晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间充质干细胞的体外成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.004

中国组织工程研究

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间充质干细胞的体外成骨分化

芮云峰，林禹丞，陈辉，王宸

东南大学附属中大医院骨科，江苏省南京市 210009

修回日期:2013-09-21 出版日期:2013-11-05 发布日期:2013-11-05
通讯作者: 芮云峰，东南大学附属中大医院骨科，江苏省南京市 210009 ruiyunfeng@126.com
作者简介:芮云峰☆，男，1977年生，汉族，2011年香港中文大学毕业，博士，主治医师，副研究员，主要从事干细胞在骨科中的基础与应用的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金项目(81201422)*；江苏省自然科学基金青年基金项目(BK2012334)*；东南大学基本科研业务费“创新基金”项目(3290002401)*；国家大学生创新训练计划(1210286090)*；中国博士后科学基金项目和江苏省博士后科学基金特别资助项目(2012M520983)*

Osteogenic differentiation of human synovium-derived mesenchymal stem cells from osteoarthritic knee joints

Rui Yun-feng, Lin Yu-cheng, Chen Hui, Wang Chen

Department of Orthopedics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China

Revised:2013-09-21 Online:2013-11-05 Published:2013-11-05
Contact: Rui Yun-feng, Department of Orthopedics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
About author:Rui Yun-feng☆, M.D., Attending physician, Associate researcher, Department of Orthopedics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China ruiyunfeng@126.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China for the Youth, No. 81201422*; the Natural Science Foundation of Jiangsu Province for the Youth, No. BK2012334*; the Innovation Fund of Southeast University Fundamental Research Project, No. 3290002401*; the National Undergraduate Training Programs for Innovation and Entrepreneurship, No. 1210286090*; China Postdoctoral Science Foundation & Jiangsu Provincial Postdoctoral Science Foundation, No. 2012M520983*

