2.1   小口径人工血管的体内内皮化   内皮细胞和内皮祖细胞是参与人工血管体内内皮化的主要细胞。内皮细胞从吻合部位向人工血管的中心生长，这是对植入过程中损伤的反应[10]。跨吻合口形成的内皮层是连续的，但是仅局限于吻合口周围[11]。因此，对于较长的人工血管，中央段缺乏内皮层仍然有可能因血栓造成狭窄而影响远期通畅率。人工血管植入后，血液中的内皮祖细胞会在其表面黏附、迁移和增殖，形成内皮层[12]。然而，外周血中内皮祖细胞比例仅占约0.01%[12-13]，而且年长者和心血管疾病患者血液中的内皮祖细胞更少，这限制了内皮祖细胞的获取[8，14]。另外，血液中的其他细胞尤其是血管平滑肌细胞会与内皮祖细胞竞争而抑制内皮祖细胞黏附[15]， 因此，依赖内皮祖细胞黏附而形成的内皮层可能是不连续的。此外，当人工血管管壁孔隙直径达到30-90 μm时，毛细血管通过跨壁生长促进内皮化[10]。文章概括了人工血管体内内皮化的3种途径：内皮细胞经吻合口内皮化、内皮祖细胞迁移黏附和毛细血管跨壁生长，见图3。 "

血管移植通常需要移植长度在2 cm以上的血管，移植后如果仅依靠体内内皮化难以形成完整的内皮层。因此，体外种植细胞后再进行移植是一种能够保证人工血管实现完整、均匀内皮化的有效途径。而且，体外种植细胞可以增强人工血管的血液相容性，减少移植后对凝血级联系统的激活，有利于人工血管移植后通畅[16]。图4列举了体外种植细胞促进小口径人工血管内皮化的重要研究。在1978年，研究者首次从血管组织中获取内皮细胞，体外扩增后种植在涤纶人工血管，开创了小口径人工血管体外内皮化的先河。此后20年间，优化内皮细胞成为提升小口径人工血管内皮化的重要研究方向。其中，通过基因编辑技术对内皮细胞进行改造从而提升其抗血栓及内膜增生性能是最为热门的研究策略。随着干细胞研究的发展，内皮祖细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞陆续被应用于小口径人工血管内皮化，并逐渐取代了原代内皮细胞。目前，干细胞应用于小口径人工血管内皮化的研究聚焦于招募体内干细胞或体外种植干细胞来源内皮祖细胞或内皮细胞。"

2.2   小口径人工血管体外种植内皮细胞   内皮细胞可以来源于患者自体或同种异体，但是获取细胞会带来手术创伤，耗时较长，同种异体的内皮细胞存在免疫原性，而且内皮细胞的增殖能力低且来源有限，质量受生理状态或病理状态的影响[16-20]。脐静脉内皮细胞具有数量多、生长快的特点，从脐带获取血管组织不需要额外的手术创伤，相比于患者或其他供体的内皮细胞更具优势[21]。但是从多种血管细胞中纯化脐静脉内皮细胞比较困难[21]。另有研究发现脐静脉内皮细胞在动态培养之后并没有展现出与流动方向一致的排列方式，不利于防止动脉粥样硬化以及减少炎症信号[22]。此外，脐静脉内皮细胞在人工血管材料上黏附并不牢固，不利于防止血栓形成[21]。因此，直接种植内皮细胞需要面临细胞来源少、细胞质量差、准备时间长以及内皮化效果不理想等问题，而应用干细胞为解决以上问题提供了新的思路。 2.3   干细胞与小口径人工血管   干细胞具有自我更新和多向分化能力，应用于小口径人工血管展现出了巨大的潜能。目前，应用于血管组织工程的干细胞有内皮祖细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞，见图5。"

