Stem cell expansion and hepatic differentiation: measurement of related indicators and detection methods

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2082

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Stem cells have wide application prospects in tissue engineering, regenerative medicine, cell therapy and drug research. In recent years, the applied research, such as bioartificial liver, requires large-scale and high-quality stem cells by expansion, and final obtains hepatocytes (hepatocyte-like cells) by directional differentiation. Through this way, how to efficiently obtain the differentiated cells, with excellent consistency, powerful function and uniform expression of markers, are the key problems to be solved.

OBJECTIVE: To review the detection indicators and detection methods related to the process of stem cell expansion and hepatic differentiation, summarize the indicators and methods that have been applied to online detection, discuss the limitations of some indicators and methods applied to online detection, and prospect the indicators and detection technologies expected to be applied to online detection in the future.

METHODS: PubMed, Web of Science, Elsevier and CNKI databases were retrieved for the articles concerning stem cell expansion and hepatic differentiation published from 1990 to 2019. The literature related to stem cell expansion and hepatic differentiation was collected. The keywords were “stem cells; expansion; hepatic differentiation; monitoring; real-time online” in English and Chinese, respectively. A total of 93 articles were searched, and finally 53 eligible articles were selected and reviewed.

RESULTS AND CONCLUSION: There are many detection indicators and detection methods for stem cell expansion and hepatic differentiation. Among them, the detection indicators of the expansion process are mainly related to the maintenance of pluripotency, metabolic activity, survival rate, and cancer transformation trend of stem cells. The process of hepatic differentiation varies with cell types, in which, the pluripotent stem cells and the mesodermal lineage adult pluripotent stem cells should differentiate into the endoderm-oriented cells and then the mature hepatocytes (hepatocyte-like cells), while the endodermal lineage adult pluripotent stem cells mainly composed of hepatic stem/progenitor cells can directly differentiate into mature hepatocytes (hepatocyte-like cells). The specific markers, survival rate and metabolic activity of cells in different stages of differentiation are the focus of detection. At present, although the detection methods based on large-scale biochemical detection and analysis equipment have high reliability, they face the problems of poor real-time performance, high cost and difficulties in integration and miniaturization. Future concerns are focused on the screening of key detection indicators, quantification of detection criteria and realization of automatic online detection during stem cell expansion and hepatic differentiation.

Key words:

bioartificial liver, stem cells, hepatocytes (hepatocyte-like cells), cell expansion, cell differentiation, real-time online

CLC Number:

Yang Jiayi, Zhang Guanghao, Zhang Cheng, Li Ke, Huo Xiaolin, Wu Changzhe.

Stem cell expansion and hepatic differentiation: measurement of related indicators and detection methods [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(25): 4039-4045.