摘要/Abstract

摘要：

背景：间充质干细胞是组织工程中常用的种子细胞，而来源于人膝关节滑膜组织的间充质干细胞能否作为骨组织修复与再生中合适的种子细胞还需要进一步验证。
目的：观察晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织来源的间充质干细胞体外向成骨细胞定向分化的潜能，对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定。
方法：无菌条件下从行全膝关节置换的晚期骨关节炎患者膝关节腔内获取滑膜组织，Ⅰ型胶原酶消化分离获得有核细胞。以最适密度接种(200个有核细胞/cm2)，挑选单细胞克隆，筛选出滑膜间充质干细胞。基础培养基培养，传至第3代时改换为含地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸的成骨诱导培养基诱导培养。
结果与结论：体外分离培养的滑膜间充质干细胞早期可形成葵花样细胞集落，克隆样生长。传代至第3代，细胞呈成纤维细胞样生长，形态均一。滑膜间充质干细胞成骨诱导后呈典型的“铺路石样”成骨细胞形态，诱导至第7天碱性磷酸酶染色呈强阳性，碱性磷酸酶活性表达也在诱导7 d时达最高峰；诱导21 d茜素红染色可见大量钙结节形成；同时反转录PCR检测到Ⅰ型胶原、Runx2、骨结合蛋白和骨桥蛋白的表达在诱导后增加，21 d时表达最高。从晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织分离获得的滑膜间充质干细胞，在体外可成功诱导分化为成骨细胞，所诱导生成的细胞具有典型的成骨细胞特性。提示滑膜间充质干细胞有望成为骨组织工程理想的种子细胞来源，在骨组织的再生修复中发挥重要作用。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 滑膜组织, 间充质干细胞, 滑膜干细胞, 膝关节, 骨关节炎, 成骨诱导分化, 成骨细胞, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells are commonly used in tissue engineering, while whether synovium-derived mesenchymal stem cells from human knee joints can make a role in repair and regeneration of bone tissue as the appropriate seed cells need to be further verified.
OBJECTIVE: To study the osteogenic differentiation potential of synovium-derived mesenchymal stem cells which were harvested from human knee joint with end-stage osteoarthritis in vitro. Meanwhile, to identify the osteogenic characteristics of these induced synovium-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Cell populations were enzymatically released from the synovial membrane obtained from total knee arthroplasty. Nucleated cells were plated at an appropriate density (200 cells/cm2) for expansion at the maximum rate without colony-to-colony contact. Monoclone was obtained by selecting as primary synovium-derived mesenchymal stem cells. After primary cultured in control medium and expanded to three passages, synovium- derived mesenchymal stem cells were subjected to in vitro assays to investigate their osteogenesis potential in osteogenic medium containing dexamethasone, β-glycerophosphate and ascorbic acid.
RESULTS AND CONCLUSION: Nucleated cells from the synovial membrane formed single cell-derived colonies, which were of polygon shape and star shape, uniform in size. After three passages, homogeneous populations of fibroblast-like cells were observed. Under appropriate culture conditions, synovium-derived mesenchymal stem cells were induced to differentiate to the osteocyte lineages which had typical “slabstone” appearance of osteoblasts. Osteogenesis was stained positively for alkaline phosphatase staining at day 7 and formed mineralized nodular structures at day 21, which was confirmed by Alizarin red staining. Alkaline phosphatase activity assay showed a rise after the osteogenesis induction and reached the peak at day 7. Expressions of osteocyte specific genes, such as collagen type Ⅰ, Runx2, bone-binding protein and osteopontin, were all detected. These genes were expressed positively in osteogenic medium, and the mRNA expressions of collagen type Ⅰ, Runx2, bone-binding protein and osteopontin were enhanced significantly after 21 days. Our study demonstrates that synovium-derived mesenchymal stem cells isolated from knee joint of end-stage osteoarthritis patients could be induced into osteoblasts in vitro, and these induced cells have typical osteogenesis characteristics. Synovium-derived mesenchymal stem cells may play a role in the regenerative response during the process of bone injury, which are promising candidates for bone tissue engineering.

Key words: mesenchymal stem cells, synovial membrane, induced pluripotent stem cells, cell differentiation

中图分类号:

R394.2

芮云峰，林禹丞，陈辉，王宸. 晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间充质干细胞的体外成骨分化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.004.

Rui Yun-feng, Lin Yu-cheng, Chen Hui, Wang Chen. Osteogenic differentiation of human synovium-derived mesenchymal stem cells from osteoarthritic knee joints[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.004.

图/表（结果） 4

2.1 滑膜间充质干细胞的形态及成骨诱导分化后形态的变化原代滑膜间充质干细胞单个细胞克隆呈葵花样细胞集落生长，细胞形态不规则，以多角形细胞为主，细胞核聚集于中心，胞浆形成的突起向外呈辐射状，表现为成体间充质干细胞的特征，见图1A。
原代培养4-7 d生长增殖迅速，培养7-10 d可形成多个细胞克隆群，见图1B。
单克隆来源的滑膜间充质干细胞传代培养至第3代后，细胞逐渐呈现为形态均一的长梭形的成纤维细胞形态，见图1C。
成骨培养基诱导的滑膜间充质干细胞形态学发生改变，由长梭形向立方形转变，呈铺路石样改变，见图1D。

2.2 滑膜间充质干细胞成骨诱导后细胞表达碱性磷酸酶滑膜间充质干细胞成骨诱导7 d后，细胞碱性磷酸酶染色呈阳性，未经诱导的细胞不表达碱性磷酸酶，见图2。
碱性磷酸酶活性定量检测结果显示，诱导4 d时成骨诱导组细胞中碱性磷酸酶活性明显增加，7 d达峰值，而后逐渐降低，且诱导后第4，7，10，14天成骨诱导组细胞中碱性磷酸酶活性均明显高于对照组(P < 0.05)；而对照组细胞中碱性磷酸酶活性变化不明显(P > 0.05)，见图3。

