2.1   心肌补片的细胞来源   一个具有完整功能的心脏是由不同的细胞共同组成的，包括心肌细胞和平滑肌细胞等，同时还有具有传导功能的传导束。每种细胞各司其职，同时又相互联系，组成了一个功能整体。对于心肌补片来说，不同细胞所制成的心肌补片所具有的功能也各不相同[12-22]。探究不同细胞所制成的心肌补片的具体功能可以为未来选择合适细胞提供指导，同时针对某种细胞的缺点也可以进行人为干预，具体见表1。文章还总结了心肌补片的研究脉络，见表2。"

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2.1.1   体细胞 心肌细胞：细胞片技术所保留的细胞外基质，可以使细胞最大程度地保留在体内发挥治疗效果。有研究使用新生大鼠的心肌细胞，对比了细胞注射法和细胞片移植两种技术的治疗效果[10]，发现和注射法相比，移植心肌细胞片的大鼠体内移植细胞的存活数量明显更多，成熟的毛细血管数量也显著增加，并且显著改善梗死大鼠的心功能。细胞片不仅提高了移植细胞的存活率，还降低了受体心肌细胞的凋亡。 当细胞片移植到体内后，移植细胞存活的数量会影响其治疗效果外，与受损心肌的贴合程度也是能否发挥治疗效果的重要因素。新生大鼠心肌培养而成的单层心肌细胞片可以在体外发生自发跳动，保留了缝隙连接蛋白(connexin 43)，实现了细胞片内的同步收缩，并且可以与受损心肌实现组织学和电生理学上的整合，改善心肌功能。由于保留了大鼠心肌的缝隙连接蛋白，为制作具有同步收缩活动的三维心脏组织提供了基础。 大鼠心肌细胞制成的细胞片不仅可以作为心肌细胞的移植载体，在制造功能性心管(functional cardiac tubes)方面也取得了不错的进展。将3层大鼠心肌细胞培养而成的细胞片缠绕在气管内管上，使用肠系膜为血管床来产生功能性的心管。将功能性心管移植到体内后，在移植4周后发现移植的心管产生了电刺激收缩，并且经过组织学和免疫组化后证明有心肌细胞的植入并且心管有毛细血管形成[11]。 目前，人们利用小鸡的心肌细胞和新生小鼠的心肌细胞分别构建了细胞片，并且进行了一系列的体内与体外实验。但是使用新生小鼠的心肌细胞制作细胞片最为普遍，新生小鼠的心肌细胞和人的心肌细胞在膜的形态、G蛋白的表达和电生理特性方面有相似之处。但是，单纯使用新生小鼠的心肌细胞无法获得一个完整的心肌细胞片，还需要一些非心肌物质。无论移植何种动物来源的心肌细胞片，最主要就是要克服关于异种间的免疫排斥问题。这在接下来的内容中将会谈论到。 平滑肌细胞：该细胞可以分泌多种血管因子，如血管生成因子、血管内皮细胞生长因子和肝细胞生长因子，因此可以有预期的旁分泌血管生成作用，且易于培养和维持。使用人源性的内皮祖细胞和平滑肌细胞制作的无支架的双层细胞片可以在无胸腺的小鼠中展现出了改善心室重塑的功能，并且在小鼠的心肌缺血边界区观察到了生物黏附系统和脉管发育系统基因的上调[29]。而且将白细胞介素10转导至平滑肌细胞中、增加胰岛素样生长因子在平滑肌细胞中的表达和将抗凋亡基因Bcl-2基因转染至细胞中都可以提高平滑肌细胞在体内的移植效果。 随着细胞片技术的慢慢成熟，科学家把从大鼠主动脉中分离出来的平滑肌细胞制成细胞片，移植到小鼠体内后与人真皮成纤维细胞片对比治疗效果，发现平滑肌细胞片可以更好地抑制心肌重塑，减少心肌纤维化，促进瘢痕区血管形成，并且在体外细胞片可以分泌碱性成纤维细胞生长因子[13]。并且在此之前，就已经有人使用人动脉平滑肌细胞培养成细胞片移植到老鼠体内，在缺血的老鼠体内重建了血运组织。 