Figures/Tables 3

2 结果 Results 2.1 干细胞扩增过程检测 2.1.1 多能性在干细胞长期大规模扩增过程中，生长因子和转录因子的添加、细胞密度的增加以及外界环境的刺激等因素均会诱导干细胞提前分化，致使干细胞功能丧失。为了获得扩增后功能性完整的干细胞，需要对培养过程中细胞的多能性进行在线检测，以便通过及时干预提高扩增质量。 GREUEL等[7]、CELIZ等[8]通过检测八聚体结合因子4、Nanog同源异形盒基因、SPY盒基因2、碱性磷酸酶等多能性标志以及分化标志物如甲胎蛋白、配对盒基因6等的表达，验证了人多能干细胞多能性的维持。CHEN等[9]、XIE等[10]认为原代成体多能干细胞标志物，例如人间充质干细胞标志物——内皮糖蛋白、波形蛋白，人肝祖细胞标志物——上皮细胞黏附分子、重组蛋白24、细胞角蛋白19；多能干细胞标志物如：人胚胎干细胞表面标志物——肿瘤排斥抗原1-81、阶段特异性胚胎抗原4等，也是表征干细胞自我更新能力保持的重要指标[9-10]。目前，蛋白质组学和基因组分析是对上述指标检测的2种主要方式。FATHI等[11]提出利用表面等离子共振生物传感器可以实现对分化早期细胞表面特异性标志物和蛋白质的在线检测，并利用表面等离子共振信号评估了人成体多能干细胞对内胚层谱系的分化。这种检测方法具有高灵敏度、无破坏性以及快速准确等优势；但在应用于细胞检测时要考虑消逝波深度不够的问题；并且易受外界环境波动的影响，标定困难；同时检测完成后需要对靶点清洗，因此传感器的使用寿命和可重复性也值得关注。 2.1.2 代谢活性干细胞扩增过程伴随着物质和能量的交换。在线检测反映干细胞代谢活性的相关指标，对干细胞扩增水平以及活力的间接表征具有重要意义。 GREUEL等[7]提出培养液中葡萄糖和乳酸的含量变化，是反映干细胞代谢活性的重要指标。黄剑锋等[12]、武发菊等[13]证实培养基中氨浓度过高将抑制细胞的代谢生长，最终引发细胞的凋亡。PARRY-BILLINGS等[14]表明培养基内谷氨酰胺浓度下调会降低细胞的增殖速率以及代谢水平，同时谷氨酰胺在细胞长期培养过程中也易分解产生焦谷氨酸等有毒物质。因此，在干细胞扩增过程中，有必要对氨和谷氨酰胺的浓度在线检测。此外，培养基溶解氧水平也是维持干细胞代谢活性的重要因素。滴定法、试剂盒比色法、高效液相色谱法以及酶膜电极法是对上述指标检测的常用方法。LEE等[15]、辛联庆等[16]、张峰等[17]通过电化学方法实现了对葡萄糖、乳酸以及溶解氧浓度的高灵敏度原位在线检测[15-17]，并对耗材的成本以及酸性气体透膜扩散等问题进行了优化。BAINGANE等[18]研发的自供电乳酸电化学生物传感器具有更稳定的工作性能，并且检测体系和传感器结构都具备小型化的优势。未来利用这种基于酶生物燃料电池的电化学生物传感器进行在线检测更具发展前景。P?UCEAN等[19]、王计元等[20]、NAFTALY等[21]提出利用光学方法如光谱分析法等，也可实现对葡萄糖、乳酸、氨和溶解氧的可靠、快速检测，其中王计元等[20]和TAHERI等[22]研究的基于荧光猝灭原理的生物探针技术，配合光纤传感器与红外光谱分析法，具备高灵敏度、高选择性和极稳定的光学特性。未来这种多技术交叉的光学方法也有望应用于在线检测。目前基于光谱分析法或荧光强度分析法研制的溶解氧传感器已在市面销售，如OXY-1 SMA单通道光纤测氧仪，可实现原位非接触在线检测。此外，韩雨钊等[23]在检测人血浆中谷氨酰胺浓度时，采用的液相色谱串联质谱法具有高特异性、准确性和灵敏度的优势。通过将生化检测分析设备串联使用，显著提升了检测结果的可靠性，可应用于在线检测系统的标定与校准。目前，对于细胞水平的代谢指标如胞外酸化率、胞外氧化还原电位等的检测，还处于实验阶段。蔡华[24]曾对上述两指标的检测方法做了系统的研究，并开发了基于集成芯片的多功能细胞生理自动分析仪，实现了对微量细胞生理状态的实时检测。但原位在线评估单个细胞的代谢水平对检测系统的控制精度要求苛刻，并且不便于对大量细胞开展。未来仍需深入研究这些指标在干细胞大规模扩增场景下的在线检测方法。 2.1.3 存活状况生物反应器内干细胞的存活率由培养方法、培养条件等多因素决定，是衡量细胞扩增效率的重要指标。目前，检测培养基内活细胞的数量、群体倍增时间以及集落形成效率是判断存活率的主要手段，常用的检测方法包括流式细胞仪分析法、染色镜检分析法等。这些方法面临检测成本高、实时性差并且难以集成小型化等问题。取样后添加反应物或标志物，利用光学或声学检测方法，实现对细胞膜通透性、细胞内活性物质以及培养基中分泌蛋白的检测，将有望用于在线评估干细胞活性。例如：GREUEL等[7]通过荧光反应试剂Celltiter-Blue?