2.3.1   内皮祖细胞内皮化   内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞，存在于骨髓、外周血和脐血等[19]。根据目前共识，内皮祖细胞主要表面标记为CD34和血管内皮生长因子受体2[23]，也有根据CD45，CD14，CD133和CD146等标志物对其进行更细致的分类[24]。内皮祖细胞可通过自身细胞增殖或分泌促血管生成细胞因子及生长因子直接或间接促进内皮形成[25]。MUNISWAMI等[26]发现脐血内皮祖细胞在体外培养时可自发形成管状排列的结构，而且这些内皮祖细胞与成熟内皮细胞具有相似的功能。内皮祖细胞还可以分化出内皮生长细胞，它们也能够抗血栓和抑制内膜增生[27-28]。 内皮祖细胞用于小口径人工血管内皮化主要有两种研究策略：促进人工血管招募体内内皮祖细胞或体外种植内皮祖细胞。体内内皮祖细胞的动员、归巢和分化可以促进血管移植物的体内内皮化，因此借助特异分子招募体内内皮祖细胞或增强其附着从而促进原位内皮化是一种研究策略。常用的表面修饰分子包括多肽、核苷酸及药物等，修饰后的人工血管可以促进内皮祖细胞归巢。在人工血管上种植内皮祖细胞后再移植入体内是另一种人工血管内皮化的研究策略。汪川等[29]将兔骨髓来源的内皮祖细胞种植在脱细胞人脐动脉后移植于兔颈动脉，可以观察到移植术后30 d血管仍保持通畅。内皮祖细胞在体外分化为内皮细胞的功能以及在人工血管上的黏附能力会影响内皮祖细胞体外种植促进内皮化的效果。细胞因子对内皮祖细胞的动员和分化有一定作用，研究发现血管内皮生长因子或基质细胞衍生因子1α等均可以促进体外内皮祖细胞的动员、分化及在人工血管上的生长[25，30-31]。此外，MELCHIORRI等[32]借助管状灌注系统提供类似静脉系统的低水平剪切应力，发现动态培养下内皮祖细胞内皮一氧化氮合酶3的表达上调，有助于抑制血小板黏附聚集从而抑制血栓形成，而且内皮祖细胞在人工血管上增殖、黏附以及分化为内皮细胞的功能增强，分布也比静态培养更为密集。 表2列举了促进人工血管招募体内内皮祖细胞的分子[33-38]，它们在动物实验中展现出良好的远期通畅率。"

需要指出的是，内皮祖细胞在体外增殖能力弱，培养两三代后细胞活性会下降。因此，相较于体外种植内皮祖细胞，促进人工血管招募体内内皮祖细胞更具有前景。随着材料科学的发展，修饰人工血管促进招募体内内皮祖细胞从而实现内皮化是解决内皮祖细胞体外增殖能力弱的有效手段。涂层技术、水凝胶技术及纳米颗粒技术等均能够应用于人工血管表面修饰从而促进招募外周血内皮祖细胞。 2.3.2   间充质干细胞内皮化   间充质干细胞是一群高表达CD105，CD90，CD73及CD44，低表达CD34，CD45，CD11b，CD19及HLA-DR等标志物的细胞，广泛存在于骨髓及脂肪等组织中，具有强大的增殖能力和分化潜能，适合作为人工血管内皮化的种子细胞。间充质干细胞可以在血管内皮生长因子的诱导下向内皮细胞分化[39]。此外，间充质干细胞具有旁分泌和免疫调节功能，可以分泌抗炎症因子并调控巨噬细胞的极化，保护人工血管免受炎症反应[21，40]。最常用于小口径人工血管的间充质干细胞有骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞，胸腺、毛囊和羊膜等来源的间充质干细胞也被用于人工血管研究。 骨髓间充质干细胞：骨髓间充质干细胞应用于小口径人工血管内皮化的研究策略是将其诱导成内皮细胞后种植在人工血管。利用血管内皮生长因子单因子诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化是较成熟的方法，而刘明颖[41]发现血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子协同作用比血管内皮生长因子单独诱导效果更佳。