2.1    实验动物的选择   ONFH动物模型在实验动物的选择上，首先要考虑所选实验动物要尽可能与人类的解剖学、基因相似性、生理学、生物力学等特点相近；其次要考虑实验动物的伦理、来源、价格、饲养难易程度、造模操作难度等问题，根据实验需求选择最合适的实验动物；而且还要考虑将造模周期、可重复性、成功率、动物死亡率、评价指标等都控制在最优的状况下；同时最重要的一点是所选择的实验动物在建立动物模型后能够较完整的模拟出人类ONFH从早期到晚期ONFH发生发展过程及病理、生理改变并且坏死区域与人类ONFH位置相似，同时在坏死区域修复过程中模型动物股骨头周围生物力学环境也应与人类相似。目前用来建立ONFH的实验动物按照负重方式主要分为双足动物和四足动物两大类[8]，其中双足动物中常用的有禽类，如鸡、鸸鹋；哺乳动物类，如袋鼠、猿猴等；四足动物主要包括一些小型和大型哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔子、绵羊、猪、狗等[9]。 双足动物模拟ONFH最大的优势是与人类的负重方式较为相似，这类动物的特点就是双下肢负重比较符合人类股骨头周围的生物力学环境，突出生物力学在ONFH病程中的作用[10]；这类动物ONFH的病理变化更接近人类而且病变的进程也与人类更为相似。国内外有大量学者采用禽类来进行造模，常用的有鸡、鸸鹋等，但是禽类有几个缺点，第一是与人类的基因相似性差距较大，第二是对于禽类的解剖结构和生理构造的研究不是很深入。而双足哺乳动物如袋鼠、猿猴等，来源比较有限而且价格相对较高，不容易被获取，而且它们对于饲养环境和条件的要求也较高，从而限制了它们的运用。 ONFH用于建模的四足动物一般都是哺乳动物，与人类的基因有较好的相似性。目前最常用的是大鼠和兔子这两类中小型实验动物，因为其价格合理、易于获取、饲养简单。大鼠的基因与人类基因的相似度高达90%，骨组织发生坏死的机制和病理过程也与人类非常相似。由于大鼠终身保持骺软骨，常用来模拟临床上的儿童股骨头骨骺坏死(Perthes’病)；大鼠易于灌胃，因此可以利用灌胃法来制备酒精性ONFH动物模型；在激素性ONFH模型中，大鼠也是十分常用的，因为大鼠体型较小、容易抓取、操作简单。选择大鼠作为模型动物造模的缺点是由于其特殊的生理结构，不容易出现ONFH后期的股骨头塌陷。兔子体型适中、易于饲养、方便麻醉而且股骨头相比大鼠来说更大一些，易于观察和取材。在ONFH疾病模拟中主要用于建立激素性ONFH，其缺点也是非双足动物，股骨头负重和周围生物力学环境与人类相异，在制备激素性ONFH模型时其关节面较完整，病理特征一般和人类ONFH早期相类似，不容易形成激素性ONFH后期的股骨头塌陷，整体病程不符，病理变化的差别也很大。犬、羊、猪等大型动物的体型较大，关节腔隙大，容易进行手术操作，比较适合手术方法造模，例如复位不良造成的ONFH模型、结扎股骨头周围血管造成的ONFH模型、液氮冷冻制备ONFH动物模型等。但是大型动物的缺点是价格较贵、不易于获取、难于饲养、麻醉和手术操作比较复杂。 2.2   ONFH模型的分类及评价 2.2.1   创伤性ONFH模型  创伤因素是引起ONFH的一个很重要的病因，临床上创伤性ONFH主要是由于股骨颈骨折或者脱位后，股骨头周围的血管受到破坏导致血液供应不良甚至中断，造成股骨头周围缺血头部骨组织形成坏死；或者股骨颈骨折后手术复位不良导致股骨头周围应力失衡，骨小梁开始发生微骨折然后骨组织不断修复再生从而形成ONFH。因此在造模方法上可以把创伤性动物模型分为两大类：一种是由于股骨头周围血液供应受阻或中断引起的缺血性ONFH动物模型；一种是由于复位不良导致股骨头周围应力改变形成的复位不良ONFH动物模型[11]。 (1)缺血性ONFH动物模型：缺血性ONFH是由于髋部受到不同程度的创伤后，股骨头周围的血管被破坏导致血液供应不良甚至中断形成股骨头及其周围组织的缺血，从而形成的坏死。此类模型的主要造模方法是对实验动物髋部进行手术操作，暴露髋关节后对股骨头周围血供进行阻断，例如对股骨颈周围血管进行结扎、切除股骨头圆韧带等[12]。相关学者通过切断大鼠股骨头圆韧带以及其余股骨颈环形骨膜组织来建立大鼠缺血性ONFH模型[13]。LIU等[14]采用SD大鼠，对其圆韧带进行切断从而阻断股骨头血供，随后结扎股骨头周围血运，实验结果发现，正常饲养一段时间后大鼠出现了ONFH的病理、生理改变，但是和人类ONFH后期的病理改变进程还有一定的差距。此造模方法适用于模拟临床上创伤后股骨头周围血运受到破坏所导致的ONFH，优点是病因与临床上由于创伤引起的ONFH相似，应用范围广、成模率高；缺点是手术操作复杂，对实验动物造成的创伤较大，死亡率较高等，而且不能完全模仿人类ONFH病理生理全过程，一般不会出现ONFH后期的塌陷等表现，而且此造模方法容易造成股骨颈骨折，不利于后期治疗效果的研究。 (2)复位不良ONFH动物模型：主要方法是在无菌条件下将实验动物股骨颈锯断，然后将股骨头扭转一定角度后进行复位，造成手术后复位不良，最终形成ONFH。GAO等[15]对8只实验犬进行股骨颈骨折处理，然后进行不精准复位，造模后相同环境下饲养一段时间，行影像学检查，股骨头均出现不同程度的坏死表现，所有实验犬均出现骨折不愈合或者畸形愈合，病理切片也显示出骨坏死的典型表现。该方法主要用于模拟临床上由于复位不良引起的ONFH，适用于研究生物力学因素对ONFH进程的影响。优点是能够较真实地还原人类该类型坏死的发病机制；缺点是手术操作难度较大，对动物造成一定创伤，一致性和可重复性较差。 2.2.2   激素性ONFH模型   随着社会的发展，当前在临床治疗上激素的使用越来越广泛，而且一些疾病需要长期使用激素，因此激素性ONFH的发病率也是逐年增长，成为非创伤性ONFH中发病率较高的一种，占ONFH总发病率的50%[16]。激素性ONFH分为单纯激素造模法和激素联合其他物质造模法[17-18]，通过和其他实验动物的对比发现，实验兔具备成本低、饲养简单等优点，是激素性ONFH造模的最佳选择[19-20]。该类模型主要适用于临床上长期大量使用激素所导致的ONFH，优点是操作简单，实验动物易于获取，一致性和可重复性好；缺点是造模周期较长，成模率不高，坏死部位不完全集中在股骨头等。 (1)单纯激素造模：激素性ONFH的发生情况主要与激素本身的性质、药物使用方式、药物使用途径和激素剂量有关。实验室造模常用的激素有甲基强的松龙、醋酸甲基泼尼松龙、地塞米松、氢化泼尼松，有学者对几种类型的激素造模情况进行了相关研究，研究显示醋酸甲基泼尼松龙对ONFH的致病作用最强[21]。主要造模方法相对简单，在一段时间内连续对实验动物进行激素给药，根据不同实验的目的选择不同的给药剂量、方式和种类。曹良权等[22]给予新西兰大白兔腹腔注射甲基强的松龙，结果显示能够形成ONFH的早期病理特征。KABATA等[23]连续8周对实验兔注射低剂量甲基强的松龙进行造模，其中ONFH发生率约为73%，结果显示在注射激素1周后ONFH发生率开始逐渐增加，在2周以后达到高峰，随后ONFH发生率开始下降。RYOO等[24]通过对小鼠灌胃地塞米松进行造模，分别以连续和间断方式给药，结果显示间断使用激素可以减少ONFH的发生率。 (2) 激素联合其他物质造模：在实验研究中，激素性ONFH可以单纯运用激素进行造模，也可以用激素联合一些辅助剂进行造模，对于这2种造模方式目前很多专家持有不同的态度。一些专家认为，首先单纯的使用激素来造模不能完全模拟出临床上激素性ONFH的发生机制；其次添加辅助剂可以缩短造模时间，提高成模率[25]。