2.3 滑膜间充质干细胞成骨诱导后出现钙结节滑膜间充质干细胞成骨诱导至21 d，行茜素红染色呈阳性，对照组细胞未出现钙结节，表明成骨诱导组细胞外基质中有钙的沉积和钙结节形成；且成骨诱导组细胞中钙结节形成量显著高于对照组(P < 0.05)，见图4。

2.4 滑膜间充质干细胞成骨诱导过程成骨特异性基因的表达反转录PCR结果显示，成骨诱导组细胞表达成骨细胞标志性基因Ⅰ型胶原、Runx2、骨结合蛋白及骨桥蛋白，其中Runx2的表达在成骨诱导后呈现逐步上升的趋势，第21天时表达最明显，Ⅰ型胶原、骨结合蛋白以及骨桥蛋白同样也是在成骨诱导至21 d时表达最明显，见图5。

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引言

创伤或骨肿瘤切除导致的大段骨缺损、各种原因导致的骨延迟愈合或不愈合、骨质疏松症的骨愈合不良等情况下，患者骨组织的自我修复能力有限^[1]，而骨组织工程与再生医学为骨损伤的再生与修复带来了新的希望^[2]。选择成骨分化潜能强、来源广泛、获取方便的种子细胞是成功构建组织工程的基础。

间充质干细胞是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，被认为是骨骼肌肉系统组织工程理想的种子细胞^[3-4]。间充质干细胞存在于骨髓、骨膜、脂肪、脐带脐血、滑膜、髌下脂肪垫和关节软骨等各种人体间充质组织中^[5]，具有相似的生物学表型，但是在细胞的增殖和分化潜能等方面则功能各异^[6]。其中骨髓间充质干细胞作为最早发现的一类间充质干细胞，已在骨组织工程中有着广泛的应用^[7-8]。有研究显示，从人膝关节滑膜组织中分离获得的滑膜间充质干细胞具有比骨髓间充质干细胞更好的体外增殖能力和克隆形成能力，以及更高的成软骨分化的潜能^[9]，且获取较简便^[10]，是关节软骨修复合适的种子细胞^[11]。Futami等^[12]的研究表明，小鼠滑膜间充质干细胞不仅具有成软骨分化及成脂分化的特性，而且具有优于骨髓间充质干细胞的成骨分化的潜能。并且，作为细胞来源的滑膜组织具有高度的自我再生的能力，可反复取材，较少出现相关的并发症，少量的组织即可分离出大量的干细胞，1 mg滑膜组织中可提取大约2.1×10⁴个原代滑膜间充质干细胞^[9]，可以弥补骨髓间充质干细胞体外培养细胞数不足，增殖能力低，临床上取材困难等不足。这提示滑膜间充质干细胞有望成为骨组织工程合适的种子细胞。但目前，对于骨关节炎患者来源的滑膜间充质干细胞成骨分化潜能的研究较少。

作者前期研究从骨关节炎患者膝关节滑膜组织中成功分离培养出具有多项分化潜能的滑膜间充质干细胞^[13]，文章在此基础上，通过对人骨关节炎来源的滑膜间充质干细胞体外成骨诱导分化，并对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定，旨在探索滑膜间充质干细胞作为骨组织工程种子细胞的可行性，并为滑膜间充质干细胞在骨组织缺损治疗中的潜在应用价值提供理论依据。

材料方法

设计：细胞体外观察实验。

时间及地点：于2011年9月至2012年8月在东南大学医学院外科实验室完成。

材料：

人膝关节滑膜间充质干细胞体外培养及分化的主要试剂及仪器：

组织：由晚期骨关节炎患者(11例，其中男4例，女7例，平均年龄65岁，符合膝关节晚期骨关节炎诊断)行全膝关节置换中切除获得的膝关节滑膜组织，组织的获取得到患者知情同意。

