3   组织工程再生技术的主要临床应用情况   Main clinical applications of tissue engineering regeneration technology 在口腔颅颌面中，组织工程技术拓宽了间充质干细胞的应用领域和范围，自体间充质干细胞移植有望为临床治疗牙髓再生、牙周组织再生及颅颌面骨再生提供新的策略。在此将从支架、细胞及生长因子的选择、制备、一般流程、术后随访和安全性评估等方面介绍组织工程技术在口腔颅颌面硬组织重建中的策略。 3.1   牙髓再生 3.1.1   牙髓再生对于颅颌面硬组织的重要意义   牙髓位于牙齿硬组织内部，包括神经、血管、淋巴和结缔组织，主要功能是形成牙本质、营养、感觉以及防御。当牙髓损伤后，牙髓干细胞可以分化为成牙本质细胞样细胞，形成修复性牙本质。在临床中，针对因深龋或创伤导致的年轻恒牙牙髓暴露，常常采用活髓切断术保留根部健康的牙髓，从而促进牙根继续发育。但是当年轻恒牙的牙髓完全损伤坏死后，传统的根管治疗难以保证有效的根尖孔闭合，并且失去牙髓营养的牙齿结构会变得脆弱，因此牙髓再生替代传统根管治疗是保留牙齿活力并维持牙齿强度的重要方式。 3.1.2   牙髓再生的支架、细胞及生长因子选择 (1)支架：作为细胞移植的载体，支架为牙髓干细胞的生长和新陈代谢提供了三维空间。此外，具有适当生物活性的生物材料支架可以创造有利的再生微环境，微调牙髓干细胞的自我更新能力，从而促进组织再生。目前，天然和合成的支架材料已广泛应用于牙髓再生。在牙髓血管再造过程中诱发的血凝块可能是最早出现的天然促再生物质之一，因此人们研究了以胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、壳聚糖、透明质酸、海藻酸钠和肽等天然衍生物质为基础的支架作为牙髓再生支架。 脱细胞外基质是一种去除供体细胞和抗原，同时保留细胞外基质结构和生物活性的生物支架，它能为外源性和内源性干细胞提供合适的再生龛位。人脱细胞外基质水凝胶可显著促进牙髓干细胞向牙骨质和血管分化，由于其具有微创注射性、原位凝胶化和可调降解性，这种组织特异性水凝胶可能在牙髓再生方面具有巨大的转化潜力。目前，人、牛、猪和大鼠的脱细胞牙髓组织已被应用于牙髓再生。 牙本质基质由于非免疫原性和富含与牙本质生成相关的生长因子，可能是另一种用于牙髓牙本质复合体再生的天然生物材料。与氢氧化钙相比，牙本质基质糊剂在体外和体内都具有更好的化学和生物特性，很可能成为一种新型牙髓封闭剂[3]。 聚乳酸、聚(L-乳酸)、聚乙醇酸、聚(D，L-乳酸-缩水甘油酯)和聚己内酯等合成聚合物因无毒、可生物降解和可操作的特性，以及可改变的机械刚度和降解率，已被建议作为临床牙科应用的潜在支架[4]。 合成细胞外基质模拟物的工作已经取得了很大进展。作为牙髓干细胞的可注射支架，纳米纤维海绵状微球可在纳米尺度上模拟细胞外基质的纤维结构，再现细胞-细胞和细胞-基质之间的相互作用，并在原位再生牙髓样组织。电纺丝是另一种用于牙髓再生的纳米技术。电纺纤维的表面形态和弧度有利于牙髓干细胞黏附，电纺纤维胶原束的超分子结构有助于引导牙髓干细胞的命运走向牙体形成，而无需其他细胞因子[5-6]。 最近，水凝胶支架被引入组织工程领域。水凝胶的亲水性使其能够保持较高的含水量，并使营养物质扩散。水凝胶除了具有良好生物相容性、预期降解模式和可调节的机械性能外，还能保持网络的完整性。另外，水凝胶还具有柔韧性和弹性，类似于天然细胞外基质，可在组织再生过程中为细胞提供必要的支持。因此，水凝胶是许多组织工程应用的最佳选择。此外，水凝胶具有的凝胶网络状结构，能装载不同的药物，是良好的药物输送系统[7-10]。 (2)细胞：在牙髓-牙本质复合体再生领域研究的干/祖细胞包括脱落牙齿干/祖细胞、牙周韧带干/祖细胞、牙髓干细胞和牙囊干/祖细胞。 (3)生长因子：血管生成是牙髓再生的首要任务，其次才是牙本质组织和神经组织再生。KIM等[11]提出了一种分两步进行的趋化细胞归巢方法：首先输送趋化细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子，然后将碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子或血小板衍生生长因子与神经生长因子和骨形态发生蛋白7联合输送。 再神经支配是在再血管化基础上维持再生牙髓组织长期活力的另一个关键要求。研究证实，血小板衍生生长因子BB、神经生长因子和脑源性神经营养因子有助于体内具有良好血管和神经支配的牙髓样组织再生[12]。 在支架中加入碱性成纤维细胞生长因子可促进牙髓干细胞增殖和迁移、牙髓样组织生成以及皮下移植后矿化组织沉积，并且在新形成的组织中观察到了更高密度的新生血管[13]。 3.1.3   牙髓再生过程中支架、细胞的制备及保存 (1)支架：创建支架的另一种方法是使用自体血小板浓缩物，包括富血小板血浆、富血小板纤维蛋白和浓缩生长因子，这些自体支架在体外易于制备，由三维纤维蛋白基质和丰富的生物活性分子组成，会随着时间的推移而降解[14]。 (2)细胞培养及保存：在符合良好生产规范的设施中，通过血清采集套装从新鲜采集的血液(200 mL)中分离自体血清。取出自体丢弃的牙齿，纵向切割后浸泡在Hank’s平衡盐溶液中，并在0-10 ℃的严格温度控制下于1 h内运输到符合良好生产规范的设施。如前所述，在严格的生产规范条件下，在隔离器的全封闭系统中根据标准操作程序进行牙髓干细胞的分离[15]。 使用标准无菌技术收集用于牙髓干细胞分离的牙髓组织。在经过认证的实验室中使用规范试剂从牙髓组织中分离和扩增牙髓干细 胞[16]。 异种无血清培养基是一种添加了一些生长因子、细胞因子和其他必需营养素的培养基。在无血清条件下分离和扩增牙髓干细胞是一种可靠且安全的方法[17]。 与传统的二维贴壁培养系统相比，三维球状体培养系统是一种更好的选择，有助于提高细胞的增殖、自我更新能力和干性维持[18-19]。 对于干细胞的生长，几种人血液衍生物(包括自体或同种异体人血清、人血浆、血小板裂解物及其释放因子)已被建议作为胎牛血清的替代品。人血液衍生物被认为比动物衍生产品更安全，因为它们不会带来可能影响患者健康的动物相关疾病的风险。 在二维系统中生产细胞培养物的最常用技术是贴壁培养，细胞在表面生长。传统的二维培养系统耗时、速度慢、占用空间大且容易受到污染。此外，它们缺乏真正的体内细胞微环境，不适合干细胞的大规模培养，这可能导致随着时间的推移而丧失干性和分化潜力[20-21]。三维细胞培养可以模拟三维细胞网络、细胞与细胞外基质以及细胞之间的相互作用，与二维贴壁细胞培养模型相比，它更接近细胞的生理环境，这有利于细胞内的基因表达和信号转导[17]。 细胞的冻存过程包括将一定数量的细胞分散在冻存液中，然后分装到冻存管并置入?80 ℃或液氮罐中进行冷冻。干细胞低温保存技术优化主要面临两个方面的挑战：①冷冻保护剂的组成是否会降低干细胞的活力和功能；②安全问题。 3.1.4   一般流程 入选标准：研究严格遵守临床试验管理规范指南，并通过伦理委员会审批和完成临床试验注册。筛选牙髓坏死或根尖周炎、身体健康、遵医嘱的患者，进行知情同意书签署[22-24]。 方法：将有影响的龋坏组织完全去除。在某些情况下，首先需要用复合树脂和粘接剂恢复缺损洞壁，防止橡皮障夹从牙齿上滑落以及将牙髓腔与唾液和细菌隔离开；随后使用#25 K锉测量根管长度后，对牙本质牙骨质界进行根尖整塑；之后进行常规根管准备。用6% NaOCl和3% H2O2交替冲洗并进一步使用生理盐水冲洗。