.41%、 2.77%、2.51%；骨髓间充质干细胞表面阳性抗原表达均在97%以上。见图5A-C。
2.6 成脂分化及成骨分化的细胞形态和染色结果经成脂诱导培养3 d即可见少数细胞在核周出现细小脂肪滴，折光性强。随着诱导时间的延长，胞质内脂滴增多，并彼此融合成大的脂滴。同时细胞逐渐增大变圆，胞核被脂肪滴挤于细胞一侧或被脂滴覆盖。脂肪分化细胞多成簇排列，散在偶见。培养2周后油红染色，脂滴为橙红色。经成骨诱导后，细胞形态逐渐变为不规则多角形。诱导2周后于倒置显微镜下可见细胞外小结晶，为成骨诱导后细胞分泌的钙盐结晶。培养3周后，行茜素红染色，倒置显微镜下呈现为红色斑片。见图6A，B。

2.7 转染后骨髓间充质干细胞的形态观察转染复合体作用6 h后，可见大量骨髓间充质干细胞胞质内出现折光性强的小泡，提示阳离子脂质体已结合质粒进入骨髓间充质干细胞。48 h后加入200 mg/L G418筛选培养基5 d后空白组出现少量细胞漂浮死亡，实验组和对照组也可见少量细胞死亡。7 d后空白组出现大量死亡，14 d后空白组细胞全部死亡，两个转染组大约有10%的细胞存活，转染组细胞不再死亡，开始增殖，生长速度逐渐加快。传代后，细胞生长旺盛，排列密集整齐，呈编织状旋涡状。见图7A，B。

RT-PCR结果：采用软骨调节素Ⅰ/GAPDH灰度比值作为评定指标，实验组、对照组和空白组软骨调节素Ⅰ/GAPDH灰度比值的平均值分别为1.081 7± 0.223 3，0.360 1± 0.126 0，0.368 7±0.008 6；实验组与对照组和空白组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，对照组和空白组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.9 蛋白鉴定结果 Western blot结果显示采用转骨调节素Ⅰ/ GAPDH灰度比值作为评定指标，实验组、对照组和空白组软骨调节素Ⅰ/GAPDH灰度比值的平均值分别为0.986 7± 0.020 4，0.415 5±0.020 6，0.375 1± 0.008 1；实验组与对照组和空白组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，对照组和空白组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。见图9。

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引言

在软骨损伤的修复过程中，其自体软骨来源受到极大的限制，而异体软骨具有抗原性，移植后排异反应较重，最终导致软骨修复的失败。组织工程软骨因其组织相容性与自体软骨相当，来源不受限制且可在体外精确塑形而成为移植材料的最理想选择^[1]，在软骨缺损的修复、医学整形、功能重建等领域具有广阔的应用前景，所以利用组织工程技术构建生物学特征与正常组织一致的组织工程软骨已成为医学与材料学重要的研究方向^[2]。种子细胞^[3-4]、生物因子和支架材料是构建组织工程软骨的3个要素^[5-9]。综合目前的研究成果来看，骨髓间充质干细胞已被确定为构建组织工程软骨最有前途的种子细胞之一^[3]，其特点是来源广泛、易获取，无免疫原性，具有强大的体外扩增能力和很好的多向分化潜能。某些特异性的生物因子，例如转化生长因子β、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子等，能够诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化，继而使细胞分化生长形成软骨样组织。目前软骨修复研究领域所使用的生物因子，均来自“黑箱法”，缺乏与软骨组织相关的特异性^[7^，^10-11]。因此，寻找更适合诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的特定软骨源性生物因子，并通过转染技术调控骨髓间充质干细胞中该特定基因的表达，将是组织工程软骨修复研究取得进展的关键所在。