艾文佳等[42]通过调节转化生长因子β1主要Ⅰ型受体ALK5的活化水平从而诱导骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞，种植到脱细胞异种动脉支架7 d后观察到较完整的内皮层。此外，作者课题组发现过表达Gremlin1可以促进骨髓间充质干细胞在缺血环境中存活并有助于血管新生[43]，提示种植过表达Gremlin1的骨髓间充质干细胞有助于人工血管内皮化。与上述内皮祖细胞作用相似，骨髓间充质干细胞可被招募至人工血管从而促进内皮化。SHAFIQ等[44]发现含有P物质和肝素的人工血管移植到大鼠背部皮下后可以招募骨髓间充质干细胞。他们课题组还发现缓释P物质及基质细胞衍生因子1α的聚己内酯/胶原人工血管可以增强细胞浸润、骨髓间充质干细胞招募和血管形成，移植到兔腹主动脉4周后形成血管性血友病因子阳性的单层细胞层[45]。需要指出的是，骨髓间充质干细胞仅占骨髓单个核细胞约0.01%，且随着年龄的增长，其所占比例以及分化能力会逐渐下降，制约了募集体内骨髓间充质干细胞实现人工血管内皮化的效果，提示外源性补充骨髓间充质干细胞可能是实现内皮化的有效补充。 脂肪间充质干细胞：该细胞存在于人体的脂肪组织当中，脂肪抽吸术常见手术部位为腹股沟皮下，创伤小于骨髓穿刺术。脂肪间充质干细胞应用于小口径人工血管内皮化的策略包括将其诱导为内皮细胞后种植或直接种植在人工血管。脂肪间充质干细胞具有成血管功能，可以分化为内皮细胞。BERTANHA等[46]用人血小板裂解物来源的内皮诱导剂生长因子将脂肪间充质干细胞诱导为功能性内皮细胞，种植到脱细胞血管支架上可形成内皮层以及毛细血管样结构。FERIMAN等[47]发现脂肪间充质干细胞和脂肪来源的微血管内皮细胞共同种植在聚乳酸/聚乳糖基乙醇酸人工血管上有助于血管生成和血管网络形成。LIN等[48]发现1-磷酸-鞘氨醇可以刺激种植的脂肪间充质干细胞发挥内皮样功能并防止syndecan-1脱落，增强了脱细胞人脐动脉的抗血栓性能。此外，POLICHA等[49]利用糖尿病患者来源脂肪间充质干细胞种植在人大隐静脉，发现其血管生成能力与正常间充质干细胞无显著差异，但其向内皮细胞分化的功能下降，提示疾病状态会影响脂肪间充质干细胞的质量。然而，由于获取脂肪间充质干细胞并分化扩增内皮细胞耗时长，有研究直接将脂肪间充质干细胞种植在人工血管并进行移植，一些动物实验证实远期通畅效果良好[50-53]，见表3。这些研究提示将脂肪间充质干细胞作为种子细胞直接种植可以发挥类似内皮细胞的功能。 "

其他类型间充质干细胞：胸腺间充质干细胞存在于胸腺的小叶间小梁，在免疫系统的发育和功能执行中发挥重要作用，作为种子细胞的优势是免疫反应调节能     力[54]。毛囊间充质干细胞可以分化为平滑肌细胞，但是目前还没有发现可以直接诱导获得内皮细胞，有研究也尝试将毛囊间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞后再分化为内皮细胞[55-56]。羊膜间充质干细胞存在于人类胎盘，它们分泌旁分泌因子从而调节内皮功能，在体外可以增强内皮细胞的活力并促进内皮细胞网络的形成，在体内可诱导血管生成[57]。除了上述组织来源的间充质干细胞以外，以往还有研究聚焦于脐带、脐血、羊水和心包积液等来源的间充质干细胞[58-60]。 除了不同间充质干细胞来源之外，间充质干细胞亚群、氧化应激、生物力学环境等因素也会影响内皮化效果。选择促血管新生能力强的间充质干细胞亚群作为种子细胞可以有效促进内皮化。间充质干细胞在体外扩增过程中会差异性表达醛脱氢酶，醛脱氢酶可以在细胞受到氧化应激时起保护作用。SHERMAN等[61]发现高表达醛脱氢酶的间充质干细胞是促血管生成的亚群，适用于治疗性血管重建。