的添加，配合荧光计检测到了反映细胞活性的荧光强度变化；FU等[25]研究发现荧光标记的效率是影响检测结果的重要因素，他们将非荧光钙黄绿素乙酰甲氧基加入到聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒中，开发出一种可均匀高效标记存活干细胞的纳米传感器，但该传感器信号受快速细胞分裂和胞吐作用的影响稀释明显，稳定性有待提升；YOO等[26]注意到传统的荧光检测需要对样品进行采样，严重影响检测结果的实时性，他们研发的基于外源性光声造影剂吲哚菁绿的光声检测法具有高对比度、灵敏度和安全性的优势，并且吲哚菁绿可随着细胞代谢排出胞外，未来这种光声检测法还有望用于对生物反应器中干细胞活力的原位在线检测。此外，岳伟伟等[27]利用酶促发光原理定量检测腺苷三磷酸含量，从而实现菌落计数。这种方法具有检测速度快、灵敏度高、可小型化的优势，对干细胞活力的在线检测具有借鉴意义。虽然光学或声学的检测方法可实现对细胞活力的有效评估，但荧光探针或染料试剂的使用通常会造成细胞的损伤，难以实现对动态响应的原位在线检测。HUANG等[28]通过电阻抗法连续检测二维培养条件下干细胞的迁移与黏附，进而实现了对干细胞活力的实时原位在线检测。MCKEE等[29]曾表示利用传统的二维培养技术，细胞扩增程度有限，且长期传代后细胞往往失去克隆和分化能力，而通过三维细胞生长来模仿体内环境是干细胞扩增的新方法。在此基础上，LEE等[30]采用四对垂直对齐电极组成的三维电容传感器，实现了对细胞增殖、凋亡以及定向跃迁的实时原位在线检测。电阻抗检测法与介电检测法具有出色的实时性和灵敏度，但标定困难，特异性差，易受外界因素干扰。CELIZ等[8]、LIU等[31]在扩增人多能干细胞过程中对细胞黏附机制的研究发现：整合素α2、整合素α5、整合素α6、整合素αv、整合素β1等是细胞黏附和参与局部黏附信号传导的关键因子，并且表达模式与细胞基质的特性密切相关。未来通过在敏感元件表面修饰整合素抗体，配合电阻抗、表面等离子共振等技术，有望实现特异性更好、精度更高的细胞活性原位在线检测。 2.1.4 转癌趋势研究表明，如果成年人干细胞离体培养增殖太久，有可能发生癌变[32]。及时在线检测扩增过程干细胞的转癌趋势，对规避使用风险、减少资源浪费具有重要意义。染色体异常[31]、端粒酶的表达与活性[32]、原癌和抑癌基因的突变情况、细胞表面糖蛋白的表达以及特异性肿瘤标志物均可作为干细胞转癌趋势的检测指标。但是检测过程大多需要聚合酶链式反应仪、生化分析仪、荧光显微镜、酶标仪等昂贵的大型设备，使得在线检测不便于开展。在临床上，广谱肿瘤标志物——癌胚抗原可作为早期癌症筛查的重要指标。JIN等[33-37]先后利用基于石墨烯薄片的多纳米材料电化学生物传感器、基于叉指电极微流控芯片的无标记非接触阻抗免疫传感器以及基于抗体修饰石墨烯场效应晶体管的无标记免疫传感器，对癌胚抗原进行了高灵敏度、高特异性的快速在线检测，其中重点解决了酶活性对传感器的影响、电化学反应对电极的腐蚀等问题，并利用微流控技术推动传感器的小型化。未来小型化在线检测癌胚抗原将有望实现对干细胞转癌趋势的判断。 2.1.5 检测现状目前保证细胞正常生长及代谢的部分指标已应用于细胞培养过程的在线检测包括温度、溶解氧和酸碱度[38]。温度主要利用铂热敏电阻进行在线检测，而溶解氧和酸碱度的在线检测主要通过电化学检测法或光学检测法实现。此外，葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺的在线检测设备也已商品化如IST AG LV5生物传感器等。在干细胞多能性、存活状况以及转癌趋势检测方面，目前还没有已应用的在线检测指标，但存在对部分指标在线检测方法的研究。利用光学检测法(如光学比色分析法等)和电化学检测法(如基于电极表面修饰的电化学检测法等)对培养液中标志物的在线检测将更易实现，而基因、胞内标志物以及细胞水平的检测指标则难以应用于干细胞大规模扩增过程的在线检测。 2.2 干细胞肝向分化过程检测目前，科研领域已实现肝向分化的干细胞主要分为3类：多能干细胞(胚胎干细胞、人诱导多能干细胞)、中胚层谱系成体多能干细胞(人脂肪组织干细胞等)以及内胚层谱系成体多能干细胞(肝干/祖细胞)，其中前两类细胞先分化为定向内胚层细胞，再分化为成熟肝(样)细胞，而以肝干/祖细胞为主的内胚层谱系成体多能干细胞可直接向成熟肝(样)细胞分化。 2.2.1 多能干细胞肝向分化过程检测研究认为，多能干细胞的肝向分化主要分为6个阶段，即多能干细胞、内胚层诱导、肝性特化、肝母细胞扩张和增殖、肝性成熟、成熟肝(样)细胞。多位学者对多能干细胞肝向分化进行了深入研究[5，39-41]，他们认为通过检测下述标志物可反映细胞所处的具体分化阶段，见表1。 "

