髓核细胞移植抑制椎间盘退变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.53.023

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来，椎间盘细胞移植和椎间盘移植修复椎间盘退变研究取得较大的进展。

目的：探讨髓核细胞的体外培养方法以及髓核细胞移植在抑制椎间盘退变研究中的作用。

方法：通过数据库检索的方式探讨髓核细胞移植抑制椎间盘退变的研究。髓核细胞的主要功能是产生胶原和蛋白聚糖，改进髓核细胞的培养方法，使培养后的髓核细胞数量增多，合成和分泌细胞外基质增加，通过髓核细胞移植来修复退变的椎间盘。

结果与结论：通过三维小球聚集培养、微载体旋转立体培养等方法可以使髓核细胞数量增多，肝细胞生长因子对髓核细胞增殖产生促进作用。髓核细胞移植可以恢复退变椎间盘高度，促进退变椎间盘内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成和分泌。随着对椎间盘退变研究的不断深入，髓核细胞移植对退变椎间盘可能是一种重要的治疗手段。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

关键词: 器官移植, 器官移植学术探讨, 细胞移植, 髓核细胞, 椎间盘, 椎间盘退变, 细胞培养, 纤维环, 细胞外基质, 胶原, 蛋白聚糖

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, cell transplantation and intervertebral disk grafting for intervertebral disk degeneration have been greatly developed.

OBJECTIVE: To investigate the in vitro culture methods of nucleus pulposus cells and effects of nucleus pulposus cell transplantation on intervertebral disk degeneration.

METHODS: A computer-based search of databases was performed to explore the effects of nucleus pulposus cell transplantation on intervertebral disk degeneration. The main function of the nucleus pulposus cells is to produce collagen and proteoglycans. Through improvement of culture methods, the number of nucleus pulposus cells increased, and matrix synthesis and secretion also increased. Therefore, the nucleus pulposus cell transplantation was able to repair the degenerated intervertebral disk.

RESULTS AND CONCLUSION: The three-dimensional aggregation culture method and three-dimensional microcarrier rotation method elicit the increase in the number of nucleus pulposus cells, and hepatocyte growth factor also can produce a catalytic role in the proliferation of nucleus pulposus cells. Nucleus pulposus cell transplantation can restore degenerative disc height, and promote the biosynthesis and secretion of proteoglycans and type Ⅱ collagen in the degenerated intervertebral disk. With the deepening of intervertebral disk research, nucleus pulposus cell transplantation may become an important therapeutic tool for intervertebral disk degeneration.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

Key words: cell transplantation, intervertebral disk, intervertebral disk degeneration, extracellular matrix, collagen type Ⅱ, proteoglycans

中图分类号:

R318

王春生，张维斌. 髓核细胞移植抑制椎间盘退变[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(53): 9239-9244.

Wang Chun-sheng, Zhang Wei-bin. Nucleus pulposus cell transplantation inhibits intervertebral disk degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(53): 9239-9244.

图/表（结果） 8

2.1 对髓核细胞分泌细胞外基质有促进作用的体外培养方法 从椎间盘退变移植细胞的选择方面来看，主要有自体软骨细胞、自体髓核细胞和自体骨髓基质干细胞，但只有髓核细胞是可行的，但髓核细胞由于某种原因获得的数量有限以及培养困难等，阻碍了研究的进程。近年来，关于改进髓核细胞培养方法的研究可以使细胞数量得到扩增。

2.1.1 多次胶原酶消化法培养髓核细胞张兴凯等^[13]使用多次胶原酶消化的方法体外分离培养椎间盘髓核细胞，接种，传代，取第2代细胞，分别采用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应方法检测椎间盘髓核细胞特征性分泌物Ⅱ型胶原和聚合蛋白的分泌量及mRNA的表达，并与软骨细胞、成骨细胞及成纤维细胞进行比较，结果见表1。

