2.1   外泌体的生物特性   外泌体是一类由细胞分泌到细胞外的膜性囊泡，在多种生理和病理过程中发挥重要作用。外泌体的直径通常在30-150 nm之间，是最小的细胞外囊泡类型之一[1-6]。它们由脂质双分子层包裹，这种结构不仅为外泌体提供了稳定的物理屏障，还能够在复杂的生物环境中保持内容物的完整性。外泌体广泛存在于多种生物体液和组织中，包括血液、尿液、唾液、乳汁、羊水、滑液和脑脊液等[7-9]。 外泌体的内容物丰富多样，包含来自原始细胞的复杂成分，如细胞因子、蛋白质、RNA、miRNA和脂质等生物活性分子，这些成分赋予外泌体强大的生物学功能，能够参与细胞间的信息传递和调节[1-6]。例如，外泌体可以通过转运蛋白质和核酸等物质，调节受体细胞的基因表达和蛋白质合成，从而影响细胞的生理功能和状态[1-6]。此外，外泌体还能够重塑细胞外环境，通过释放生物活性物质，促进细胞间的通讯和协调[5]。 外泌体在多种生理和病理过程中发挥关键作用。例如，在免疫应答过程中，外泌体能够携带抗原和免疫调节分子，激活或抑制免疫细胞的功能，调节免疫反应的强度和方向[17-18]。在组织修复和再生过程中，外泌体通过促进细胞增殖、分化和血管新生，加速受损组织的愈合[19-21]。在癌症发生和发展中，肿瘤细胞分泌的外泌体能够携带致癌因子和促转移分子，促进肿瘤的生长、侵袭和转移[22-23]。因此，外泌体不仅在基础研究中具有重要的科学价值，而且在临床应用及生物医学领域中展现出广阔的前景，特别是在疾病诊断、治疗和药物递送等领域。关于外泌体发展的研究见表1。 "

2.2   外泌体的生物学功能   外泌体在生物学和医学领域中扮演着重要的角色，其功能和作用机制有以下几个方面：①细胞代谢的调节：外泌体可以作为信号信使和载体，将信号传递给相应的靶细胞，从而改变生理功能和状态。外泌体含有脂质、蛋白质、DNA和RNA等多种生物活性分子，这些分子可以调节细胞代谢[5-6]。②炎症的控制：外泌体与各种炎症性疾病的发生发展密切相关[24-27]。在炎症状态下，外泌体释放增多，可以促使外泌体与受体细胞结合，进而使外泌体内含物的结构及生物性能发生改变，从而对受体细胞产生影响[28]。③促进血管新生：外泌体可以促进血管生成，例如在肿瘤组织内乏氧状态下释放的外泌体，刺激周围血管形成，促进肿瘤的生长及转移[29]，间充质干细胞来源外泌体通过细胞因子促进血管生成，如miR-21可以通过PTEN/Akt途径促进血管生成[30-31]。④促进组织修复：外泌体可以通过携带多种生长因子和细胞因子，调节细胞外基质的合成和重塑，促进血管生成和神经再生，此外，外泌体能够携带多种生物活性分子，如蛋白质、脂质、核酸等，通过调节细胞信号传导、细胞增殖、迁移和分化等过程，促进软组织的修复和再生[20-21]。⑤免疫调节：外泌体通过携带多种生物活性分子，调节免疫细胞的激活与抑制、炎症反应的强度、免疫耐受的诱导以及免疫记忆的形成，从而在免疫调节中发挥重要作用[32-33]，如NK细胞分泌的外泌体中还含有多种免疫成分，可通过旁分泌途径或通过循环系统靶向免疫系统来发挥免疫调节作用[34]。⑥癌症发生与发展：肿瘤细胞的外泌体与正常细胞的外泌体之间存在差异，研究发现肿瘤细胞会释放携带致癌因子与细胞凋亡因子的外泌体，使受体细胞癌变，而且携带特定的生物活性分子可改变受体细胞的基因表达和功能，从而促进肿瘤的生长和转移[35-36]。