其实临床大多数激素性ONFH的病例都是在患有一些血液系统或者免疫系统疾病后，在治疗的过程中大量、长期的使用激素，从而造成激素性ONFH。因此运用激素添加辅助剂造模可以先用辅助剂造成机体的功能异常再使用激素，这样能够更贴切地模拟出临床上激素性ONFH的发生过程，更符合临床上激素性ONFH的发病机制。此外，有研究表明，激素性ONFH不止和激素的使用有关还和使用激素前免疫系统出现异常有一定关联，因此一些研究添加辅助剂如内毒素、异种动物血清等，引起免疫反应形成免疫系统的异常，从而导致局部骨组织微循环障碍[26]；然后开始使用激素来进行干预治疗，激素的使用会加重骨组织微循环异常，这样会更快速、高效地形成ONFH，提高造模的成功率[27]。DING等[28]通过实验证明，采用激素联合内毒素的造模成功率更高，采用兔作为实验动物，首先按照100 μg/kg内毒素进行静脉注射，24 h后进行第2次给药，2次给药24 h后肌肉注射甲基强的松龙剂量为20 mg/kg，每次注射间隔24 h，共注射3次，最终形成坏死。激素联合内毒素造模一般用于模拟临床上高凝血状态下使用激素的ONFH患者，SONG等[29]采用兔作为实验对象，造模方法为激素联合马血清，首先用静脉注射的方式给予2次马血清干预，剂量为10 mL/kg，2次给药间隔2周，然后连续经腹膜注射甲基强的松龙3次，1次/d，剂量为40 mg/kg，实验结果显示造模后4-6周出现轻度的骨坏死表现，6-8周后出现骨坏死的一般表现，此方法的造模成功率可达70%。在研究临床上高免疫状态下大剂量使用激素所造成的ONFH时，可选用激素联合马血清的方式进行造模。 2.2.3   酒精性ONFH模型  随着社会的进步和发展，现如今饮酒已成为社交、生活中必不可少的一部分，长期、大量的饮酒会导致酒精性ONFH，因此酒精性ONFH的发病率也随着饮酒量的增加而越来越高，这也是近些年酒精性ONFH发病率急增的主要原因。目前，酒精中毒已经成为在非创伤性ONFH中继过度使用激素以外又一大致病因素。虽然之前很多国内外相关研究已经证明饮酒与ONFH有关，但是关于酒精性ONFH的机制尚未明确。近些年来，国内外很多学者致力于酒精性ONFH发病机制的相关研究，一直进行不断探讨，其中有很多相关学说：骨质疏松学说、乙醇中毒学说、脂肪代谢紊乱学说等。但是此类疾病是由多种机制共同作用的结果，其病理基础为骨内微循环障碍，目前这些学说还没有一种能够得到大家的广泛认可，不能够完整地解释酒精性ONFH的病理过程[30-31]。杨云等[32]采用Wistar大鼠高笼饲养以贴近人站立行走的生物力学特性，一组进行高浓度乙醇(10 mL/kg)灌胃，1次/d，连续6个月；另一组采用生理盐水(10 mL/kg)灌胃，1个月进行1次随机取材，取材位置为双侧股骨头，实验组3个月出现ONFH的相关表现，6个月出现较严重的ONFH病理表现，成模率较高。该方法适用于模拟临床上由于乙醇摄入过度引起骨坏死的患者，探究饮酒过度造成脂代谢紊乱的相关研究。优点是通过灌胃造模对动物造成的损伤较小，操作方便，能够较完整地模拟出临床上该类型疾病的发病机制；缺点是乙醇浓度没有统一标准，浓度把握不好容易造成动物死亡率高，坏死部位不完全集中在股骨头等。 2.2.4   物理方法  激素性ONFH和酒精性ONFH动物模型比较符合临床上ONFH的发病机制和病程，因此在实验研究中一般用于研究该疾病的发病机制等。如果实验目的只为研究ONFH的治疗和预后等方面，而且需要快速且大量建立ONFH动物模型，那么采用物理方法是不错的选择。 液氮冷冻ONFH动物模型是比较常见的物理造模方法。JIN等[33]采用12只成年比格犬进行建模，主要方法是暴露髋关节，将股骨头脱位后切断圆韧带，然后将股骨头裹在一个特定的漏斗里，用液氮对股骨头冷冻3 min，然后恢复正常体温，注意用纱布保护周围组织避免冻伤；实验后8周左右，实验犬股骨头出现了塌陷。