作者所在课题组利用基因芯片技术确定大鼠骨髓间充质干细胞和透明软骨及弹性软骨细胞差异表达基因，并通过生物信息学检索和筛选确定软骨调节素Ⅰ(chondromodulin-I，ChM-I)可能为骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的关键调控基因之一；在蛋白水平验证了软骨调节素Ⅰ在透明软骨细胞和弹性软骨细胞中的表达明显高于骨髓间充质干细胞^[12-14]。研究发现，软骨调节素Ⅰ具有抑制血管形成^[15-17]，阻止血管内皮细胞侵入软骨的作用。软骨调节素Ⅰ还具有刺激软骨细胞生长的作用。

实验构建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ表达载体，稳定转染大鼠骨髓间充质干细胞，并验证其在骨髓间充质干细胞中的上调表达，建立软骨调节素Ⅰ稳定上调表达的骨髓间充质干细胞细胞株，为进一步开展软骨调节素Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化，构建组织工程软骨相关研究打下基础。

材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：于2010年6月至2011年6月在大连医科大学附属第一医院中心实验室，大连医科大学微生态实验室完成。

材料：6-8周SD大鼠，雌雄不限，清洁级，由大连医科大学实验动物中心提供。pcDNA3.1(+)质粒表达载体，天津赛尔生物技术有限公司提供。

软骨调节素Ⅰ在大鼠骨髓间充质干细胞中的稳定上调表达实验所需仪器与试剂：

实验方法：

pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ质粒的构建及鉴定：

大鼠软骨调节素Ⅰ目的基因的获取：取大鼠软骨组织，通过液氮研磨，Trizol法提取大鼠软骨组织总RNA，溶于60 μL的DEPC水中，-80 ℃保存。以大鼠软骨组织总RNA作为模板，Oligo dT作为引物，用反转录酶MMLV于42 ℃反转录40 min。设计大鼠软骨调节素Ⅰ基因特异性的引物，在两条引物上分别设计了限制性酶切位点(HINDⅢ和NOTI)以便定向克隆。

上游引物为：5’ GCA GAC AAG CTT ATG ACA GAG AAC TCG GAC A 3’，下游引物为：5’ GCA GAC GCG GCC GCT TAC ACC ATG CCC AAG ATG 3’。用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0试剂盒进行PCR。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的结果。

大鼠软骨调节素ⅠPCR产物与pcDNA3.1(+)质粒的连接及鉴定：使用碧云天PCR产物纯化试剂盒，步骤按照试剂盒说明书进行。酶切产物上样至1% 琼脂糖凝胶，电泳至适当位置后，回收线性化的载体片段；回收后的胶块采用DNA凝胶回收试剂盒(碧云天)，步骤按照试剂盒说明书进行。对回收后的PCR片段及pcDNA3.1(+)质粒定量后，进行DNA连接反应，取10 μL连接产物，转化XL1-Blue感受态菌，转化后菌铺至LB-Ampr+平板，37 ℃温箱孵育过夜。挑取平板上长出的单克隆至LB-Ampr+液体培养基，37 ℃，200 r/min，振荡培养15 h，提取细菌培养物中的质粒。步骤按照小量提取质粒的方法进行(质粒提取纯化试剂盒，碧云天)。进行双酶切，酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并送天津塞尔生物科技有限公司进行测序。

大鼠骨髓间充质干细胞的提取、培养及鉴定：采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞。经传代培养纯化细胞，取纯化后细胞进行鉴定，鉴定方法如下：流式细胞仪检测大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原，取3管P3代细胞(各1×10⁶)，其中一管分别加入FITC标记的CD45抗体和PE标记的CD90抗体，另一管加入FITC标记的CD29抗体和PE标记的CD11b/c抗体，第3管为阴性对照。室温，避光孵育15-20 min。均用PBS悬浮细胞， 1 500 r/min，离心5 min，去上清。再用PBS悬浮细胞，上机检测。