成纤维细胞：该细胞是非心肌细胞的主要类型。在心肌损伤后，坏死的心肌细胞释放出某些信号，促使心肌成纤维细胞的表型发生转化，使得成纤维细胞可以分泌细胞外基质成分和纤维连接蛋白，刺激细胞因子和生长因子的释放，促进损伤部位的修复[15-16]。除此之外，人成纤维细胞可以产生诱导性多能干细胞，继而衍生出心肌细胞，由衍生出的心肌细胞制成细胞片，在体内也能发挥出治疗效果[30]。血管细胞黏附分子1可以介导AKt、ERK和p38MAPK信号通路的激活，从而促进血管内皮的形成，具有明显的血管生成活性，防止细胞氧化应激死亡，对心脏有明显的保护作用。使用成纤维细胞和心肌细胞混合培养制成细胞片，发现成纤维细胞不仅可以分泌血管细胞黏附分子1，而且促进了心肌细胞的增殖[17]。但是成纤维细胞可以通过旁分泌作用和与心肌细胞之间形成电偶联，所以可能会影响心脏的电生理功能。因此成纤维细胞片植入到体内后可能会增加发生心律失常的风险[31]。 软骨细胞：该细胞可以显著刺激细胞外基质的修饰，诱导上调了弹性蛋白胶原Ⅱ，下调了基质金属蛋白酶1，基质金属蛋白酶2和内源性蛋白酶抑制剂1的表达[14]。因此，软骨细胞片可通过恢复心脏的舒张功能、刺激细胞外基质的重塑和促进血管生成来改善心功能和减弱心肌重塑。把成软骨细胞培养成的细胞片放置在梗死区，细胞片可以刺激梗死区细胞外基质的分泌、增加细胞外基质的弹性，从而减轻左室重构并增强心功能。 2.1.2   单能干细胞 心肌祖细胞：在成人心脏发生损伤后，有约15%的心肌细胞可以发生再生[32]。心肌祖细胞便是这些再生心肌细胞的细胞来源。但是，由于成人体内心肌祖细胞的数量太少，导致心肌在发生致命性的心肌梗死后无法发挥修复作用。DERGILEV等[33]使用心肌祖细胞得到了结构完整的细胞片，细胞片不仅增加了移植到体内的细胞数量，还刺激了受体心肌细胞的增殖和血管生成，极大改善了心肌重塑。移植到体内的祖细胞在梗死区释放基质衍生因子，并且强表达内源性蛋白酶抑制剂2，这些都提示SDF-1/CXCR4信号通路在细胞迁移中起到作用，使得心肌可以保留收缩功能[18]。有报道把心肌祖细胞加入到透明质酸明胶中制备成生物墨水，打印出了400 μm厚的心肌补片，移植到小鼠体内后，也可以显著减少心肌重塑，并且存活了较长时间[34]。心肌祖细胞作为心肌细胞片的可靠细胞来源之一，一些科学家也探讨了如何提高祖细胞片在体内的治疗效果。内皮祖细胞可以释放一些含有特异性microRNA的外泌体，可以促进心肌祖细胞的迁移。将心脏干细胞片与注射内皮祖细胞联合治疗可以比单独的细胞片更好地诱导瘢痕组织修复[35]。 骨骼肌母细胞：该细胞具有自体移植、抗缺血、非肌细胞谱系分化和高增殖潜力等优点，所制成的细胞片能在形态学、组织学和电生理学上与宿主的心肌整合。骨骼肌母细胞片可以修复受损的心肌，减少纤维化，并通过释放基质细胞衍生因子1和其他生长因子来阻止与造血干细胞募集相关的重塑。并且骨骼肌母细胞片在犬心力衰竭模型中也表现出良好的治疗效果[36]。 2.1.3   多能干细胞 间充质干细胞：该细胞有多种来源，包括骨髓源性、脂肪源性、脐带源性和血源性等[37]，因具有低免疫原性、低心律失常风险、临床安全经验丰富、有较强的旁分泌能力和分化能力等优点，因此也被看作是最适合临床治疗的细胞来源。间充质干细胞的来源很多，不同来源的干细胞在制成细胞片移植到体内后分泌的细胞因子是不同的，因此为了达到不同的治疗目的，选择合适细胞来源的干细胞至关重要[38]。 