⑦抗原呈递：外泌体可以作为抗原呈递细胞的载体，将抗原信息传递给免疫细胞，从而激活免疫反应，树突状细胞是专业的抗原呈递细胞，其分泌的外泌体含有MHC分子和抗原肽复合物，能够有效地呈递抗原并激活T细胞，外泌体因能够携带抗原并激活免疫系统特性，被研究用于疫苗设计中，以增强免疫反应[37-39]。 此外，干细胞来源外泌体作为一种“无细胞治疗”策略，近年来在多种疾病的治疗中展现出显著的疗效，例如具有免疫调节、抗炎、抗纤维化、抑制氧化应激、增强血管生成等疗效[40]。研究发现，间充质干细胞来源外泌体能够通过携带免疫调节分子，调节T细胞和B细胞的功能，抑制过度的免疫反应，从而在自身免疫性疾病中发挥治疗作用[41]；间充质干细胞来源外泌体通过诱导结肠巨噬细胞向免疫抑制的M2表型极化，减少炎症细胞因子和趋化因子的产生，增加抗炎细胞因子的浓度，从而有效缓解结肠炎症[42]；在肝纤维化的治疗中，人骨髓间充质干细胞衍生外泌体通过 Wnt/β-catenin 通路缓解肝纤维化，从而减缓肝纤维化的进展[43]；脂肪来源干细胞外泌体通过携带抗氧化分子，调节细胞内的氧化应激反应，从而保护心肌细胞免受氧化损伤[44]；在缺血性疾病的治疗中，干细胞外泌体携带的血管生成因子，如血管内皮生长因子，能够促进血管内皮细胞的增殖和迁移，加速新生血管的形成，改善组织的血液供应[45]。这些研究表明，干细胞来源外泌体通过调节免疫反应、减轻炎症、抑制纤维化、清除氧化应激和促进血管生成等多种机制，在多种疾病的治疗中具有广泛的应用潜力，为临床治疗提供了新的思路和方法。 2.3   外泌体的生物发生过程   外泌体的形成过程可以分为几个关键步骤：①内吞作用：外泌体的形成始于细胞膜的内吞作用，细胞膜内陷形成早期内吞体，这些早期内吞体可以与其他细胞器融合，进一步成熟为晚期内吞体[5-6，46]。②多囊泡体(multivesicular bodies，MVBs)的形成：晚期内吞体内膜通过内向出芽作用形成多个腔内囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，这些囊泡就是外泌体的前体，最终形成多囊泡体[5-6，46]。③外泌体的释放：大多数多囊泡体会与溶酶体融合，导致内容物的降解，而少数多囊泡体则通过与细胞膜融合，将腔内囊泡释放到细胞外，形成外泌体[5-6，46]。外泌体的具体生发过程示意图见图3。此过程涉及特定的膜蛋白如CD63和溶酶体跨膜蛋白(如LAMP1、LAMP2)，这些蛋白在多囊泡体的膜表面发挥重要作用[5]。  "

多囊泡体和腔内囊泡的形成主要依赖内吞体分选复合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)机制和非依赖内吞体分选复合物两种机制[5-6，46-48]。ESCRT复合物在调控多囊泡体的形成中发挥关键作用，包含ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II、ESCRT-III和相关的ATP酶VPS4复合物。ESCRT复合物通过在内吞体膜上时序性招募组装，介导泛素化的膜受体蛋白分选至腔内囊泡中，进而送至溶酶体被降解[46，48]。具体来说，ESCRT-0识别和分隔泛素化标记的内吞体膜跨膜蛋白；ESCRT-I与ESCRT-II协同作用，使内吞体膜通过内向生芽作用包裹特异的内容物；ESCRT-III将形成的囊泡剪开。ESCRT的解离和再循环需要ATP酶VPS4的辅助作用。除了ESCRT依赖的途径，多囊泡体也可以不依赖ESCRT途径而由特定脂质分子介导形成。