方法：

人骨关节炎来源的滑膜间充质干细胞的分离与培养：无菌条件下取出骨关节炎患者膝关节滑膜组织，PBS冲洗3遍，小心剪除滑膜周围的脂肪和部分结缔组织，分离出平滑光亮的滑膜组织。用小组织剪将滑膜片剪成 1 mm³大小的碎块，加入5倍体积浓度为0.4% Ⅰ型胶原酶，在37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中消化2.0-3.0 h，经120目钢网过滤，1 000 r/min离心10 min，弃去上清液。重复3次，除去含胶原酶的上清液，重悬细胞并计数。

以1×10⁴个有核细胞平铺于60 cm²培养皿中，在 37 ℃、体积分数5% CO₂条件下在基础培养基(高糖DMEM培养基、体积分数10%胎牛血清、1.0×10⁸ U/L青霉素和1.0×10⁸ U/L链霉素)中培养，24 h后换液，除去未贴壁细胞，单层培养7-14 d。

连续镜下观察细胞克隆形成并计数，观察细胞克隆的生长和形态学特征，挑选合适的细胞克隆继续扩增培养，以此作为原代滑膜间充质干细胞。细胞生长至亚融合状态(80%)时，0.25%胰酶消化，1∶4传代接种于培养皿，每3 d更换培养基。

滑膜间充质干细胞的成骨诱导分化：滑膜间充质干细胞培养至第2代细胞，胰酶消化传代，接种于6孔板，基础培养基培养，用于体外成骨诱导分化实验。将细胞分为成骨诱导组和对照组。成骨诱导组直至贴壁细胞生长融合后开始更换成骨诱导培养基：HG-DMEM/体积分数10%的胎牛血清、1 nmol/L地塞米松、20 mmnol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C；对照组则继续使用基础培养基培养。每3 d更换培养基。

碱性磷酸酶染色观察成骨分化细胞形态：滑膜间充质干细胞成骨诱导液培养7 d后，此时细胞已经90%融合，吸去培养液，PBS冲洗1次；4 ℃预冷的体积分数70%乙醇固定30 s，PBS冲洗3次，于空气中晾干；底物溶于二甲基甲酰胺中，加入缓冲液中；将固紫B加入缓冲液中，配成染色混合液；每孔(六孔板)中加入混合液 1 mL，37 ℃孵育1 h，然后用蒸馏水冲洗，显微镜观察。

对硝基苯棕榈酸酯法定量检测分化细胞中碱性磷酸酶的活性：参照Rui等^[14]方法检测分化细胞中碱性磷酸酶的活性。取第2代滑膜间充质干细胞，以1.0×10⁵个/孔接种于12孔板，加入普通培养液进行培养，待细胞达100%融合时，将其中6孔更换为成骨诱导培养液进行成骨诱导，剩余6孔培养条件不变，作为对照。于诱导1，4，7，10和14 d时，分别中止培养，按碱性磷酸酶检测试剂盒说明进行操作。

于405 nm处用紫外分光光度计读取吸光度值，并计算碱性磷酸酶活性。

茜素红染色检测分化细胞中钙结节的形成：成骨分化诱导液培养21 d后，吸去培养液，PBS冲洗2遍；体积分数70%乙醇室温固定10 min；去离子水轻柔冲洗2遍；加入1 mL/孔的40 mmol/L的茜素红染色液，室温孵育30 min；吸取未结合的燃料，用去离子水漂洗并轻微振荡5 min，重复3次；吸取多余的去离子水，倒置显微镜观察并拍照。

倒置显微镜观察拍照后，细胞用蒸馏水冲洗1遍，每孔加入1 mL氯化十六烷基吡啶100 g/L，pH 7.0)，室温放置15 min，将溶液移入96孔板，150 μL/孔，紫外分光光度计于562 nm检测吸光值。