骨髓源性的间充质干细胞片具有强大的旁分泌作用，可以通过释放细胞因子来促进血管生成，并且在心外膜存在的情况下，也能与心肌整合。但是在体内的存在时间较短，只在早期发挥旁分泌作用。脂肪源性的间充质干细胞不仅可以在体内分泌大量的细胞因子，并且相对于骨髓源性的间充质干细胞，脂肪源性间充质干细胞还可以在体内分化为心肌细胞。科学家从小鼠的腹股沟脂肪中提取间充质干细胞，并制成细胞片，移植到小鼠体内后，梗死区心肌室壁的厚度增加，生长因子和细胞因子的表达量升高，并且还发现了梗死区有血管生成，这些现象都可以表明脂肪源性的间充质干细胞改善了梗死心肌的重塑[39]。把脂肪源性间充质干细胞放在碳酸脂板中和纤维蛋白凝胶培养，制作成一个3D心肌补片，可以获得一个具有良好导电性的心肌补片[40]。 骨髓是骨髓源性间充质干细胞的主要来源，随着供者年龄的增长，骨髓的可用性也会下降，其次骨髓的获取是一种侵入性方案，而且骨髓源性间充质细胞在体外扩增时其增殖能力和分化潜力会下降。除此之外，使用骨髓间充质细胞制成的细胞片对梗死心肌的治疗作用只在早期有效，无法在体内起到长久的治疗效果。脂肪源性干细胞具有更高的分化潜力、增殖能力和各种生长因子、细胞因子和趋化因子的表达，因此可以成为一种几乎无限的成体干细胞来源，并且不会产生伦理方面的问题，但是对心肌收缩能力并没有良好的改善效果。还有一种脐带源性的间充质干细胞，此细胞作为一种新兴的细胞来源，相比于其他几种间充质干细胞，具有更高的增殖率，并且获得程序简单，伦理问题较少。 胚胎干细胞和诱导性多能干细胞：多能干细胞还包括两种干细胞，分别是胚胎干细胞和诱导性多功能干细胞。多能干细胞具有无限增殖和分化成各种细胞群的能力，移植到损伤区域的多能干细胞来源的心肌细胞可以补偿部分损伤的心肌细胞，因此，被看作是制作细胞片的细胞来源之一[22]。多功能干细胞分化而来的心肌细胞和内皮细胞混合培养以后可以制成细胞片，干细胞自身也可以制成干细胞片并且细胞本身具有向心肌分化的能力[41]。胚胎干细胞和诱导性多功能干细胞可分化为新的心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。将诱导性多功能干细胞分化而来的3种细胞共同培养所制成的细胞片比单纯一种细胞所制成的细胞片更能改善心脏的功能，并且没有增加心律失常的风险。心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞之间的相互作用有效地增强了细胞片的结构整合和功能，但是可能由于缺血而导致丢失心肌细胞，因此还需要额外的策略来增加血管生成。 在2012年，MIKI等[42]使用小鼠来源的诱导性多功能干细胞制成了高心肌细胞纯度的心肌细胞片，将心肌细胞片移植到体内后，可以在移植部位的心外膜存活并且改善了心功能和心肌重塑。同年，就有科学家开发了一种多功能干细胞分化培养系统，使用此系统可以诱导纯化心肌细胞、内皮细胞和壁细胞。并且在此基础上使用细胞片技术生成了心脏贴片，得到了细胞片改善心肌的作用主要是由心肌细胞产生的结论。2年后， MASUMOTO等[43]又研发出了人诱导性多功能干细胞的分化培养方案，他们通过补充血管内皮生长因子分化诱导血管细胞，在此技术上得到的混合细胞片也明显改善了梗死心肌的功能。随着科学技术的不断发展，有研究团队用人诱导性多功能干细胞开发了一种直径约为3.5 cm的可以自发搏动的临床级心肌补片[44]，移植到猪体内后，梗死区心肌的纤维化面积明显减少和血管密度显著增加。 随着分化培养方案的不断发展完善，这为以后得到大规模多能干细胞-心肌细胞成为可能。