2.1.2 三维小球聚集培养髓核细胞程洪涛^[14]寻找合适的在体外培养髓核细胞的方法，获得质量和数量更良好的髓核细胞。采用胰酶+胶原酶联合消化法分离兔髓核细胞，分离所获细胞一部分用DMEM/F12混合培养基进行单层培养，其余的采用低速离心，使其形成小球形聚集，并在聚丙烯离心管中进行培养。三维小球聚集培养法是将髓核细胞悬液的细胞浓度调成 5×10⁸ L^-¹，取1 mL细胞悬液加入15 mL聚丙烯离心管中，补充培养液至5 mL，用低温离心机以20×g离心力4 ℃离心5 min，使细胞聚集成团，放入CO₂恒温细胞培养箱中，体积分数为5%的CO₂在37 ℃恒温孵育，每2 d换液1次。两种方法在培养相同时间后，分别检测能够反映髓核细胞合成硫酸化蛋白聚糖能力的³⁵S摄取率来比较两种培养体系里髓核细胞的合成代谢能力。在不同时间两种方法培养的髓核细胞³⁵S摄取率，见表2。

2.1.3 微载体旋转立体培养髓核细胞宁斌等^[15]分析成人退变髓核细胞的体外微载体旋转立体培养模式及其对细胞外基质合成的影响。选取因椎间盘疾患行椎体间融合的患者，对34个退变的髓核组织进行体外培养，将其随机分为单层培养组和微载体旋转立体培养组。微载体旋转立体培养取2.04 g微载体颗粒，环氧乙烷灭菌后，5%的硅油预湿，将其放入旋转培养瓶，加入HAM F-12/DMEM+体积分数为10% FBS培养液100 mL，将旋转培养瓶置于慢速磁力离心机上，10 r/min，培养箱中预培养24 h。比较对数生长期髓核细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化结果和不同生长期细胞的蛋白多糖含量，见表3。

2.1.4 肝细胞生长因子对髓核细胞的作用满孝旭等^[16]研究肝细胞生长因子对体外培养人退变髓核细胞生物学活性的影响，应用免疫组织化学染色观察肝细胞生长因子受体在髓核细胞中的表达，并测不同浓度肝细胞生长因子的细胞生长曲线，筛选最佳的作用浓度。选取第3代髓核细胞，反转录聚合酶链反应检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 mRNA表达。四唑盐比色法结果提示不同浓度肝细胞生长因子对体外培养的人退变髓核细胞均有明显的促增殖作用，与对照组相比差异均有显著性意义，肝细胞生长因子刺激后髓核细胞进入增殖期比例增加，同时促进髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 mRNA表达量增加，可以促进细胞外基质表达。不同浓度肝细胞生长因子培养人退变髓核细胞的吸光度值结果，见表4。

2.2 髓核细胞移植抑制椎间盘退变的实验研究

2.2.1 髓核细胞移植对受损椎间盘退变的影响磁共振是目前公认的椎间盘退变动物模型的无损伤性影像学检查方法^[17]。赵献峰等^[18]比较髓核细胞移植和骨髓基质细胞移植对椎间盘退变的影响，采用原代细胞培养法获取并扩增髓核细胞及骨髓基质细胞，2岁龄新西兰白兔随机分为3组，盐水注射组3只，骨髓基质细胞移植组6只，髓核细胞移植组6只，在椎间盘进行髓核穿刺抽吸后分组注入盐水、骨髓基质细胞和髓核细胞，未处理的椎间盘作为对照组采集数据。通过测量椎间盘高度指数和磁共振影像结果来分析细胞移植对椎间盘损伤退变的影响。在移植后不同时间点各组椎间盘高度指数的动态变化，见表5。

在不同时间点各组磁共振ST2WI数据显示，第8周时髓核细胞移植组T2信号强度(70.63±7.60)%高于骨髓基质细胞移植组(54.32±7.92)%，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。提示髓核细胞移植组细胞外基质的合成可能超过骨髓基质细胞移植组。可见，髓核细胞移植或骨髓基质细胞移植能够有效避免椎间盘损伤后发生的进行性退变过程。而且，在8周后髓核细胞移植组较骨髓基质细胞移植组显示出更强的基质合成能力。椎间盘高度及含水量出现恢复的迹象。外源性髓核细胞移植能够良好的适应受体椎间盘环境，并发挥相应的细胞外基质分泌功能。