在细胞移植之前，用米诺环素或0.5%左氧氟沙星浸润的纸尖置入预备后的根管，保持药物接触15 min。采用双重密封体系，即内层为水凝型水泥，外层为复合树脂与粘接剂。移植过程是将冷冻保存的自体牙髓干细胞解冻，用生理盐水洗涤后悬浮在40 μL临床级去端肽胶原支架和重组人粒细胞集落刺激因子的复合载体中。根管交替使用3 mL 6% NaOCl和3% H2O2冲洗，最后用5 mL生理盐水冲洗，通过纸尖干燥根管，然后用2 mL 3%乙二胺四乙酸溶液浸泡2 min，再用5 mL生理盐水进一步冲洗。使用显微注射器将20 μL细胞-支架复合物移植到根管中，避免在内部形成气泡。在根管口放置可吸收的明胶海绵作为物理屏障，随后用玻璃离子水门汀和复合树脂分层封闭，随后进一步使用树脂护套冠进行过渡性修复[24]。 3.1.5   安全性评估及术后随访   患者在牙髓干细胞移植后1，2，4，12，24，28，32周进行随访。记录即刻或延迟不良事件的发生率、严重程度和结局等安全性评价指标。每次就诊时均进行尿化学、血液和血液化学检查。在第4周和24周时监测12导联心电图。在第4，12，24，28，32周进行临床检查，包括叩诊痛和压痛以及根尖周病变的X射线片分析等[24]，判断是否达到美国牙髓病学者学会的三级目标[25] 。 3.2   牙周再生 3.2.1   牙周再生在颅颌面硬组织的重要意义   牙周组织由牙周膜、牙骨质与牙槽骨组成，是连接牙齿与颌骨的重要结构。相比于骨组织，牙周组织时刻面临着口腔微生物的炎性刺激，其组织缺损有导致牙齿掉落的可能，进而对身体以及心理产生极大的影响。 3.2.2   牙周再生支架、细胞和生长因子的筛选   在针对牙周组织再生的临床治疗中，支架、细胞和生长因子的选用是影响治疗效果的关键因素[26-27]。恰当的选择不仅可推动细胞的增殖与分化，还可加速组织再生过程，推动牙周组织恢复到正常的结构与功能[28]。 (1)种子细胞：常使用的种子细胞包括牙周膜干细胞胞[29]、骨髓间充质干细胞[30]、脂肪间充质干细胞[31]、诱导多能干细胞[32]，这些细胞拥有自我更新与多向分化能力，能分化成为成骨细胞、成纤维细胞等细胞，带动牙周组织进行再生[33-35]。 (2)支架：一般常用的支架材料有天然材料，如胶原蛋白[36]、透明质酸[37]，用到的合成材料有聚乳酸羟基磷灰石[38]、聚己内酯[39]、聚乳酸[40]、聚乙醇酸[41]，这些材料可模拟出牙周组织的自然架构，为细胞构建适宜的生长环境[42]。 (3)生长因子：生长因子在牙周组织再生方面扮演关键角色，它们能推进细胞的增殖、分化和细胞外基质合成[43]，常用到的生长因子包括骨形态发生蛋白[44]、转化生长因子[45]、成纤维细胞生长因子[46]、血小板衍生生长因子[47]。其中重组骨形态发生蛋白2、血小板衍生生长因子BB、成纤维细胞生长因子获得了美国食品药品监督管理局的审批用于疾病治疗，但还未延伸到牙周组织治疗。 3.2.3   牙周再生的一般流程 (1)术前准备：术前准备包括患者的评估、检查与治疗方案的制定，医生需对患者口腔健康状况加以评估，包含牙周疾病的严重级别、牙齿松动情况、炎症程度等，实施有关影像学检查，诸如X射线片、CT扫描等，判定牙周组织的损伤状况以及缺损区域的形态，术前要进行全身检查，排除禁忌证。患者术前要进行口腔的清洁及消毒，保障手术安全地开展。 (2)移植时机：急性炎症发作期不宜实施移植手术，防止影响治疗成效。鉴别牙周疾病稳定期的判断标准有：①牙龈红肿症状有明显减轻，探诊出血现象减轻；②牙齿松动度较初诊时改善，影像学检查可见牙周硬骨板或牙槽骨边缘变得致密。 (3)移植方法：①切开组织：使用无菌手术刀切开牙龈，采用刮治工具、超声洁治器或激光去除牙周袋内的病变组织，保留健康的牙槽骨和牙周膜组织，为细胞移植打造有利的微环境；②植入：使用专门的移植器具将制备好的移植物精准地放置到牙周组织受损部位，确保细胞能够均匀分布且与周围组织良好接触；③缝合：使用可吸收缝线进行缝合，保证牙龈边缘紧密挨在一起，防止外界细菌侵入；使用牙周塞治剂保护术区。 (4)术后评估：①牙龈炎症减轻或消失：牙龈的红肿、出血等症状应有明显减轻或消失；②牙周探诊深度减少：牙周探诊深度应有所减少；③探诊出血减少：探诊出血的位点数应小于25%；④牙齿松动度改善：应恢复至Ⅱ度甚至Ⅰ度；⑤临床附着水平改善：重要位点的附着水平有明显恢复；⑥影像学检查：影像学检查可见明显的牙周硬骨板或牙槽骨边缘变致密，表明牙周组织再生和修复；⑦炎症相关指标改善：牙周炎患者血清中的炎症相关指标(如C-反应蛋白等)水平在治疗后应有所降低，与牙周组织的破坏程度和炎症反应呈正相关。 3.3   口腔颅颌面骨再生   颌骨缺损对外观和功能都会产生影响，降低患者的生活质量。下颌骨损伤后，可能导致舌体和咀嚼肌功能异常，从而影响发音、吞咽和呼吸；而上颌骨缺损后，可能导致口鼻腔分隔破坏，出现开放性鼻音和食物反流等，因此促进颅颌面缺损骨组织再生具有重要意义。颅颌面重建面临着许多挑战，包括解剖复杂性、伤口不规则且复杂、出血风险高等[48]。组织工程学的快速发展使自体干细胞再生颅颌面功能性组织成为可能，通过组织工程将骨髓间充质干细胞移植到骨缺损部位以促进骨再生，缩短了手术时间，降低了手术复杂性。 组织工程技术的应用拓宽了骨髓间充质干细胞的应用领域和范围，促进了其对颌骨的重建和修复作用，为临床治疗提供了新的策略。 3.3.1   颅颌面骨再生中细胞因子的选择   组织工程学基于3个核心要素：支架、细胞和生长因子。随着生物材料和干细胞技术的不断进步，目前已成功构建生物工程骨并植入骨缺损。使用生物工程产品进行外科重建在功能、美观和商业上可行，但结构稳定性却不尽如人意。重组人骨形态发生蛋白2、重组人血小板生长因子、转化生长因子β、成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子是潜在的颌骨生长因子。其中骨形态发生蛋白具有诱导成骨分化和加速骨形成的能力，是最重要的生长因子[49]。然而骨形态发生蛋白也有并发症的记录，包括炎性反应、骨质增生、异位骨形成和潜在的肿瘤形成、过早的颅缝融合[50-51]。因此，未来的研究应探讨与缺损大小相关的骨形态发生蛋白剂量，开发更先进的载体或具有控释特性的生物分子，从而实现可预测的骨形成模式[52]。 近年来，基因工程技术在颅颌面组织工程中研究较多，通过基因传输系统将成骨基因输送到骨病变局部，或在植入之前生成因子[53]，从而加快骨缺损的愈合与骨再生。成骨靶向基因涵盖血小板生长因子、骨形态发生因子、血管生成因子和细胞间调节因子[54]。然而，基因疗法目前大部分仍处于动物模型阶段?，还需要针对人体实施随机临床研究。 3.3.2   颅颌面骨再生的生物支架   理想的颅颌面骨支架应拥有和天然骨相近似的机械性能以及良好的骨诱导效果，常使用的支架材料有生物陶瓷、水凝胶等。基于磷酸钙的生物陶瓷材料展现出出色的生物相容性和强度，最具代表性的是羟基磷灰石和β-磷酸三钙，具有较好的骨诱导性，能促进缺损部位骨的生长。功能化的水凝胶支架也是一种有效的骨再生材料，可模拟细胞外基质微环境，推动成骨细胞的迁移、募集与分化，从而助力骨组织再生[55]。在设计、使用水凝胶支架的阶段，应考量一系列特性，如降解速率、机械性能与生物相容性，这些因素与细胞黏附、增殖以及分化有着密切联系。 颅颌面骨再生支架材料的结构特性可以通过机械刺激影响细胞的增殖和分化[56-57]。