人工血管移植过程中吻合口附近的天然内皮损伤会引起氧化应激，从而导致间充质干细胞的功能活性下降及凋亡增加。BAI等[62]利用肿瘤坏死因子α预处理静脉移植物，改善间充质干细胞在氧化应激下的存活和迁移，移植后间充质干细胞可以分泌血管内皮生长因子及肝细胞生长因子保护吻合口附近内皮细胞，同时抑制内膜增生，提示可以预处理内皮化的人工血管从而促进移植后适应局部氧化应激环境。此外，特定的生物力学环境作为一种物理信号，对间充质干细胞发挥内皮化功能有重要作用。LI等[39]发现机械力在血管内皮生长因子诱导间充质干细胞向内皮细胞的分化中起促进作用。LA等[63]对种植脂肪间充质干细胞的血管施加适当的动态剪切应力后发现其抗血小板黏附能力有所提升，而且脂肪间充质干细胞在人工血管上沿着特定方向有序排布，这种排列方式有利于人工血管移植后适应血流动力学环境。JIAO等[64]通过增加生物反应器的搏动刺激频率增强骨髓间充质干细胞在脱细胞人工血管上的黏附、增殖和分化能力。但是，ZHAO等[65]发现施加过高和过长时间的剪切应力会导致间充质干细胞的凋亡和死亡，而内源性的细胞凋亡抑制蛋白1是保护间充质干细胞在过度剪切应力下生存的重要分子。 尽管间充质干细胞在人体内分布广泛，但其在体外培养条件下易衰老，增殖和分化潜能在8-10代之后有所下降，种植后可能难以发挥令人满意的生理功能。而且，对于糖尿病患者，高血糖状态导致间充质干细胞修复和再生血管组织的能力受损，严重时间充质干细胞的免疫调节和抗炎症功能也会受到影响[40]。值得一提的是，在上述众多间充质干细胞中，脂肪间充质干细胞具有获取创伤性小、可以直接用于种植的优势，更适合作为小口径人工血管的种子细胞。 2.3.3   诱导多能干细胞内皮化   在2006年，Yamanaka在成纤维细胞利用反转录病毒诱导生成多能干细胞。这种诱导形成的干细胞在形态、增殖分化潜力、细胞表面抗原、类胚体和畸胎瘤生成能力等方面与胚胎干细胞极为相似。诱导多能干细胞来源广泛且易于获得，可来自皮肤、外周血和尿液等[8，66]。将患者来源的细胞重编程为诱导多能干细胞可以避免伦理及免疫排斥问题。此外，如果患者的血管细胞因衰老、血管疾病或基因突变等受到损害，可通过细胞重编程或基因编辑等方式纠正[8，67]。 诱导多能干细胞用于人工血管内皮化最常见思路是将其分化为内皮细胞后种植在人工血管。目前将诱导多能干细胞分化为内皮细胞主要有4种方法：与基质细胞共培养、类胚体途径、添加细胞因子的二维培养和三维培养[17]。近年来，上述方法也在不断改进与完善。有研究将分化培养基中所有动物来源的试剂更换为人来源的试剂并分化无异基因条件的内皮细胞，种植在脱细胞人脐动脉后发现它们能发挥类似于一般内皮细胞的功能[68]。然而，有学者认为诱导多能干细胞来源内皮细胞的功能不如人体内源性内皮细胞。BEZENAH等[69]将脐静脉内皮细胞和诱导多能干细胞来源内皮细胞分别与成纤维细胞进行三维共培养，发现二者均能形成成熟的血管样网络，但是诱导多能干细胞来源内皮细胞形成的毛细血管芽更少。LUO等[18]将种植诱导多能干细胞来源内皮细胞的人工血管移植到裸鼠主动脉，发现7 d后人工血管上存在诱导多能干细胞来源内皮细胞和大鼠内皮细胞，而30 d时只存在大鼠内皮细胞，说明宿主体内内皮细胞可能会更新体外种植的诱导多能干细胞来源内皮细胞。尽管诱导多能干细胞可以分化为内皮细胞，但人体内皮细胞在不同的血管类别和组织类型之间表现出高度的异质性[70]。SIVARAPATNA等[71]利用生物反应器为诱导多能干细胞来源内皮细胞提供生理水平的剪切应力，发现内皮细胞动脉样表型相关的标志物表达上调。但是目前尚无将诱导多能干细胞分化为各器官特异性内皮细胞亚型的方法，未来的研究可以针对特定器官诱导内皮细胞并种植在人工血管用于特定部位病变血管移植。