但是，多能干细胞自身的致瘤性和由于心肌细胞成熟程度不一样导致的心律失常等因素，一直干扰着多功能干细胞的应用[45]。后来人们发现可以使用间充质干细胞来促进多能干细胞-心肌细胞成熟。因为间充质干细胞可以分泌几种外泌体，而外泌体中的microRNA和蛋白质可以促进多能干细胞-心肌细胞成熟[46]。 2.2   完善心肌补片的策略    2.2.1   不同种类的细胞共同培养   一个完整的心脏不仅仅只有心肌细胞，还包括一些非心肌细胞，例如内皮细胞和平滑肌细胞，它们发挥着各自的生物学功能。因此，想要改善坏死心肌功能甚至代替坏死的心肌，心肌补片只用一种细胞往往是不够的，多细胞共同培养制成的心肌补片开始引起世界各国科学家的兴趣。文章总结了混合细胞的培养方案[17，46-60]，见表3。"

有研究将心肌细胞和内皮细胞共培养后制成细胞片，发现与内皮细胞共培养的细胞片中形成了大量的血管内皮网络，可以极大地促进新生血管形成和改善心功能[47，61-62]。由于成纤维细胞高表达血管细胞黏附分子1，所以心肌细胞和成纤维细胞混合培养后，混合细胞片可以显著增加功能心肌的数量，心肌细胞可以具有更强的增殖能力。还有科学家使用心肌细胞片和成纤维细胞片一起放在一个八角形的柱状体周围，从而成功制作出功能性的管状心脏组织[63]。而内皮祖细胞和成纤维细胞共同培养或者内皮祖细胞和平滑肌细胞共同培养后[48，64-66]，混合的细胞片都能表现出更强的细胞因子或血管生成因子分泌能力、新生血管数量增加和更少的纤维化程度，显著减少心脏重塑。 获得混合细胞心肌补片的方法有2种：一种是前面描述的，将两种或多种细胞混合培养后，把混合的细胞培养成心肌补片；另一种是把两种细胞分别制成细胞片，然后把两种细胞片重贴在一起，也可以获得含有多种细胞的心肌补片。把人诱导性多功能干细胞分化而来的心肌细胞和内皮细胞分别与脱细胞水凝胶混合制成生物墨水，再使用3D打印技术，打印出了约为2 mm厚的心脏贴片[67]。还有报道将血源性内皮细胞和周细胞混合到纤维蛋白凝胶中制作成心肌补片，再将人诱导性多功能干细胞分化而来的心肌细胞混合到纤维蛋白凝胶中制成心肌补片，将两种心肌补片贴合到一起，制成两层结构的心肌补片[68]。 而且，不仅仅局限于两种细胞类型细胞片，大量的科学家正在尝试进行制作具有3种细胞类型的细胞片。有科学家使用小鼠胚胎干细胞分化而来的心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞混合培养制成细胞片，产生了具有血管微结构的细胞片[49]。将人诱导性多功能干细胞分化而来的心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞以动态悬浮式混合培养的方式制成多层心肌补片，所形成的心肌补片移植到体内后显著改善了左室壁应激、梗死面积、血管密度和细胞凋亡，并且未增加心律失常的风险。 2.2.2   生物3D打印   生物3D打印把传统打印技术中所使用的油墨或者树脂替换成了细胞或生物材料与细胞混合制成的生物墨水。使用生物3D打印技术打印心脏贴片主要有两种方法：一种是将细胞种植在可降解的三维支架上；另一种是将细胞或类器官与生物材料混合制成生物墨水，打印出无支架的三维结构。因此现在许多科学家将目光放在如何使用3D生物打印技术构建一个三维心脏结构。 天然的细胞外基质是一种器官特异性材料，它们可以提供天然理化性质，因此器官来源的脱细胞外基质具有最佳的仿生性能[69]。