2.1   冷冻前的细胞数量和活率    2.1.1  脐带间充质干细胞冷冻前细胞数量、活率及表面标志物表达  从3个脐带样本中培养扩增脐带间充质干细胞至第2代，细胞浓度分别为4×109 L-1和4×1010 L-1，采用ST、CT、GY 3种冷冻保护剂进行细胞冻存，每支规格为1 mL，细胞活率分别为97.43%，97.41%，95.86%。细胞冻存前进行了细胞表面标志物检测，其中阳性指标CD90、CD73、CD105、CD29均不低于98%，阴性指标CD45、CD34、CD19、CD14、CD79a、HLA-DR均不超过2%。 2.1.2  脐血/外周血来源单个核细胞冷冻前细胞数量和活率  对采集不超过12 h的脐血和外周血进行分离培养后，将脐血单个核细胞按照细胞浓度4×109 L-1采用GY、SB、IM 3种冷冻保护剂进行细胞冻存，每支规格为1 mL，3个样本的细胞活率分别为94.53%，95.45%，93.19%；将外周血单个核细胞按照细胞浓度4×109 L-1采用GY、SB、IM 3种冷冻保护剂进行细胞冻存，每支规格为1 mL，3个样本的细胞活率分别为99.84%，99.62%，99.80%。 2.1.3   NK细胞和CIK细胞冷冻前细胞数量和活率   由脐血/外周血单个核细胞衍生的NK细胞和CIK细胞，按照细胞浓度4×1011 L-1采用GY、SB、IM 3种冷冻保护剂进行细胞冻存，每支规格为1 mL，其中外周血单个核细胞衍生的NK细胞活率分别为94.51%，93.94%，95.50%(平均为94.65%)，CIK细胞活率分别为90.03%，89.70%，90.96%(平均为90.23%)。脐血单个核细胞衍生的NK细胞活率分别为94.28%，94.43%，97%.00(平均为94.90%)，CIK细胞活率分别为95.8%，94.69%，96.12%(平均为95.54%)。 2.2   GY对脐带华通氏胶组织复苏培养的细胞形态、细胞数量和活率的影响与ST、CT相似   在经过GY、ST和CT冻存2周后，将脐带华通氏胶组织块复苏培养至第11天，通过倒置显微镜(OLYMPUS-IX73，日本)观察3组细胞样本均呈现出长梭形或纺锤形态(图1)，且细胞融合度均达到85%。将细胞按照5×106 L-1的细胞浓度培养到第2代进行细胞数量和活率检测(表2)，ST组细胞平均收获量为14.33×106，平均活率为95.25%；CT组细胞平均收获量为14.65×106，平均活率为94.09%；GY组细胞平均收获量为15.82×106，平均活率为95.65%。综合细胞数量和活率结果来看，新开发的GY冷冻保护剂略优于其他2种，但3种冷冻保护剂对冻存效果的影响并无显著差异。 "

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2.3   GY对细胞数量和活率的影响与其他冷冻保护剂相似    2.3.1   不同冷冻保护剂对脐带间充质干细胞回收率和活率的影响   为了评估新开发的GY冻存保护剂在低冻存浓度(4×109 L-1)和高冻存浓度(4×1010 L-1)下的效果，复苏了分别使用3种冷冻保护剂冻存的第2代脐带间充质干细胞，检测细胞数量和活率，并计算回收率，通过对比回收率来评估冻存效果。低浓度冻存细胞复苏结果显示(图2A)，ST组平均获得3.80×106个细胞，平均回收率为95.08%，细胞平均活率为96.82%；CT组平均获得3.68×106个细胞，平均回收率为92.00%，细胞平均活率为95.96%；GY组平均获得3.85×106个细胞，平均回收率为96.25%，细胞平均活率为97.60%。细胞活率与冻存前平均活率96.90%基本一致。3组在细胞回收率和细胞活率上并无显著性差异。高浓度冻存细胞复苏结果显示(图2B)，ST组平均获得3.73×107个细胞，回收率为93.25%，细胞平均活率为96.74%；CT组平均获得3.65×107个细胞，平均回收率为91.25%，细胞平均活率为96.54%；GY组平均获得3.80×107个细胞，平均回收率为95%，细胞平均活率为97.47%。