参与调控多囊泡体形成的脂类主要包括神经酰胺、磷脂酸、鞘氨醇-1-磷酸等，这些脂类可能通过促进内吞体膜上富含鞘磷脂的“脂筏”微结构域的形成和进一步扩张，或诱发自发的负性曲度促进腔内囊泡的形成。细胞内生成多囊泡体后，降解型多囊泡体的主要功能是将内含物运送至溶酶体进行降解，在这一过程中，多囊泡体与溶酶体膜融合，使得多囊泡体内部的内含物(包括蛋白质、脂质和核酸等)被释放到溶酶体内；分泌型多囊泡体与细胞膜(质膜)融合，使得多囊泡体内部的内含物被释放到细胞外环境中。这一过程涉及到多种膜运输和融合蛋白，如RAB家族GTP酶和SNARE蛋白，它们协同作用促进多囊泡体与细胞膜的融合[5，46]。RAB家族蛋白主要在细胞囊泡运输过程中发挥功能，通过GTP和GDP结合形式的转换，起到分子开关的作用，调控囊泡的出芽、形成、转运、锚着和融合，SNARE家族蛋白则在囊泡融合过程中起关键作用，通过形成紧密的复合体，聚集脂膜，促进囊泡与质膜的融合[49]。   2.4   外泌体释放的生化调控机制    2.4.1   TAT-5抑制细胞外囊泡出芽   TAT-5具有磷脂反转酶活性，负责将磷脂分子从细胞膜的外侧转运到内侧，可维持磷脂酰乙醇胺在细胞膜上的不对称定位，防止磷脂酰乙醇胺暴露。若TAT-5缺失，磷脂酰乙醇胺暴露，会导致细胞外囊泡出芽。在秀丽隐杆线虫中，TAT-5是防止磷脂酰乙醇胺暴露所必需的，其缺失会导致磷脂酰乙醇胺暴露，进而引发细胞外囊泡出芽。TAT-5通常内化磷脂酰乙醇胺，而用一种磷脂翻转蛋白酶将磷脂酰乙醇胺外化，可能导致ESCRT复合体在细胞膜上募集或稳定，促使ESCRT复合体在细胞膜上出芽形成外泌体。RAB-11是一种与循环内体相关的GTP酶，可以将出芽所需的蛋白质传递到质膜上，也可以在出芽过程中发挥更直接的作用。综上所述，TAT-5的缺失导致磷脂酰乙醇胺外化，在细胞膜上形成负电荷微域和负曲率微域，这可能促进ESCRT复合体的募集和外泌体的形成。同时，RAB-11在这一过程中也发挥着重要作用，通过GTP酶活性影响蛋白质的运输和外泌体的出芽。这些机制共同参与了外泌体的生物合成和释放过程[50]，见图4。"

TAT-5在细胞内的定位受到细胞内冗余因子的调节[51]，见图5。以下是一些关键的逆转运蛋白和相关因子，它们在调节TAT-5的定位和功能中起作用：①逆转运蛋白RME-8(DNAJC13)：RME-8是人类DNAJC13的同源蛋白，它在内体蛋白运输中起作用，并与retromer和WASH复合体相关联，这两个复合体都与自噬有关。RME-8/DNAJC13在细胞蛋白稳态网络中作为一个正向调节因子，影响自噬过程[52]。 ②磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase，PI3K)：PI3K是一类具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的酶，它们在细胞内信号传导中起着关键作用，尤其是在自噬过程中。③PAD-1：PAD-1是一种Dopey结构域蛋白，它在植物中的功能与生长素稳态相关，但在动物细胞中，PAD-1可能与TAT-5的回收和定位有关[53]。④Beclin1同源蛋白BEC-1：Beclin1是自噬过程中的关键调节蛋白，它与Ⅲ类PI3K形成复合体来调节ATG蛋白在自噬前体结构中的定位，从而调节自噬活性。