Chinese Journal of Tissue Engineering Research ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (28): 4581-4586.doi: 10.12307/2022.317
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Tian Youjing1, Shi Shuping2, Wu Xing1
Received:
2020-12-22
Accepted:
2021-03-04
Online:
2022-10-08
Published:
2022-03-23
Contact:
Wu Xing, Master, Chief physician, Professor, Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China
About author:
Tian Youjing, Attending physician, Lecturer, Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China
Supported by:
CLC Number:
Tian Youjing, Shi Shuping, Wu Xing. Influence of inorganic nano-fillers on the biocompatibility of implanted silicone rubber[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(28): 4581-4586.
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2.1.1 细胞相容性 细胞相容性指生物植入材料或其浸提液与活细胞之间相互作用后对细胞形态、增殖、活力产生的毒性影响。一般认为生物相容性材料的细胞毒性级别应小于2级。植入硅橡胶是公认的无毒材料,常用的纳米金属及其氧化物填料如银、二氧化钛、氧化锌等可诱导细胞坏死、凋亡和自噬,具有细胞毒性[6-7],因此硅橡胶基金属及其氧化物纳米复合材料中的纳米填料的毒性大小是决定细胞相容性的主要因素,金属纳米颗粒毒性级别越低复合材料的毒性越小,细胞相容性越高,反之亦然。 借助表面改性(涂层、离子注射)或本体改性(混炼)的方法可将金属及其氧化物的纳米离子分散于硅橡胶表面或基胶内,从而构建出硅橡胶基金属纳米复合材料,其细胞相容性的研究主要集中于细胞毒性评价。 氧化锌是一种高功能精细颗粒,具有抗菌性及对正常细胞和癌细胞的选择性毒性等性能[8]。将含纳米氧化锌的无毒杀菌玻璃微球(B2O3-SiO2-Al2O3-Na2O-ZnO系统)填料按5%,15%,25%,35%,50%质量百分比填入聚二甲基硅氧烷中,得到聚二甲基硅氧烷/氧化锌杀菌玻璃微球复合材料,通过测量小鼠成纤维样细胞系(NIH-3T3)的线粒体活性来确定细胞毒性,使用比色非放射性细胞增殖技术分析细胞活力,将细胞活力降低30%以上认为是细胞毒性的表现,结果表明所有不同百分比配方材料的细胞活力值高于70%,均显示出优异的细胞相容性[9]。把氧化铜、十六烷基三甲基溴化铵封端的氧化铜、氧化锌3种纳米颗粒分别填入聚二甲基硅氧烷得到相应的复合材料,这些材料表面不显示任何细胞损伤,也不具有细胞毒性,其中结合有十六烷基三甲基溴化铵封端的氧化铜的聚二甲基硅氧烷具有更为良好的细胞活力[10]。借助离子注入法可直接将银离子发射到硅橡胶表面得到银离子硅橡胶,将大鼠骨髓间充质干细胞在银离子硅橡胶表面进行培养,通过CCK-8试剂盒法观察细胞增殖,比较黏附细胞的数量和形态,纤维状肌动蛋白(F-actin)免疫荧光染色观察细胞骨架形态的变化,结果显示大鼠骨髓间充质干细胞能较好地黏附在改性后的硅橡胶材料上,细胞骨架形态发生变化,银离子注入硅橡胶提高了材料表面的细胞相容性[11]。应用无触发脉冲真空阴极电弧等离子体技术将纳米二氧化钛沉积到硅橡胶表面上,沉积膜厚约为150 nm,表面粗糙度增加。细胞生物学实验证明涂覆二氧化钛样品的体外细胞相容性得到了极大提高,有机硅弹性体的无毒性特性则不受影响 [12]。 