细胞活率与冻存前平均活率96.90%基本一致。3组在细胞回收率和细胞活率上也无显著性差异。根据低密度冻存和高密度冻存后的细胞回收率和细胞活率结果，显示新开发的GY冷冻保护剂的冻存效果与其他两组冷冻保护剂无显著性差异。因此，GY冷冻保护剂可应用于脐带华通氏胶组织块和间充质干细胞冻存，为组织和干细胞类细胞冷冻工艺提供了良好的技术参考。 2.3.2   不同冷冻保护剂对脐血/外周血来源单个核细胞回收率和活率的影响   通过检测脐血/外周血来源单个核细胞复苏后的细胞数量和活率，计算出细胞回收率，通过对比细胞回收率评估GY冷冻保护剂的效果。对于脐血单个核细胞，IM组复苏后平均获得3.51×107个细胞，平均活率为93.60%，平均回收率为87.67%；SB组复苏后平均获得3.57×107个细胞，平均活率为94.48%，平均回收率为89.25%；GY组复苏后平均获得3.55×107个细胞，平均活率为94.56%，平均回收率为88.75%。3组之间无论是细胞活率还是细胞回收率均无显著性差异(图3A)。对于外周血单个核细胞，IM组复苏后平均获得3.55×107个细胞，平均活率为93.60%，平均回收率为88.83%；SB组复苏后平均获得3.40×107个细胞，平均活率为94.48%，平均回收率为85.08%；GY组复苏后平均获得3.60×107个细胞，平均活率为94.77%，平均回收率为89.92%。3组之间无论是细胞活率还是细胞回收率均无显著性差异(图3B)。综合细胞数量和活率结果来看，新开发的GY冷冻保护剂对脐血/外周血单个核细胞冻存复苏后的细胞回收率与IM、SB冷冻保护剂无显著性差异，即GY冷冻保护剂适用于脐血和外周血单个核细胞的冻存工艺。 2.3.3   不同冷冻保护剂对NK细胞和CIK细胞回收率和活率的影响   对冻存后的NK和CIK细胞复苏后进行细胞数量和活率检测，对于脐血单个核细胞衍生的NK细胞：IM组复苏后平均获得3.39×108个细胞，平均活率为94.51%，平均回收率为84.70%；SB组复苏后平均获得3.43×108个细胞，平均活率为95.33%，平均回收率为85.68%；GY组复苏后平均获得3.48×108个细胞，平均活率为97.18%，平均回收率为86.88%。使用3种冷冻保护剂冻存脐血单个核细胞衍生NK细胞的细胞回收率无显著性差异(图4A)。对于脐血单个核细胞衍生的CIK细胞：IM组复苏后平均获得3.32×108个细胞，平均活率为92.72%，平均回收率为83.05%；SB组复苏后平均获得3.38×108个细胞，平均活率为92.03%，平均回收率为84.53 %；GY组复苏后平均获得3.39×108个细胞，平均活率为93.04%，平均回收率为84.64%；使用3种冷冻保护剂冻存脐血单个核细胞衍生CIK细胞的细胞回收率无显著性差异(图4B)。对于外周血单个核细胞衍生的NK细胞：IM组复苏后平均获得3.31×108个细胞，平均活率为91.92%，平均回收率为82.87%；SB组复苏后平均获得3.32×108个细胞，平均活率为94.29%，平均回收率为82.89%；GY组复苏后平均获得3.36×108个细胞，平均活率为94.80%，平均回收率为83.99%；使用3种冷冻保护剂冻存外周血单个核细胞衍生NK细胞的细胞回收率无显著性差异(图4C)。对于外周血单个核细胞衍生的CIK细胞：IM组复苏后平均获得3.44×108个细胞，平均活率为95.02%，平均回收率为85.94%；SB组复苏后平均获得3.50×108个细胞，平均活率为95.38%，平均回收率为87.55%；GY组复苏后平均获得3.51×106个细胞，平均活率为96.89%，平均回收率为87.73%。使用3种冷冻保护剂冻存外周血单个核细胞衍生NK细胞的细胞回收率无显著性差异(图4D)。根据细胞数量和活率检测结果显示，无论是脐血单个核细胞还是外周血单个核细胞衍生的CIK细胞和NK细胞，在细胞回收率和活率方面，使用3种冷冻保护剂无显著性差异，这表明新开发的GY冷冻保护剂适用于脐血/外周血来源单个核细胞衍生的NK细胞/CIK细胞的冷冻过程。针对免疫细胞，无论是单个核细胞还是衍生的NK细胞/CIK细胞，均可以采用GY冷冻保护剂，为标准化及规模化推广应用提供了技术基础。 2.4   GY对细胞复苏扩增后表面标志物的影响与其他冷冻保护剂相似    2.4.1   脐带间充质干细胞表面标志物检测   使用3种冷冻保护剂冻存的第2代脐带间充质干细胞复苏后进行表面标志物检测，结果显示，与细胞冷冻前检测结果一致，阳性标志物的平均阳性率达到95%以上，而阴性指标均低于2%，3组细胞表面标志物均无显著性差异(图5)。 "