将人心球源性基质细胞(cardiosphere-derived stromal cells)混合至纤维蛋白凝胶中，然后在37 ℃的条件下培育固化，可以形成大约1 mm厚的心肌补片；并且与仿生微血管结合，构建出了一种血管化的心肌补片[70]。细胞外基质不仅可以作为心肌补片的原材料，还可以作为承载细胞的介质。将心肌祖细胞添加到甲基丙烯酸凝胶和脱细胞外基质的混合液中，制成生物墨水，打印出了厚度为0.6 μm的贴片[71]。除了脱细胞外基质，还有许多其他生物活性材料可以作为承载细胞的介质，制成生物墨水。将新生大鼠的心室肌细胞与海藻酸盐-纤维蛋白原生物墨水组合，再与氯化钙进行预交联，经研究发现心室肌细胞在此墨水中有更强的细胞活力和增殖能力，并且表达肌动蛋白和连接蛋白[28]。在糠酰明胶中加入透明质酸作为生物油墨，与小鼠的心肌细胞混合后成功打印出双层结构[72]。 除了混合墨水，对于承载细胞的支架也做了许多的改良。使用丝素蛋白和聚吡啶组成一种具有导电性的支架，将心肌细胞接种到支架上后，通过电刺激可促进心肌细胞的成熟，使心肌补片具有良好的收缩性和导电性。移植到体内后，可改善梗死心肌的重构和射血功能，并且能有效降低发生心律失常的次数[73]。在聚乙二醇水凝胶上打印导电碳化钛(Ti3C2Tx)MXene形成一个复合物支架,在此支架上接种心肌细胞可以形成一个改善心肌同步跳动和传导速度的心肌补片[74]。还有研究人员3D打印出了一种明胶水凝胶微通道，天然的心肌细胞可在此通道内生长分化，并出现同步跳动;通过此水凝胶通道，还可控制心肌细胞的生长方向[75]。 2.2.3   提高治疗效果   细胞片的治疗作用不仅是细胞片提高了移植细胞的数量，还有另一个重要的原因是细胞片保留了细胞外基质，而细胞外基质中含有多种细胞因子。将肝细胞生长因子通过基因工程修饰到骨髓源性的间充质细胞内，再将工程化后的细胞与正常的间充质干细胞一起装载到心肌补片中。基因工程化以后的细胞可以持续分泌干细胞生长因子激活间充质干细胞的心肌修复作用，并且未发现致癌作用[76]。 心肌的组织对氧气的需求量很高，因此心肌补片能否形成充足的血管网络来运输氧气和代谢废物对心肌补片在体内的存活非常重要[77]。由于坏死的心肌本身血流量就少，不利于心肌补片在体内的存活，因此寻找一个可以在心肌补片内提前构建血管网络的方法非常重要。将内皮细胞和成纤维细胞共同培养或者将单培养的细胞片按照不同的排列顺序制成多层细胞片，发现2种方法均可在细胞片内提前形成血管网络[78]。对于复杂的三维心脏组织，也开发了几种生物反应器在体外构建血管：一种是以股肌为基础的血管床；还有一种是以胶原凝胶为基础的血管床。在大鼠的股肌上放置与内皮细胞共培养的心肌细胞片，然后与股肌上的动静脉形成动静脉环，再经过3-5 d的体外循环灌注培养后，细胞片内形成了血管网络并且与体外血管床相连[61]。后来有人使用猪小肠组织的血管组织代替小鼠股肌的血管组织，也取得了不错的效果[47]。 除此之外，对细胞片进行缺氧处理、加入抗坏血酸、单向拉伸细胞片或者改变细胞片的培养环境或培养基内容物，都是提高细胞片治疗效果的潜在研究方向。 2.2.4   抑制免疫反应   无论是哪一种心肌补片，移植后的免疫排斥反应一直是干扰心肌补片广泛应用的限制条件之一。通过基因工程技术将诱导免疫应答的基因敲除，是一种抑制免疫反应的可行方案。组织相容性抗原的缺乏使得异种间的移植成为可能，在缺乏组织相容性抗原的情况下，人的脂肪源性间充质干细胞已经在小鼠、大鼠、兔、斑马鱼等不同动物中进行了实验，并且无不良事件发生[79]。 