2.2.3 内胚层谱系成体多能干细胞肝向分化过程检测此类干细胞可直接分化为成熟肝(样)细胞，其中肝祖/干细胞是肝脏来源的干细胞，也是可分化为成熟肝(样)细胞的主要内胚层谱系成体多能干细胞。在发育学上与肝外来源的干细胞相比，其具有更接近成熟肝(样)细胞的优势，是生物人工肝等应用领域很有前景的细胞源。多位学者对肝祖/干细胞肝向分化过程进行了系统的研究[3，10]。他们通过检测下述标志物验证了肝祖/干细胞肝向分化的进行，见表3。此外，由于肝祖/干细胞可双向分化成肝(样)细胞与胆管上皮(样)细胞，因此有必要检测由此类或经由此类干细胞分化得到的成熟肝(样)细胞中，细胞角蛋白19、γ-谷氨酰转肽酶等胆管(样)细胞标志物，确保它们为阴性表达。 2.2.4 检测现状目前上述特征标志物通常是利用定量反转录聚合酶链式反应和免疫细胞化学方法，配合大型生化检测分析设备，进行高精度、高准确性的离线定量检测。而它们的在线检测方法还有待研究，其中检测灵敏度和特异性的提升、取样过程的规避、检测设备的小型化以及分析时间的缩短是需要解决的关键问题。曹越[45]已利用微流控技术研制了自动在线微检测系统，可用于对生物反应器中尿素的检测，具有耗样量小、实时性好以及灵敏度高的优势。项红升等[46]利用溴甲酚绿比色原理可对肝(样)细胞白蛋白分泌情况进行在线快速定性检测。未来分泌蛋白以及胞外酶含量也有望应用电化学方法(如酶促反应法)以及光学方法(如吸光光度法、光谱分析法)等实现在线检测，而涉及蛋白或酶活性的检测通常涉及药物的代谢过程，因此在应用于在线检测时需考虑检测的实时性问题。其他标志物如基因、包内蛋白和酶、糖原和脂肪滴的积累、低密度脂蛋白的摄取以及转录因子等，由于它们的检测工序复杂需要标记、离心、静置等过程[47]，检测周期长，并且需要依靠聚合酶链式反应仪、显微镜及成像分析系统等大型设备，检测成本高不便于小型化集成，因此难以在线检测。此外，HUANG等[28]认为电阻抗法也可实现对干细胞分化过程的表征，并利用电阻抗法对成脂分化过程进行了连续原位在线观测。但该方法存在传感器标定困难，检测的特异性不足等问题。 "

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