⑤Ⅲ类PI3Kinase VPS-34：VPS-34是自噬过程中的一个关键蛋白，它在细胞内除了诱导自噬之外，还能够通过激活p62，促进肿瘤的发生和发展；⑥Dna J结构域蛋白RME-8：RME-8/DNAJC13在细胞蛋白稳态网络中起作用，影响ATG9A的运输和自噬。RME-8、PI3K、PAD-1已被证实可抑制细胞微囊泡释放，Beclin1同源蛋白BEC-1、Ⅲ类PI3Kinase VPS-34、Dopey结构域蛋白PAD-1、Dna J结构域蛋白RME-8这4个基因的破坏可增加外泌体的释放，进一步研究证实TAT-5被这些逆转运相关蛋白通过不同的分子信号途径从胞质回收到质膜上[51]。 "

2.4.2   中性鞘磷脂酶抑制剂途径调控外泌体的分泌   鞘磷脂酶将膜脂质鞘磷脂水解为磷酰胆碱和神经酰胺，不同的鞘磷脂酶具有酸性、碱性或中性的最佳pH值，可以将丰富的膜脂质鞘磷脂水解为磷酰胆碱和神经酰胺，SMPD3是研究最多的中性鞘磷脂酶，由磷脂酰丝氨酸和磷脂酸等阴离子磷脂激活，SMPD2在体外和体内都具有中性鞘磷脂酶活性，并且定位于高尔基体和内质网[54]。神经酰胺是一种具有生物活性的鞘脂，参与许多生物学功能，如增殖、凋亡、分化和炎症，在外泌体的形成和分泌过程中起着至关重要的作用。用中性鞘磷脂酶抑制剂GW4869处理细胞后，外泌体的释放量可显著减少。近期有研究使用GW4869阻断蜱成虫唾液腺的外泌体分泌，从而达到了降低病毒传播率的效果[55]。微囊泡和外泌体是细胞外囊泡的两种形式，外泌体大小50-150 nm，微囊泡大小100-500 nm，微囊泡直接从质膜出芽，而外泌体从早期内体和多囊泡体中通过出芽形成腔内囊泡，并通过与质膜融合释放[56]，中性鞘磷脂酶的抑制对两者的调节作用是不同的，用GW4869或RNAi对SMPD2/3抑制后，会减少外泌体的分泌，但也会增加质膜中微囊泡的分泌[56]。 2.5   目前已知调控外泌体释放的研究   目前已有报道称通过物理、生化手段可以提高外泌体分泌水平，其中一些新的方法可以使外泌体的产量提高约100倍，外泌体产量研究的进步使得外泌体的临床应用转化更易实现[57]。 2.5.1   关于提高外泌体分泌的物理方法及对外泌体的影响 (1)机械刺激：机械刺激可以影响外泌体的产生，有研究表明在特定的机械剪切力作用下，可以显著增加细胞外泌体的分泌量。具体来说，当低剪切率(1.5 mN/cm2)应用于3D柱阵列支架上培养的人真皮微血管内皮细胞时，与静水压力对照组相比，外泌体的分泌量可以显著增加，至少增加100倍[57]，这表明适当的机械剪切力可以显著促进外泌体的分泌。而机械敏感性YAP抑制剂的加入导致外泌体分泌量急剧减少，再次证明了外泌体是由机械敏感性介导的分泌过程[58]；循环张力负荷是细胞在各种组织中所受的另一种机械刺激，例如骨骼肌和心肌，与静态控制相比，当原代人骨骼肌细胞暴露于循环拉伸时，可将外泌体分泌量增加一个数量级[58]；这些研究结果表明，机械刺激对外泌体的产生具有显著影响，并且这种影响可能通过特定的机械敏感性途径介导。这些发现对于理解外泌体的生物合成和分泌机制，以及开发新的外泌体生产技术具有重要意义。 (2)空间形状：有研究者发现培养细胞的空间几何形状会影响外泌体分泌的量[58-59]，将细胞培养方案从传统的2D培养瓶换成具有3D几何结构的培养条件，可以增加外泌体分泌的量，例如有研究者比较了常规2D单层细胞培养与甲基丙烯酸羟乙酯涂布法形成的3D悬滴球体培养的骨髓间充质干细胞的外泌体分泌量，发现3D培养的方法使外泌体量分泌增加了3倍[59]。