反转录PCR检测成骨细胞特异性基因Ⅰ型胶原、Runx2、骨结合蛋白和骨桥蛋白的表达：成骨诱导分化培养0，7，21和28 d行反转录PCR检测成骨细胞特异性基因Ⅰ型胶原、Runx2、骨结合蛋白和骨桥蛋白的表达。未诱导的滑膜间充质干细胞为阴性对照，GAPDH为内参照。

总RNA的提取采用 RNeasy试剂盒，反转录PCR的步骤严格按照PCR试剂盒进行操作，以GAPDH标准化处理得到各基因的相对表达量。所用基因扩增，实验重复3次。

反转录PCR检测使用的引物序列、片段长度、退火温度和循环数：

主要观察指标：膝关节滑膜间充质干细胞体外成骨分化后形态和特征蛋白的表达变化。

统计学分析：数据以x(_)±s表示。两组间比较采用两独立样本t检验。所有的数据分析采用SPSS 16.0(美国SPSS公司)。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着人们平均寿命的延长，一些退行性疾病如骨关节炎的发病率也逐年升高。骨关节炎是一种慢性的退行性过程，主要表现为软骨的退化，软骨及软骨下骨的磨损，关节间隙的消失，最终带来疼痛以及关节功能的丧失^[15]。目前对骨关节炎的治疗主要是缓解症状，减轻疼痛，例如非类固醇类药物的运用以及透明质酸钠等润滑剂的关节腔注射等^[16-18]。而这些治疗手段，往往疗效甚微，并不能阻止骨关节炎的进展^[19]。全膝关节表面置换手术是治疗终末期骨关节炎的有效手段，在术中切除的滑膜组织，提供了大量的组织工程中所需的干细胞。由于滑膜是一个少血管的组织，因此滑膜间充质干细胞具有较低的免疫原性，滑膜间充质干细胞原代培养中红细胞掺杂的比例也不会因为组织采取量的增大而大幅增加。

实验中的干细胞取材于骨关节炎患者全膝关节置换中切除的滑膜组织，参照作者既往研究的方法^[13]，以适宜的密度接种，挑选单细胞克隆，成功培养出了滑膜间充质干细胞。观察到了增殖速度较快的长梭形的成纤维样细胞，与Vandenabeele等^[20]认为的滑膜间充质干细胞具有成纤维样细胞形态特征的观点一致。

Owen等^[21]将成骨过程分为3个阶段，即成骨细胞增殖、细胞外基质分泌期，细胞外基质成熟期和细胞外基质矿化期。实验所用的含有地塞米松、维生素C及β-甘油磷酸钠的成骨诱导培养基，已用于骨髓间充质干细胞的成骨诱导培养^[22]。在地塞米松对骨髓间充质干细胞的增殖以及成骨分化全程调控下维生素C参与早期Ⅰ型胶原的合成，β-甘油磷酸钠被细胞分泌的碱性磷酸酶水解而释放出无机磷从而参与细胞外基质矿化，与成骨的过程相对应。在细胞诱导成骨分化的过程中有一些特殊的标志物，其中Ⅰ型胶原为早期的骨形成标记物，碱性磷酸酶是细胞外基质成熟的早期标志，细胞外基质中碱性磷酸酶的分泌增加会促使细胞外基质矿化，表现为大量钙盐沉积。骨结合蛋白是成骨过程中的特异性基因，Termine等^[23]认为骨结合蛋白可与Ⅰ型胶原结合形成非可溶性复合物，使钙化延伸，从而促进骨的形成。骨桥蛋白是细胞外基质矿化期的标志因子，与细胞外基质中羟基磷灰石沉积有关^[24]。Runx2同样也被认为成骨过程中重要的标志物，Runx2作为一种成骨分化的特异性转录因子，还可以促进各种骨细胞细胞外基质蛋白的合成^[25]。