虽然此方法造模周期较短，动物死亡率低，可以作为一种造模方式，但是犬是四足动物，并且股骨头负重情况和损伤机制与人类有不同之处，因此也有学者用鸸鹋进行此方法造模[34]。而后国内有大量学者对此方法进行改良，采用钻孔后将液氮注入股骨头造成ONFH的方法进行造模，这样既可以减少由于对实验动物造成股骨头脱位的创伤从而降低实验动物死亡率，也可以明显提高ONFH的造模成功率。物理方法造模的主要优点是造模周期短、动物死亡率低，能够快速稳定地制备大量动物模型，和化学方法造模相比很重要的一个优势在于此方法不会在股骨头内残留化学物质，不会对后期相关修复治疗的研究产生干扰[35]；但是缺点则是该模型仅仅能够用于对该疾病的治疗和预后研究，不能用于该疾病发病机制的研究，有一定的局限性。 2.2.5   化学方法  化学方法建立ONFH动物模型主要是通过某些化学物质对股骨头内部结构造成化学灭活从而形成病变，国内外有很多关于化学方法建立ONFH动物模型的相关研究。FEITOSA等[36]用羊来建立ONFH动物模型，将无水乙醇注入羊股骨头中，分别于3，6，12周对动物取材观察ONFH情况，发现造模成功率非常高。ICHISEKI等[37]用丁硫氨酸亚砜胺建立大鼠ONFH动物模型，丁硫氨酸亚砜胺是一种氧化剂，该模型主要是腹腔注射丁硫氨酸亚砜胺，注射后会出现短暂的极端氧化应激，在该模型中短暂的极端氧化应激被证实能够引起骨坏死。此类方法也有国内学者用鸸鹋来进行造模，因为鸸鹋和人类一样是双足站立，因此髋关节具有与人类相似的生物力学特点，在模拟人类临床ONFH疾病上更为贴近。范猛等[38]采用20只鸸鹋进行造模，主要方法是用特制的探针向鸸鹋股骨头的负重区域注入无水乙醇，对骨细胞等进行灭活形成ONFH，实验结果表明实验组鸸鹋在出现不同程度骨坏死的同时还有重建性的骨修复反应。该方法造模优点是成模时间短、成功率高，操作简便，重复性高；缺点则是会在股骨头内残留一些化学物质影响实验结果，而且同物理方法建模类似，由于不符合临床ONFH疾病的发病过程因此只能用于ONFH治疗和预后方面的相关研究，不能用于发病机制的研究。 2.2.6   其他  除了以上几类比较经典的方法以外还有一些其他应用不是很广泛的ONFH造模方法。以目前的相关研究来看，股骨头血供不足是ONFH的主要病因，因此很多学者采用介入栓塞法来建立ONFH动物模型。国内较早的是马坤等[39]通过介入栓塞法来建立犬的ONFH模型，采用9只犬，选一侧股骨头供血动脉灌注平阳霉素及明胶海绵栓塞处理，对侧股骨头作为对照，MRI结果显示均造模成功。介入法造模的优点是发病机制清楚，造模周期短，动物造模后成活率高，成模率高，而且能够比较完整地模拟人类ONFH病理、生理过程；缺点是关于造模时栓塞部位以及材料的选择还有待进一步研究和完善。目前关于介入法的相关研究并不多，但是该方法能够较完整地模拟临床上ONFH的病变过程，因此有待进一步深入研究，明确栓塞部位以及栓塞剂的选择，从而找到建立理想动物模型的突破点。 减压法也可以建立ONFH模型，主要方法是将实验动物先置于高于大气压的空间内然后再进行减压，造成一种减压性ONFH模型。FLAGG等[40]将猪完全暴露于大约2.7倍标准大气压下22 h左右，然后将周围气压快速减到标准大气压来建立减压性ONFH模型，此方法造模的成功率为80%左右。SOBAKIN等[41]把羊置于2.79倍标准大气压下24 h，随后再以每分钟下降0.91倍标准大气压的速度直到标准大气压状态，从而建成ONFH动物模型。此方法的优点不只能造成股骨头的坏死，包括肱骨、胫骨、桡骨近端和远端都有骨坏死病变发生；缺点是这种动物模型有一定的局限性，而且对实验设施要求较高。虽然运用不是很广泛但是此方法有利于研究减压性ONFH的发病机制、诊断和治疗。"