2.2.2 髓核细胞移植促进退变椎间盘内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成刘勇^[19]在微创经皮CT引导下穿刺椎间盘建立兔椎间盘退变模型，将60只新西兰大白兔分别用甲苯噻嗪注射液3 mg/kg、克他命注射液40 mg/kg肌肉注射麻醉后，兔取左侧卧位，腰背部正中及左侧穿刺区域备皮，以2.5%的碘伏消毒，选择椎间盘层面行CT扫描以穿刺造模，行腰椎间盘CT扫描，以定位穿刺椎间隙。兔左后方腰背部为进针点，消毒后在CT定位下，经皮以18G的穿刺针由左后方穿刺腰间盘。穿刺针尖接近纤维环时行CT扫描，调整穿刺角度及深度，缓缓进针，刺入髓核后再次CT扫描，以确定针尖位于髓核中央。

对兔椎间盘细胞进行培养，在体外转双基因，将腺相关病毒介导的结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶组织抑制因子1双基因体外联合转染兔椎间盘髓核细胞后，再将转基因髓核细胞移植于退变兔腰椎间盘内，通过免疫组织化学和反转录聚合酶链反应以及³⁵S整合法检测髓核细胞移植对椎间盘退变的影响，观察不同时期椎间盘信号、椎间高度、Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成的变化。发现在体外转双基因腺相关病毒介导的结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶组织抑制因子1髓核细胞移植可以延缓或逆转椎间盘的退变。研究中的几项检测结果发现，见表6。

Ⅱ型胶原免疫组化染色，在髓核区随机选取10个高倍视野行阳性细胞计数，计算阳性率，结果见表7。

2.2.3 转化生长因子β3基因修饰退变髓核细胞植入对退变椎间盘的影响宋希元等^[20]将重组腺病毒载体Ad-转化生长因子β3与第2代退变髓核细胞按10︰1比例混合培养转染为A组，待细胞融合后传代，四唑盐比色法检测转染细胞增殖活性，Western blot检测转化生长因子β3蛋白含量，免疫细胞化学染色观察对数生长期转染细胞Ⅱ型胶原染色阳性率；采用病毒空载体转染髓核细胞B组和未经转染髓核细胞C组作为对照。通过针刺椎间盘制备退变模型。A组和B组将100 μL浓度为1×10⁸L^-¹对应细胞悬液注射入退变椎间盘，C组同法注入等量PBS。在不同时间取椎间盘行组织学观察，结果见表8。

参考文献

[1] Karppinen J, Shen FH, Luk KD, et al. Management of degenerative disk disease and chronic low back pain. Orthop Clin North Am.2011;42(4):513-528.

[2] Samartzis D, Cheung KM. Lumbar intervertebral disk degeneration. Orthop Clin North Am. 2011;42(4):xi-xii.

[3] Adams MA, Roughley PJ.What is intervertebral disc degeneration, and what causes it? Spine (Phila Pa 1976). 2006;31(18):2151-2161.

[4] Chung SA, Khan SN, Diwan AD. The molecular basis of intervertebral disk degeneration.Orthop Clin North Am. 2003;34(2):209-219.

[5] Brisby H. Pathology and possible mechanisms of nervous system response to disc degeneration. J Bone Joint Surg Am. 2006;88 Suppl 2:68-71.

[6] Bae WC, Masuda K. Emerging technologies for molecular therapy for intervertebral disk degeneration. Orthop Clin North Am. 2011;42(4):585-601.

[7] 彭宝淦,施杞.退变椎间盘的组织病理学变化[J].中国中医骨伤科杂志,1996,4(6):52-55.

[8] 胡有谷.腰椎间盘突出症[M].第二版.北京:人民卫生出版社,1995: 118-136.

[9] Inoue N, Espinoza Orías AA. Biomechanics of intervertebral disk degeneration. Orthop Clin North Am. 2011;42(4): 487-499.

[10] Gan JC, Ducheyne P, Vresilovic EJ, et al. Intervertebral disc tissue engineering II: cultures of nucleus pulposus cells. Clin Orthop Relat Res. 2003;(411):315-324.