为形成有利的支架结构，研究者将酸蚀、光刻和等离子处理等技术用于支架表面结构的优化，而静电纺丝、自组装和3D生物打印等技术用于支架立体结构的制备，其中通过静电纺丝设计的纳米纤维已用于促进颅面骨再生[58-59]，自组装肽纳米纤维能够模拟组织形成过程，在骨再生方面显示出良好的前景，光刻技术能够创建精确的微图案，调控细胞行为，改善骨整合[60-61]。目前，3D打印技术因其可定制化，在骨组织再生中备受关注。 (1)三维打印骨再生支架：生物材料支架在促进细胞黏附、增殖和分化方面起着至关重要的作用。因此，构建具有可调理化特性和良好生物相容性的组织工程支架至关重要。传统的支架制造方法，如溶剂浇铸-颗粒浸出法、气体发泡法、相分离法、电纺丝法和纤维粘合法，都缺乏对细胞分布的精确控制和合适的细胞外基质，给组织修复带来了挑战。3D打印技术作为一种创新方法，可快速、精确地重建受损组织或器官[62]。3D生物打印技术克服了传统支架的局限性，可以构建装载细胞的三维结构、模拟体内环境[63]，该技术具有精确的孔隙率、可控的细胞分布、高分辨率的细胞沉积以及成本效益，显著优势在于能精确控制生物支架的结构和孔隙，以及细胞、生物活性因子、生物支架周围微环境的分布模式和空间形态[64-65]。与打印支架后播种细胞的方法相比，直接打印装有细胞的生物芯片，可以获得分布更均匀的支架，这样既能提高细胞存活率，又能提高打印效率[66]。生物墨水大致分为两大类：①基于支架的生物墨水(包括微载体、水凝胶、细胞聚集体和脱细胞基质)；②直接由细胞和生物材料组成的无支架的生物墨水。尽管天然和合成聚合物水凝胶、生物墨水发展迅速，但在克服免疫原性、复制体内微环境和模拟生化特性方面的挑战，限制了它们的再生能力[67]。市场上转化出的产品很少，尚处于早期阶段。 (2)颅颌面骨再生支架的4D打印：传统的3D打印方法无法根据环境变化动态调整形状和功能，相较于3D打印材料，4D打印材料通过编程变形，具有动态结构，能够随时间发生形态或功能的改变。在应用范围方面，4D打印材料更适合动态变化组织的再生修复。 NOROOZI 等[68]提出了一种在植入后能够根据环境变化和机械应力动态调整形状和功能的材料，这种设计有助于减少植入后材料的崩解和变形，更好地模拟天然骨组织的动态行为。ZHANG等[69]设计了一种定时释放生长因子或其他生物活性分子的4D打印材料，为硬组织工程提供了更符合生理的调控手段。4D打印支架可以随时间自我调整和优化其结构。CHEN等[70]发明的4D打印支架可以在特定条件下自动改变形状或孔隙结构，能更好地促进细胞黏附和生长，从而促进组织再生。  3.3.3   颅颌面骨再生的细胞选择   间充质干细胞是从骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带和胎盘、外周血以及诱导多能干细胞中分离出来的细胞。研究表明，在重建受损骨骼过程中使用相同胚胎来源的细胞，可明显改善骨再生和形成。根据缺损的位置和严重程度，骨髓间充质干细胞可以从骨缺损同一部位提取，如颅骨、下颌骨、颅面骨和牙槽骨，为颅颌面骨重建提供有针对性的帮助。然而，不同来源的骨髓间充质干细胞在颅颌面骨重建中的作用存在差异。研究表明，与其他骨髓间充质干细胞相比，颅骨来源骨髓间充质干细胞具有更高的成骨分化能力[71]，这是因为颅颌面骨的骨髓间充质干细胞中碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达水平更高，血管生成潜力更强。 其他来源的间充质干细胞也具有一定的骨再生潜力。脂肪干细胞是从脂肪组织中提取的多潜能干细胞。牙周韧带干细胞和牙龈间充质干细胞已被证明能够促进牙槽骨缺损修复。诱导多能干细胞能够显著降低免疫排斥风险，并且不来源于胚胎或卵母细胞，避免了伦理问题[72]。然而，重编程使用的反转录病毒存在致瘤风险，增加了癌症发生的概率，仍需要进一步研究。 "