大鼠骨髓间充质干细胞的成脂及成骨诱导培养及检测：取生长状态良好的P3代细胞经胰酶消化后，接种到置有盖玻片的6孔培养板内行细胞爬片培养。成脂诱导检测：取成脂诱导2周后的玻片，PBS冲洗2次，体积分数10%甲醛溶液固定10 min，体积分数60%异丙醇溶液侵洗。油红O染色工作液，染色20-30 min，体积分数60%异丙醇溶液分色，三蒸水冲洗3次，自来水冲洗(蓝化)1-3 min，干燥。显微镜下观察、照相。成骨诱导检测：取成骨诱导3周后的玻片，PBS冲洗2次，体积分数95%乙醇固定10 min，三蒸水冲洗3次，0.1%茜素红染液染色30 min，三蒸水冲洗3次，干燥。显微镜下观察、照相。

质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞及稳定筛选、鉴定：

pcDNA3.1(+)/ChM-I质粒、pcDNA3.1(+)质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞及稳定筛选：引物采用脂质体法转染质粒。实验分3组：①实验组：包括适量大鼠骨髓间充质干细胞，8 μg pcDNA3.1(+)/ChM-I质粒，20 μL阳离子脂质体，3.5 mL双无低糖DMEM。②对照组：适量大鼠骨髓间充质干细胞，8 μg pcDNA3.1(+)质粒， 20 μL阳离子脂质体，3.5 mL双无低糖DMEM。③空白组：适量大鼠骨髓间充质干细胞，3.5 mL双无低糖DMEM。将混合好的转染复合体加入相应的培养皿中，轻摇培养皿使之混合均匀，置37 ℃、体积分数5%CO₂ 培养箱中培养。6 h后更换完全培养基，48 h后加入 200 mg/L G418进行筛选。每隔3 d更换1次筛选培养基。至空白对照组细胞全部死亡后，转染组仍用200 mg/L G418浓度的完全培养基培养，直至细胞密度达到80%左右后，按1∶3传代。之后将稳定筛选得到的细胞在 100 mg/L G418浓度的完全培养基中维持培养。取稳定筛选后细胞进行鉴定。

RT-PCR鉴定软骨调节素ⅠmRNA在稳筛后的大鼠骨髓间充质干细胞中的表达：用Trizol法分别提取实验组，对照组和空白组细胞的总RNA，以提取的细胞总RNA作为模板，Oligo dT作为引物，用反转录酶AMV于42 ℃反转录40 min。根据GenBANK中软骨调节素ⅠmRNA核酸序列，应用Primer5引物设计软件设计引物：

以RT产物为模板用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒进行PCR，具体步骤参见试剂盒说明书。PCR反应条件：95 ℃ 10 min，94 ℃ 1 min → 60 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min，循环35次后，于72 ℃延伸10 min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的结果。

Western blot观察软骨调节素Ⅰ蛋白在稳筛后的大鼠骨髓间充质干细胞中的表达：将接种6 cm培养皿中的细胞吸出培养基，PBS冲洗2次，加入1 mL上样Buffer，提取各组骨髓间充质干细胞中的蛋白，考马斯亮蓝法测定各组细胞蛋白浓度，-80 ℃冰箱保存蛋白样品备用。制备SDS-PAGE 凝胶，将蛋白样品变性并电泳，转膜，小心取出转移膜置于封闭液中，5%脱脂奶粉封闭4 ℃过夜。加入一抗(山羊抗大鼠软骨调节素Ⅰ多克隆抗体，TBST稀释，1∶400，小鼠抗大鼠GAPDH多克隆抗体，1∶500)，4 ℃孵育过夜。洗膜：将反应膜放入平皿中，用1×TBST 洗涤3次，室温下缓慢摇动洗涤，5 min/次，洗净未结合的一抗。再加入二抗(辣根酶标记抗山羊IgG，及抗小鼠IgG，TBST稀释，1∶1 000)；将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中，室温、避光缓慢摇动，作用1 h。洗膜：用1×TBST洗膜，洗去游离二抗。于暗室中加入Western blot Luminol Reagent发光，洗片。将底片用凝胶成像分析系统采集图像，定量分析各条带光密度值，计算各泳道样品与内参的比值。