研究还探讨了3D培养提高外泌体产量的可能机制，包括球体尺寸增大导致的细胞数量减少以及缺氧、高细胞密度和非贴壁细胞形态等因素，结果表明非贴壁的圆形细胞本身可能是影响外泌体分泌的一个重要因素[59]。另一项研究中，通过3D培养的人脐带间充质干细胞衍生的外泌体(3D-hUMSCs-Exos)在治疗白癜风方面展现出更为显著的效果，这表明3D培养的外泌体在临床应用中具有潜力[60]。还有研究探讨了不同维度支架培养细胞产生的外泌体对减少β淀粉样蛋白沉积的影响，发现3D外泌体与2D外泌体中产生的miRNAs和蛋白质明显不同，3D外泌体能够在体内、体外上调ADAM10的表达，下调BACE1的表达，降低脑内β淀粉样蛋白的沉积[61]。综上所述，3D培养条件能够显著增加外泌体的分泌量，并且可能通过不同的机制影响外泌体的生物合成和分泌。这些发现对于优化外泌体的生产和应用具有重要意义。 (3)光刺激：高功率低水平激光照射是一种非侵入性的治疗方式，它使用特定波长的光来刺激细胞活动，促进组织修复和再生。Wnt信号通路是细胞内一个关键的信号传导系统，它在多种生物学过程中发挥作用，包括细胞分化、增殖和存活[62]。有研究显示高功率低水平激光照射通过Wnt信号通路可以增加人内皮细胞外泌体的分泌[63]。这一发现表明低水平激光照射可能成为一种新的治疗手段，通过调节外泌体的分泌来治疗与血管功能障碍相关的疾病。 (4)声刺激：有研究发现通过使用高频(4 W，10 MHz)超声刺激细胞可以使外泌体分泌量提高8-10倍，刺激模式为超声刺激10 min，细胞孵育30 min后再重复1次[64]。低强度脉冲超声是一种无创治疗方法，有研究发现，低强度(0.6-2.1 W/cm2或0.6-3.4 W/cm2)脉冲超声促进外泌体分泌，而较高强度(3.4-5.0 W/cm2或5.0 W/cm2)脉冲超声抑制外泌体分泌，这种现象可能与自噬有关[65]，结果表明超声刺激是一种有效的手段，可以显著增加外泌体的分泌量，这对于外泌体的基础研究和临床应用具有重要意义[66-67]。 (5)电刺激：有研究者测试了低水平电刺激处理对细胞分泌外泌体的影响，在小鼠黑色素瘤和小鼠成纤维细胞上施加0.34 mA/cm2 电场持续60 min，可以引起外泌体分泌增加1.7倍[68]。这些研究结果证实了低水平电刺激可以作为一种有效的方法来增加细胞外泌体的分泌，这对于外泌体的基础研究和潜在的临床应用可能会提供一定思路。 2.5.2   通过干扰分子机制促进外泌体释放的方法 (1)基因水平干扰影响外泌体释放：敲除Rab4基因在促进外泌体生物发生方面具有较高的功效，且没有明显的细胞毒性，Rab4敲低和红细胞膜颗粒补充剂的组合将外泌体产量提高了14倍，且不影响外泌体对物质的装载效率[69]；此外，在培养基中补充红细胞膜颗粒进一步促进了外泌体的产生[69]。ISG15修饰(ISG化，是一种蛋白质翻译后修饰过程)通过促进溶酶体对多囊泡体蛋白的降解来控制外泌体的分泌[70]，敲低5种Rab蛋白(Rab2b、Rab9a、Rab5a、Rab27a和Rab27b)可以抑制外泌体的分泌，这些Rab蛋白在调节外泌体的生成中起着关键作用，不同的Rab蛋白负责特定细胞类型中外泌体的分选或分泌[71]。KIBRA被识别为稳定Rab27a的衔接蛋白样蛋白，而Rab27a则在体外和体内都控制着外泌体的分泌。KIBRA敲除时，Rab27a的表达在蛋白质水平显著下调，但mRNA水平无变化。