此外，诱导多能干细胞来源内皮细胞还可用于构建人工血管疾病模型，ATCHISON等[72]利用Hutchinson-Gilford早衰综合征患者诱导多能干细胞来源的内皮细胞和平滑肌细胞制备人工血管，发现其表达与内皮相关的心血管疾病的标志物。 除了将诱导多能干细胞分化为内皮细胞，还可以将诱导多能干细胞分化为内皮祖细胞或间充质干细胞，直接作为种子细胞或进一步分化为内皮细胞。作者课题组发现Gremlin1会抑制诱导多能干细胞向中胚层分化而促进内皮祖细胞的分化与扩增，提示可以在内皮祖细胞体外扩增阶段外源性添加重组的Gremlin1从而获得充足的内皮祖细胞作为种子细胞[66]。SAMUEL等[73]在人包皮成纤维细胞来源的诱导多能干细胞所分化的细胞中选择出CD34+/KDR+/NRP1+的内皮祖细胞，并利用二维的培养系统扩增并分化内皮细胞，联合同一诱导多能干细胞来源的间充质干细胞构建组织工程血管移植物。SUNDARAM等[74]利用无血清的化学诱导分化方法，经过神经嵴中间体将诱导多能干细胞分化为间充质干细胞用于构建组织工程血管移植物。 将诱导多能干细胞应用于小口径人工血管内皮化也需要一定的考量，潜在的畸胎瘤形成风险是主要顾虑之一。细胞重编程技术的发展很大程度上解决了诱导多能干细胞的成瘤性问题，已有的非整合性重编程方法可以保证其安全性[75]。临床上利用患者细胞构建诱导多能干细胞来源内皮细胞需要耗费大量时间，而预先大规模生产和冷冻保存患者诱导多能干细胞来源内皮细胞可用于构建组织工程血管移植物[67]。若需要应用同种异体来源的诱导多能干细胞，可以通过消除人类白细胞抗原的表达来建立“通用的”诱导多能干细胞，从而降低免疫原性[20]。另外，诱导多能干细胞的重编程效率低是需要关注的问题[76]。尽管如此，诱导多能干细胞为内皮细胞、内皮祖细胞提供无创且可大量扩增的来源，能够有效解决原代内皮细胞及内皮祖细胞数量有限、质量受年龄和疾病状态影响以及体外增殖能力弱的问题，因此应用诱导多能干细胞仍然是一种很有前景的人工血管内皮化策略，其研究热度将持续上升。未来的研究需要关注诱导多能干细胞来源内皮细胞及内皮祖细胞与原代细胞之间存在的功能差异，确保诱导多能干细胞应用于小口径人工血管内皮化能够达到理想的远期通畅率。 2.3.4   胚胎干细胞内皮化   胚胎干细胞来源于早期胚胎或原始性腺，具有自我更新和多向分化的潜能，它们表达AKP，SSEA-3和SSEA-4等表面分子。理论上，胚胎干细胞可以被诱导为内皮细胞、内皮祖细胞及间充质干细胞。夏振伟等[77]发现血管内皮生长因子联合低氧的培养条件可以促进H9细胞向内皮细胞分化，而且这种内皮细胞能够摄取低密度脂蛋白并形成类似微血管的结构。CAMPAGNOLO等[78]发现胚胎干细胞来源的c-Kit+/Sca-1-血管祖细胞可以通过Klf4/β-catenin依赖的途径诱导向内皮细胞的分化而抑制向平滑肌细胞的分化，而将c-Kit+细胞来源的内皮细胞种植在脱细胞小鼠降主动脉并置换小鼠颈动脉4周后可保持100%的通畅率。SUNDARAM等[79]认为人胚胎干细胞来源的间充质干细胞也可以作为种子细胞。此外，ZHAO等[80]利用A549细胞的条件培养基对脱细胞大鼠腹主动脉进行预处理后，发现小鼠胚胎干细胞在人工血管上的黏附效果有所提升，分布也更均匀。 然而，胚胎干细胞的伦理及免疫排斥问题限制其应用[19，81]。胚胎干细胞具有多向分化的潜能，存在形成畸胎瘤的风险[19]，以往的研究也发现胚胎干细胞应用于人工血管可检测到软骨和骨组织的标志物[81]。因此，胚胎干细胞应用于小口径人工血管内皮化的研究向临床转化仍面临较大挑战。见表4。 "