2.4.2   CIK细胞和NK细胞亚群分析   脐血单个核细胞衍生的CIK细胞：GY组平均由57.79%的CD3+CD8+细胞和23.80%的CD3+CD56+细胞组成；SB组平均由53.36%的CD3+CD8+细胞和29.25%的CD3+CD56+细胞组成；IM组平均由51.28%的CD3+CD8+细胞和平均27.09%的CD3+CD56+细胞组成(图6A)。外周血单个核细胞衍生的CIK细胞：GY组平均由58.26%的CD3+CD8+细胞和15.23%的CD3+CD56+细胞组成；SB组平均由54.11%的CD3+CD8+细胞和16.67%的CD3+CD56+细胞组成；IM组平均由53.82%的CD3+CD8+细胞和11.26%的CD3+CD56+细胞组成(图6A)。 脐血单个核细胞衍生的NK细胞：GY组平均由79.05%的CD56+CD16+细胞组成；SB组平均由75.86%的CD56+CD16+细胞组成；IM组平均由71.91%的CD56+CD16+细胞组成(图6B)。外周血单个核细胞衍生的NK细胞：GY组平均由68.40%的CD56+CD16+细胞组成；SB组平均由65.02%的CD56+CD16+细胞组成；IM组平均由61.95%的CD56+CD16+细胞组成(图6B)。 无论是脐血单个核细胞还是外周血单个核细胞衍生的CIK和NK细胞，在同类细胞使用3组冷冻保护剂冷冻复苏后细胞的表面标志物表达无显著性差异，表明所开发的GY冷冻保护剂在冻存效果上与IM、SB一致。 2.5   GY对干细胞冻存后三系分化的影响与ST、CT相似   使用GY、ST、CT冷冻保护剂冻存间充质干细胞复苏后进行三系分化检测，结果显示，3组细胞都具有良好的成骨、成脂和成软骨分化能力(图7)，再次验证了新开发的GY冷冻保护剂在冻存效果上与ST和CT一致。 "

2.6   GY对脐血/外周血单个核细胞衍生的NK细胞和CIK细胞杀瘤活性与IM、SB相似   为验证新开发的GY冷冻保护剂对最终细胞制剂有效性方面的影响，复苏了经3种冷冻保护剂保存的脐血/外周血单个核细胞来源的NK细胞和CIK细胞，并进行了体外细胞杀伤毒性检测。在NK细胞/CIK细胞与黑色素瘤细胞系Mel624的效靶比(E∶T)为20∶1共培养后，确认了细胞的杀瘤活性(表3)。结果显示，脐血单个核细胞衍生的NK细胞在杀瘤活性上3组间无显著性差异(P=0.332 4)，其中GY组对Mel624的平均致死率为66.48%，略高于SB组的60.91%和IM组的64.86%；外周血单个核细胞衍生的NK细胞在杀瘤活性上3组之间无显著性差异(P=0.118 6)，SB组、IM组与GY组对Mel624的致死率分别为59.35%，62.22%和63.63%。SB组、IM组和GY组脐血单个核细胞来源的CIK细胞对Mel624的平均致死率分别为61.94%，64.19%和62.08%(P=0.378 0)，SB组、IM组和GY组外周血单个核细胞来源的CIK细胞对Mel624的平均致死率分别为58.62%，61.18%和61.22%(P=0.377 4)。不同冷冻保护剂之间的杀瘤活性基本在50%-70%范围，SB组呈现的结果较GY组略低，可能和细胞冻存的密度相关。SB的细胞浓度范围上限的建议是在1×109 L-1，而实际细胞浓度达到了1×1011 L-1。但是3组的整体结果没有显著性差异，结果说明GY冷冻保护剂与IM、SB在CIK细胞和NK细胞的杀瘤活性方面相似。 "