Rab27a的蛋白质降解可以通过蛋白酶体抑制剂lactacystine(Lac)恢复，但不能通过溶酶体抑制剂bafilomycin A1(Baf)恢复。KIBRA与Rab27a相互作用，通过泛素蛋白-蛋白酶体途径阻止Rab27a的泛素化和降解，从而控制外泌体的分泌[72]，TRX2可以和Rab35相互作用，诱导Rab35降解，导致外泌体分泌受损[73]，也有研究者探索了Rab35及GTP酶激活蛋白TBC1D10A–C对外泌体分泌的调节机制[74]。还有研究者通过抑制内体成熟以及减少溶酶体功能来探索是否会影响外泌体的释放，他们通过使用RNA干扰技术，靶向内体运输过程中的两个已知参与蛋白NDRG1和Rab7，结果发现NDRG1表达减少导致外泌体的释放增加了2倍[75]。这些研究结果提供了关于不同蛋白和修饰对外泌体分泌影响的证据，表明通过调节这些蛋白和修饰，可以有效控制外泌体的生物合成和分泌，这对于外泌体释放调控的基础研究具有重要意义。 (2)药物干预影响外泌体释放：研究发现速效救心丸通过上调GTP酶(包括Rab27a和Rab27b)促进外泌体从间充质干细胞分泌，证实了速效救心丸调节心脏平衡的一种新的机制[76]。有研究通过高通量筛选发现了多种药物能够调节外泌体的生物合成和分泌，这些药物包括抑制剂如替法尼布和尼替康唑，以及激活剂如西他沙星和福斯可林，为癌症治疗提供了新的药物再利用策略。研究还揭示了这些药物通过影响ESCRT依赖和非依赖途径以及Ras/ERK信号通路来调节外泌体的生成和释放，为理解外泌体在肿瘤进展中的作用机制提供了重要见解[77]。有研究者选择了4种FDA批准的药物(非诺特罗、去甲肾上腺素、N-甲基多巴胺和甲苯甘醚)以及另一种营养补充剂(毛喉素)来观察对外泌体分泌的影响，结果发现用N-甲基多巴胺和去甲肾上腺素组合处理骨髓间充质干细胞可以通过增强与ESCRT非依赖性通路相关基因(如中性鞘磷脂酶2)的表达，导致外泌体的分泌量增加3倍[78]。有研究者使用碘乙酸钠(糖酵解抑制剂)和2,4-二硝基苯酚氧化磷酸化抑制剂处理细胞，可以导致细胞内的能量消耗，表现为ATP水平降低和AMP水平升高，这种能量消耗状态刺激细胞释放腺苷，进而激活A2B受体系统，最终导致外泌体产生量增加3-16倍[79]。这些研究结果提供了关于不同药物和化合物对外泌体分泌影响的证据，通过调节这些药物和化合物，可以有效控制外泌体的生物合成和分泌，这对于外泌体的潜在临床应用可能具有重要意义。 2.5.3   环境因素对外泌体分泌的影响 (1)缺氧环境：有大量研究发现缺氧环境刺激可以增加细胞外泌体的释放[80-83]，可能与缺氧诱导因子信号通路的激活有关[81]，另外有学者在没有缺氧刺激的条件下通过对缺氧诱导因子过表达，发现对外泌体分泌量的影响有类似的效果[84]。 (2)低pH值环境：已知酸性环境下外泌体分泌会增加[85-86]，与正常pH条件相比，HEK293T细胞在高pH值(11.0)下分泌的外泌体少5倍，在低pH值(4.0)下分泌的外泌体多6倍。pH值从7.4逐渐适度降低到6.5导致肿瘤细胞释放的外泌体增加高达69倍[87]。 (3)低糖环境：在葡萄糖剥夺情况下，永生化的H9C2心肌细胞外泌体分泌增加约4倍[88]，在一项关于氧和葡萄糖调控胎盘细胞外泌体生物活性的研究中发现，中度缺氧和低血糖的结合可以导致滋养层细胞外泌体的产生增加三四倍[89]。这些研究结果提供了关于不同环境因素对外泌体分泌影响的证据，通过调节这些环境因素，可以有效控制外泌体的生物合成和分泌，见表2。 "