主要观察指标：①大鼠软骨调节素Ⅰ目的基因凝胶电泳结果。②阳性克隆的酶切鉴定。③性克隆的测序鉴定。④大鼠骨髓间充质干细胞形态观察。⑤大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定结果。⑥成脂肪分化及成骨分化的细胞形态和染色结果。⑦转染后骨髓间充质干细胞的形态观察。⑧PCR 鉴定结果。⑨蛋白鉴定结果。

统计学分析：PT-PCR和Western blot每组实验重复6次，采用单因素方差分析。所有数据用SPSS 11.5软件进行分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

组织工程学方法构建软骨组织已成为软骨方面新的研究领域。在此过程中，种子细胞的生长调控是组织工程软骨研究中十分重要的一环。生长因子对细胞具有促进或抑制其分裂增殖，迁移和基因表达的作用。因此，筛选出具有针对性的调控目的细胞分化方向的因子是一项具有挑战性的工作。

目前所使用的生物因子均来自“黑箱法”，缺乏与软骨组织相关的特异性。为了得到与软骨组织相关特异性强的生物因子，本课题组已利用基因芯片技术确定软骨调节素Ⅰ是大鼠骨髓间充质干细胞和透明软骨及弹性软骨细胞差异表达基因，生物信息学的检索结果提示：软骨调节素Ⅰ可能在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中起关键作用；作者通过蛋白水平的实验验证了软骨调节素Ⅰ在软骨中表达，而在骨髓间充质干细胞中几乎不表达。

已有的国内外研究表明，软骨调节素是一族新的软骨内特异性蛋白，它的家族包括软骨调节素Ⅰ、软骨调节素Ⅱ、软骨调节素Ⅲ3种生物因子，其中以软骨调节素Ⅰ的软骨特异性最强。软骨调节素Ⅰ的生物学作用体现为：①刺激软骨细胞DNA和基质合成，能够促进软骨细胞和体内软骨的快速生长^[15^，^17]。②抑制血管发生，能够抑制软骨内血管的长入，进一步抑制软骨内骨化和骨的形成^[18-19]。人类的软骨调节素Ⅰ蛋白的氨基酸序列与啮齿类动物仅有细微的差别，主要发生在N端亲水区，而软骨调节素Ⅰ蛋白的主要功能区——C端疏水区，具有高度的同源性^[20]。因此，以大鼠为研究对象开展研究可为构建人组织工程软骨提供参考。

间充质干细胞是目前基础实验和临床研究中应用最多的干细胞^[21-22]。间充质干细胞是来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，例如成人的外周血、脂肪、皮肤、脐血、肌肉、骨骼、脑等都有其存在，以骨髓组织中的含量最多。骨髓间充质干细胞的培养体系和分离方法已成熟^[23-24]，目前常用的方法有：①贴壁筛选培养法。②密度梯度离心法。③流式细胞仪分选法。④免疫磁性分选法。

实验中发现，骨髓间充质干细胞在新鲜的大鼠骨髓组织中含量非常低，大约在0.001%，并随着年龄的增加而减少，但是其扩增能力很强，具有易贴附于塑料培养表面的特性。作者通过对比贴壁筛选培养法和密度梯度离心法发现：贴壁筛选培养法分离后得到的细胞群较多，比较复杂，但其原代细胞生长状态较密度梯度离心法好，可能是由于贴壁筛选培养法保留骨髓中较多的细胞种类，而每种细胞所分泌的因子具有互相促进作用，但贴壁筛选培养法所得到的细胞纯度较低，需多次传代后其纯度才可以提高，经过多次传代后其细胞容易老化；而密度梯度离心法分离后所得到的分离后得到的细胞群较均一，具有独特的表型及化学特征，在P3代就可以达到较高的纯度，细胞不易老化。

