牙髓干细胞
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图1｜Sema3A基因修饰牙髓干细胞(DPSCs)的构建
结果：使用慢病毒载体将Sema3A基因转导至DPSCs中构建Sema3A基因修饰DPSCs(Sema3A-DPSCs)，并使用嘌呤霉素进一步筛选转导成功的细胞。在荧光显微镜下观察到慢病毒处理的Sema3A-DPSCs及Vector-DPSCs均表达绿色荧光，而未经慢病毒处理的DPSCs无绿色荧光，见图1A。相比于DPSCs及Vector-DPSCs，Sema3A-DPSCs中Sema3A的mRNA及蛋白水平均显著上调，见图1B，C。ELISA检测细胞上清液中分泌型Sema3A水平，结果显示，Sema3A-DPSCs组分泌型Sema3A水平明显高于其他2组，见图1D。以上结果证明，构建的Sema3A基因修饰DPSCs可成功高表达并分泌Sema3A因子。
图2｜过表达Sema3A对牙髓干细胞(DPSCs)成骨分化的影响
结果：为研究过表达Sema3A对DPSCs自身成骨分化的影响，将Vector-DPSCs及Sema3A-DPSCs进行成骨诱导，并比较两者间的成骨分化水平。碱性磷酸酶染色结果显示，在成骨诱导第7，14天，Sema3A-DPSCs的碱性磷酸酶染色水平高于Vector-DPSCs，见图2A。碱性磷酸酶活性结果显示，在诱导第7，10，14天，Sema3A-DPSCs的碱性磷酸酶活性明显高于Vector-DPSCs，见图2B。对成骨诱导28 d的2种细胞进行茜素红染色，结果显示，Sema3A-DPSCs染色强度及钙含量高于Vector-DPSCs，见图2C，D。此外，在成骨诱导第7，14，21天提取2种细胞的mRNA，检测成骨分化相关基因mRNA表达，结果显示，在第7天时，Sema3A-DPSCs的碱性磷酸酶及骨钙素表达水平显著高于Vector-DPSCs；在第14天时，Sema3A-DPSCs的碱性磷酸酶、骨钙素、Runt相关转录因子2及SP7转录因子表达水平显著高于Vector-DPSCs；在第21天时，Sema3A-DPSCs的碱性磷酸酶、骨钙素及Runt相关转录因子2表达水平显著高于Vector-DPSCs，见图2E。以上结果表明，过表达Sema3A可促进DPSCs成骨分化。
图4｜在牙髓干细胞(DPSCs)中过表达Sema3A对MC3T3-E1/DPSCs共培养体系成骨潜能的影响
结果：为研究Sema3A-DPSCs对MC3T3-E1成骨分化的影响，将MC3T3-E1分别与Vector-DPSCs及Sema3A-DPSCs以1∶1及1∶3的比例直接共培养，并进行成骨诱导。在诱导第21天，使用针对小鼠成骨基因的引物检测共培养体系中MC3T3-E1成骨基因转录情况。结果显示，当MC3T3-E1与Vector-DPSCs或Sema3A-DPSCs的比例为1∶1时，MC3T3-E1中碱性磷酸酶、骨钙素、Runt相关转录因子2及SP7转录因子的mRNA水平显著增高；当MC3T3-E1与Vector-DPSCs或Sema3A-DPSCs的比例为1∶3时，MC3T3-E1中Runt相关转录因子2及SP7转录因子的mRNA水平显著增高，见图4A。该结果表明，Sema3A-DPSCs可促进共培养体系中MC3T3-E1成骨分化。
为评价在DPSCs中过表达Sema3A对DPSCs/MC3T3-E1共培养体系细胞成骨分化的影响，检测了成骨诱导后共培养体系中总的碱性磷酸酶活力及矿化结节形成情况。结果显示，当两种细胞以1∶1及1∶3比例共培养时，Sema3A-DPSCs/MC3T3-E1共培养体系的碱性磷酸酶染色更深，碱性磷酸酶活力水平更高，见图4B，C。而且，与Vector-DPSCs/MC3T3-E1共培养体系相比，Sema3A-DPSCs/MC3T3-E1共培养体系茜素红染色更深，矿化结节更多，见图4D，E。