间充质干细胞可以在不应用免疫抑制治疗的情况下，移植到同种异体中，因此间充质干细胞被认为是抑制排斥反应的有效细胞[80]。骨髓来源的间充质干细胞可以改变免疫系统中的免疫细胞数量和功能从而诱导免疫耐受作用，把具有免疫耐受的间充质细胞应用到心肌补片的移植过程中，可以减少受体的免疫排斥反应。由多能干细胞诱导的心肌细胞和同种的间充质干细胞一起移植到体内，共同移植后，间充质干细胞增加了移植部位的调节性T细胞群的数量并且降低了CD8/CD4比值、th1阳性细胞在CD4阳性细胞中的比例以及几种炎症相关细胞因子的分泌，从而诱导免疫耐受[81]，并且有可能是通过前列腺素E2来诱导的。因为增加前列腺素E2以后，梗死区的移植细胞存活数量增多，并且心功能得到改善[82]。脐带基质间充质干细胞分化而来的内皮细胞不仅缺乏组织相容性抗原，还一定程度上抑制了免疫细胞的活化，因而具有免疫特权[83]。并且脐带基质间充质干细胞已经开始应用于临床[84]。也有报道称，子宫来源的间充质干细胞也具有免疫特权，注射到心肌梗死小鼠中，可以促进梗死区的血管再生，并且没有观察到明显的免疫排斥反应[85]。 2.2.5   纯化多能干细胞   多能干细胞作为当今制作人工心肌补片最有潜力的细胞来源，如何诱导足够数量的心肌细胞和如何解决干细胞的致瘤问题是阻碍多功能干细胞取得临床应用的主要原因[86]。 传统的2D培养系统由于空间有限，无法大规模诱导多功能干细胞。好在3D悬浮培养系统已经开始用于干细胞的大规模诱导[87]。3D悬浮培养诱导出来的血管内皮细胞也与心肌细胞和成纤维细胞共同培养成功制成心肌补片，并且在培养系统中加入细胞因子可以进一步扩增细胞数量。常规的培养基体系中由于乳酸堆积，导致pH值改变，从而致使细胞扩增和分化不足。由此提出了一种连续灌注系统，此系统可以维持乳酸和pH值的浓度。 任何未分化的多功能干细胞自身都具有致瘤性。因此，分化后的心肌细胞纯化方案在发展干细胞来源的心肌补片中至关重要。可以使用Wnt信号分子诱导人多能干细胞分化为心肌细胞[88]，虽然在体内没有发生畸胎瘤，但是也没有100%分化为心肌细胞。TRPV-1是非选择性阳离子通道(non-selective cation channel)中的一个亚型，可以在≥42 ℃或者在化学刺激下被激活，TRPV-1的诱导激活可以介导细胞死亡或者抑制肿瘤发生。在42 ℃的条件下培养多能干细胞48 h后，多能干细胞几乎全部消失，但是由多能干细胞诱导而来的心肌细胞和成纤维细胞却继续存活，不受影响。因此可以利用诱导性多能干细胞及其衍生的心肌细胞对TRPV-1的耐受性差异用来消除生物工程细胞片组织中剩余的诱导性多能干细胞[89]。之后使用无蛋氨酸培养基在42 ℃的情况下培养2 d后，消除了大部分的诱导性多能干细胞，并且没有影响心肌细胞和成纤维细胞的存活率，也没有发现有畸胎瘤产生[90]。此外，他们还发现，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(Dinaciclib)能有效抑制抗凋亡蛋白MCL-1，也能在不影响心脏组织活力的情况下选择性诱导人诱导性多能干细胞死亡[91]。 当干细胞分化完成之后，鉴定是否成功分化为心肌细胞或心肌细胞的纯度是多少非常重要，这直接影响了心肌补片在体内的安全性和治疗效果，因为未分化的多能干细胞在体内具有致瘤性。但是对于纯化后心肌细胞的鉴定并没有一套完整的鉴定方案，目前常用的方案是使用荧光定量PCR和免疫荧光两种检测方式对分化后对心肌细胞标志物和干细胞标志物进行检测，验证分化后心肌细胞的纯度[92]。"