[11] 万方数据库.万方医学网[DB/OL].2013-09-21. https://med.wanfangdata.com.cn

[12] Medline.Pubmed[DB/OL].2013-09-21.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

[13] 张兴凯,曹鹏,王君,等.多次胶原酶消化法培养小鼠椎间盘髓核细胞[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(28):5136-5140.

[14] 程洪涛.兔髓核细胞的体外培养及髓核细胞移植抑制椎间盘退变的实验研究[D].江苏:东南大学,2004:1.

[15] 宁斌,刘海飞,龚维明,等.成人退变髓核细胞微载体旋转立体培养对细胞外基质合成的影响[J].中华外科杂志,2013,51(5): 432-436.

[16] 满孝旭,马迅,关晓明,等.肝细胞生长因子对体外培养的人退变髓核细胞生物学活性影响[J].中华临床医学杂志(电子版),2011, 5(24):7226-7231.

[17] Gruber HE, Johnson T, Norton HJ, et al. The sand rat model for disc degeneration. Radiologic characterization of age-ralated changes:cross-sectional and prospective analyses. Spine.2002;27(3):230-234.

[18] 赵献峰,刘浩,丰干均,等.髓核细胞与骨髓基质细胞移植对受损椎间盘退变的影响[J].四川大学学报(医学版),2009,40(3): 472-477.

[19] 刘勇.转基因CTGF和TIMP1髓核细胞移植阻逆兔腰椎间盘退变的实验研究[D].山东:山东大学,2011:4-40.

[20] 宋希元,彭圣智.TGF-β3修饰退变髓核细胞移植修复兔退变椎间盘的效果观察[J].中国修复重建外科杂志,2012,26(7): 790-795.

[21] 王月秋,陈伯华.骨髓间充质干细胞治疗椎间盘退变的研究进展[J].齐鲁医学杂志,2009,24(4):369-370,372.

[22] Iwashina T, Mochida J, Sakai D, et al. Feasibility of using a human nucleus pulposus cell line as a cell source in cell transplantation therapy for intervertebral disc degeneration. Spine (Phila Pa 1976). 2006;31(11):1177-1186.

[23] Matsuzaki H, Wakabayashi K, Ishihara K, et al. Allografting intervertebral discs in dogs: a possible clinical application. Spine (Phila Pa 1976). 1996;21(2):178-183.

[24] Okuma M, Mochida J, Nishimura K, et al. Reinsertion of stimulated nucleus pulposus cells retards intervertebral disc degeneration:an in vitro and in vivo experimental study. J Orthop Res.2000;18(6):988-997.

[25] Nomura T, Mochida J, Okuma M, et al. Nucleus pulposus allograft retards intervertebral disc degeneration.Clin Orthop Relat Res. 2001;(389):94-101.

[26] Watanabe K, Mochida J, Nomura T, et al. Effect of reinsertion of activated nucleus pulposus on disc degeneration: an experimental study on various types of collagen in degenerative discs.Connect Tissue Res. 2003;44(2):104-108.

[27] Ganey T, Libera J, Moos V, et al.Disc chondrocyte transplantation in a canine model: a treatment for degenerated or damaged intervertebral disc.Spine (Phila Pa 1976). 2003;28(23):2609-2620.

[28] 于占革,杨威,温莹,等.兔不同节段椎间盘髓核细胞培养特性的比较[J].中国脊柱脊髓杂志,2010,20(8):689-693.

[29] 马凯歌,邵增务,王佰川,等.自噬参与压力诱导兔髓核细胞退变的研究[J].中华实验外科杂志,2013,30(2):354-357.

[30] 陶海鹰,贺斌,卫爱林,等.羧甲基壳聚糖对体外培养大鼠椎间盘髓核细胞增殖、细胞周期及细胞外基质分泌的影响[J].中国实验外科杂志,2013,30(10):2165-2168.