在实验中细胞经成骨诱导培养基诱导培养后行细胞染色，可观察到在细胞诱导后第7天，碱性磷酸酶染色呈强阳性，碱性磷酸酶定量显示细胞在成骨诱导后，碱性磷酸酶表达呈上升趋势，在第7天达到高峰，随后在诱导至21 d时，细胞茜素红染色显示有大量的染成红色的钙质沉积。这些实验结果提示，滑膜间充质干细胞体外经成骨诱导后成功的向骨细胞分化，且从侧面说明细胞在诱导至7 d时，处于细胞外基质成熟期，至21 d时，细胞可能处于细胞外基质矿化期。通过成骨特异性基因的检测，实验中也可以看到成骨诱导早期即有Ⅰ型胶原的高表达，随着诱导的持续，至诱导后21 d，Runx2、骨结合蛋白和骨桥蛋白的表达均达到高峰，这符合作者此前关于细胞诱导至21 d时已处于细胞外基质矿化期的假设。因此，在加入成骨诱导培养基干预21 d之后，滑膜间充质干细胞实现了成骨诱导分化。

近年来，运用间充质干细胞治疗骨关节炎的研究越来越多，也看到了较为积极的成果^[26-27]。在一项多中心，随机对照，双盲的实验中证实了在骨关节炎患者的关节腔内注射体外预培养的同种异体骨髓间充质干细胞的有效性和安全性^[28]。

而自从2001年De Bari等^[29]首次分离培养出滑膜间充质干细胞以来，多项研究均证实，滑膜间充质干细胞的增殖能力以及向骨、软骨分化的潜能要高于骨髓间充质干细胞^[9^，^30]，并且滑膜间充质干细胞的获取较方便，可以在关节镜下获取。这次实验以及Labusca等^[31]分别从晚期骨关节炎患者滑膜组织中成功分离提取出了干细胞，并分别证实了干细胞的成骨、成软骨分化潜能，为进一步以自体的滑膜间充质干细胞治疗骨关节炎打下理论基础。

鉴于滑膜间充质干细胞体外获取的简单性，安全性，低免疫原性，以及其在体外培养时显示出较好的成骨分化的能力，滑膜间充质干细胞可能是骨组织工程中合适的种子细胞。虽然滑膜间充质干细胞的研究成果令人鼓舞，但是仍存在着一些需要解决的问题。目前还缺乏滑膜间充质干细胞的特异性标志物，使得学者们只能通过解剖学的定位来区分不同功能的干细胞，那么定向分化的结果是不是单一的干细胞作用的结果，还需要进一步的验证。滑膜间充质干细胞成骨分化的分子生物学机制尚未阐明，成骨分化的过程中滑膜间充质干细胞会受到哪些因素的调控等问题，还有待进一步深入研究。

晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间充质干细胞的体外成骨分化

Osteogenic differentiation of human synovium-derived mesenchymal stem cells from osteoarthritic knee joints

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[2]	尹健东, 王鑫灵, 左彪, 李秾杙. 全膝关节置换过程中挤压驱血和抬腿驱血与置换后并发症的关系[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1331-1336.
[3]	周祺, 高益, 魏康, 黎俊, 徐建达, 蒋阳, 瞿玉兴. 全膝关节置换治疗类风湿关节炎：关节功能及相关生化指标的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1337-1341.
[4]	赵春涛, 卿明松, 余浪波, 彭笳宸. 运动学对线和机械力学对线指导全膝关节置换效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1435-1442.
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[6]	黄勇, 朱伟民, 陆伟, 欧阳侃, 彭亮权, 柳海峰, 李皓, 冯文哲, 许鉴, 钟名金, 陈康, 李瑛, 邓桢翰. 膝关节置换后注射含类固醇鸡尾酒治疗安全性的荟萃分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1449-1456.
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[8]	涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.
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[10]	张聪, 赵岩, 杜小宇, 杜欣瑞, 庞廷娟, 付怡凝, 张浩, 张步洲, 李筱贺, 王利东. 青少年特发性脊柱侧凸腰主弯患者腰椎-骨盆的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1155-1161.
[11]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
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