因此，在这次实验中，使用Percoll密度梯度离心法筛选骨髓间充质干细胞。在骨髓间充质干细胞培养的过程中，发现当细胞形态变大，变圆时，其生长速度明显下降，提示细胞出现老化现象，分析原因可能与细胞传代时消化时间过长，损伤细胞膜有关。在后续的培养过程中，优化细胞传代时的消化时间及胰酶的使用量，每次传代消化时间以2 min为宜，6 cm培养皿中加入约1 mL胰酶，老化现象逐渐消失。由于骨髓间充质干细胞具有多种标志，目前尚未筛选到其独特的标志分子，因此使用排除法和推逆法相结合对骨髓间充质干细胞进行鉴定^[25-27]。选择常用的代表性抗原CD90⁺和CD29⁺，CD45^-、CD11b/c^-进行了多指标联合流式细胞仪检测，检测结果显示在第3代细胞中其纯度已达到97%以上。实验通过诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨和脂肪细胞，证实分离的骨髓间充质干细胞具有诱导分化潜能，进一步证实了其为骨髓间充质干细胞，符合进一步研究的要求。

实验所使用的pcDNA3.1(+)质粒是由pcDNA3发展而来的一种质粒载体，大小约5.4 kb，其具有以下特点^[28-29]：①分子质量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。②含有抗新霉素基因，其可以启动neo基因表达3‘磷酸转移酶，这种酶能够分解新霉素和G418，从而使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。③具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。除了具有以上的特点外，其还含有人巨细胞病毒启动子，使其在哺乳动物细胞内可以高水平表达。鉴于以上的优点，这次实验采用pcDNA3.1(+)来构建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ质粒。在设计特异性软骨调节素Ⅰ引物时，分别在上下游引物上添加了特异性的酶切位点，以利于后续的连接与鉴定。双酶切法消化融合目的基因片段和pcDNA3.1(+)，使目的基因与载体定向连接。在DNA连接过程中，优化了反应条件，适量增加目的基因的比例，显著提高了连接效率。将连接好的质粒用双酶切进行鉴定，其目的条带与理论值相符。基因测序结果显示序列无误，且读码框正确，证明成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ。

脂质体为本身含有一种亲水性内核脂质。当作为基因转染载体使用时，比较简单而快速。因其具有以下特点：①保护质粒免受由DNA核酸酶的降解。②操作过程简单。③无免疫原性。④在分裂期和非分裂期的细胞都适用。⑤对外源基因的大小限制较小。试验中发现：脂质体和目的基因的混合比例、转染反应时间长短以及培养基中的血清浓度对脂质体法的转染效率影响很大，结合文献[30-31]和作者的预实验，脂质体和目的基因的最佳混合比例是：脂质体∶质粒(微升∶微克)=8∶4。质粒加入培养皿6 h后更换完全培养基，其转染效果最好。因为完全培养基中的血清可以阻断脂质体的转染过程，适当延长转染时间，有利于提高转染效率。在转染过程中还发现：在加入脂质体后，细胞会出现少量死亡，提示脂质体对细胞是有毒性作用的。实验通过预实验获得筛选培养基的G418的浓度为200 mg/L。

实验对稳转后使用200 mg/L的G418筛选培养基连续培养三代的细胞进行鉴定。结果提示：实验组中的软骨调节素Ⅰ在mRNA水平和蛋白质水平上均明显高于对照组和空白组，并且经过持续性的筛选，实验组所得到的细胞株仍然能够明显上调表达软骨调节素Ⅰ蛋白，充分证明所筛选得到的细胞株是稳定的。最终，实验成功构建了稳定上调表达软骨调节素Ⅰ蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞细胞株，为进一步研究软骨调节素Ⅰ在骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的作用打下基础。

骨髓间充质干细胞中软骨调节素Ⅰ的稳定上调表达

Stably upregulating expression of chondromodulin-Ⅰ in bone marrow mesenchymal stem cells

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