引言

材料方法

讨论

椎间盘由软骨板、纤维环和髓核组成，上下有软骨板，是透明软骨覆盖于椎体上，下面骺环中间的骨面，上下的软骨板与纤维环一起将髓核密封起来。纤维环由胶原纤维束的纤维软骨构成，位于髓核的四周。椎间盘具有液体泵的作用，可以通过促进体液渗透，从而给椎间盘提供营养和代谢废物，还可以在生物力学方面起重要作用，髓核纤维环可以分担椎体的压力负荷。

髓核是一种弹性胶状物质，被纤维环和软骨板所包绕。髓核中含有黏多糖蛋白复合体、硫酸软骨素和大量水分。髓核细胞属于已分化细胞，适应在椎间盘内高压、乏营养、偏酸的特殊环境。正常成年人椎间盘细胞含量虽然很少，仅占椎间盘组织容积的1%，但对平衡椎间盘基质合成的表达和代谢更新起着重要作用。

椎间盘退变的移植细胞主要有软骨细胞、髓核细胞和骨髓基质干细胞等。骨髓基质干细胞是具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞，在适当的诱导条件下可以促使细胞的分化，骨髓基质干细胞获取比较容易，自体来源的细胞无抗原性，易于外源性基因的导入和表达，是椎间盘细胞移植的重要细胞来源之一^[21]，但目前还缺乏在椎间盘退变研究方面更深入的了解。只有髓核细胞是可行的，文章中介绍的改进髓核细胞培养的方法可以使细胞数量得到扩增。另外，永生化髓核细胞系的研究和建立加快了髓核细胞移植的进展^[22]。

髓核细胞作为种子细胞移植治疗椎间盘退变是研究的热点问题，近年来，有很多深入的研究成果。Matsuzaki^[23]取杂交成年犬椎间盘连带其上下软骨终板放入在4 ℃体积分数为10%的二甲基亚砜浸泡1 h，然后分别在-80 ℃和-196 ℃冷冻保存达1-24周时，分别复苏并进行移植试验，发现椎间盘移植有助于维持椎间盘高度。Okuma等^[24]用自体髓核细胞移植到兔椎间盘退变的模型，免疫组织化学方法检测发现Ⅱ型胶原的表达多于未移植髓核细胞组，Ⅱ型胶原含量明显增多。Nomura等^[25]先将兔椎间盘退变模型中髓核吸出，然后再将同种异体髓核细胞植入其中，在移植后16周检测发现髓核细胞移植组比未移植组Ⅱ型胶原含量有所增加。Watanabe等^[26]在体外将髓核细胞和纤维环细胞共同培养后植入动物模型的退变椎间盘中，发现髓核细胞和纤维环细胞共同移植可以延缓或逆转椎间盘的退变。Ganey等^[27]通过穿刺法获得犬髓核和纤维环细胞，在体外培养12周后移植到髓核内，在移植后发现椎间高度得到维持，移植的细胞可以存活的较好，而且还有分化和分泌能力，产生正常的细胞外基质。有研究发现腰椎髓核细胞比颈段和胸段椎体髓核细胞生长状态好，而且更适宜作为细胞培养的种子细胞^[28]。马凯歌等^[29]研究自噬参与压力诱导兔髓核细胞退变。在1 MPa压力条件下培养髓核细胞12，24，48 h。发现在压力导致细胞衰老及死亡，自噬参与压力诱导细胞退变的过程，为压力诱导椎间盘髓核细胞退变的机制和防治提供新的内容和途径。陶海鹰等^[30]观察羧甲基壳聚糖对体外培养大鼠椎间盘髓核细胞细胞周期进程、细胞周期蛋白表达以及分泌细胞外基质的影响。使用酶消化法提取大鼠椎间盘髓核细胞并进行体外培养，Ⅱ型胶原免疫组织化学鉴定髓核细胞。发现羧甲基壳聚糖对体外培养髓核细胞增殖相关蛋白增殖细胞核抗原表达具有促进作用，促进细胞周期进程以及细胞周期蛋白表达，对髓核细胞分泌细胞外基质具有促进作用。

随着国内外专家对椎间盘退变研究的不断深入，未来髓核细胞移植对退变椎间盘可能是一种重要的治疗手段。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
全文链接：