过去一段时期来,学者们为如何在金属及其氧化物纳米填料的积极效果与细胞毒性之间取得平衡的问题而困惑,近年来这一问题的解决有了新的突破,从植物中提取绿色合成金属和金属氧化物纳米粒子如银、金、氧化锌、二氧化钛、氧化铜和氧化铁被证明具有低毒性、更好的生物相容性、有效和廉价等优点,已开始了在药物和生物医学应用的研究[13],但尚未发现绿色纳米微粒在硅橡胶生物相容性改良使用的研究文献,因此绿色合成的金属和金属氧化物纳米微粒填料在未来植入硅橡胶细胞相容性改良的应用值得期待。 2.1.2 血液相容性 医用硅橡胶表面疏水性,呈生理惰性,以前被认为是一种血液相容性良好的高聚物,是制造Starr-Edwards心脏瓣膜球假体、人工血管、人工肾脏等与血液接触关键部件的常用材料。当采用小直径硅橡胶血管移植物进行外周血管重建时,早期血栓闭塞是较难解决的问题[14],故认为植入硅橡胶血液相容性仍然有提升的空间。 以往通过表面处理技术将肝素、羟基磷酸钙、产一氧化氮物质、抗凝聚合物固定到硅橡胶表面,来构建抗凝功能硅橡胶。采用纳米金属来改性硅橡胶提高血液相容性是新的尝试,对构建出的聚二甲基硅氧烷/氧化锌杀菌玻璃微球纳米复合抗菌材料进行血液相容性评价,测定血浆血红蛋白水平、血浆凝血时间,计算出溶血度指数,结果显示该材料的溶血度指数低于2%,不具有溶血活性,是血液相容性良好的材料[9]。纳米铁/硅橡胶复合材料是作者前期制备出的X射线可视显影增强材料,将该材料置于枸橼酸钠抗凝的全血中进行血细胞分析、凝血分析及血清总补体(CH50)检测,血浆凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原、D-二-聚体浓度、CH50、C3、C5活性与硅橡胶对照组无明显差异,材料表面血小板数量减少,与硅橡胶对照组相比差异均有统计学意义,认为显影复合材料与血液有良好的相容性[15]。 纳米金属表面处理以获得血液相容性颗粒的研究,开启了纳米金属血液相容性材料制备的新领域。一项对包覆有脂肪酶的纳米金对凝血因子、血小板、凝血时间和凝血强度的影响研究发现,血浆样品的血浆纤维蛋白原水平适度升高,但是对凝血动力学、强度和血小板聚集没有显著影响[16];另一项研究用化学还原方法制备出了三磷酸钠表面改性的银纳米颗粒,通过溶血测定、红细胞形态学测量、血浆重新钙化时间和体外凝血时间检测证明,三磷酸钠表面改性的银纳米颗粒具有改善血液相容性的性能[17];这些新型的血液相容性优良的纳米金属颗粒,为血液相容性材料的改良提升提供了有潜在使用价值的物质,相信未来在硅橡胶方面会得到应用。 2.1.3 表面相容性 硅橡胶常用于人造皮肤、气管、食管、输尿管、软组织重建修复,其表面疏水性既不利于细胞黏附定殖,也不利于蛋白质的吸附,从而影响细胞分化。研究表明,软组织细胞对植入体的反应受材料表面湿润性质和拓扑结构的调节。与光滑表面相比,有沟槽、嵴、纹理的粗糙表面显示出更大的比表面积,允许组织细胞向内生长或与软组织结合;湿润表面更利于细胞和蛋白黏附[18]。纳米金属氧化物改性硅橡胶的表面湿润性一直受到关注,将纳米二氧化钛/室温硫化硅橡胶复合材料分别置于次氯酸和电解的低压含水盐中,二氧化钛显著增加了接触角,降低了表面能并改善了复合材料的疏水性[19];将甲基丙烯酰氧基丙基官能化的磁铁包裹的二氧化硅纳米颗粒直接分散到硅橡胶中,然后将混合物浇铸在硅橡胶基材上固化,可以制备出超疏水表面[20],超疏水表面不利于细胞黏附,减少了细胞增殖,但可增强细胞分化[21],超疏水表面在表面相容性改良中最吸引学者的关注点在于超疏水表面可减小血流阻力,不利于血小板黏附,因而是抗凝、抑制血栓形成的良好界面[22]。将40%的四氧化三铁纳米微粒分散在硅橡胶基质中,通过硅橡胶中的油酸对四氧化三铁纳米微粒进行表面改性,经等离子处理将材料表面的疏水性转变为亲水性[23]。纳米金属填料对硅橡胶表面模式的改变已被证明不仅增加了组织细胞与植入体的接触,事实上,植入体的表面形态和亲、疏水性也影响细胞行为,这一点通常可在粗糙、亲水表面上观察到细胞更易生长和附着。细胞在材料表面的活力、增殖等行为受到纳米表面的影响,表面纳米结构可以精确控制细胞的形态、黏附、内部组织和功能[24]。因为细胞与材料之间、细胞与细胞之间的相互作用信号事件发生在纳米尺度上。 2.1.4 生物力学相容性 在负荷情况下,植入生物材料应具有与所处部位生物组织的弹性形变相匹配的性能,即植入体要有足够强度,在承受功能载荷时保证不发生严重变形或断裂破坏。生物力学行为是设计和构建实用植入材料必须考虑的因素。表面改性对材料原有的力学性能影响轻微,纳米金属颗粒填入医用硅橡胶本体改性之后必然对基胶的机械性能产生一定影响,影响的大小与填料的粒径、数量、补强剂、制备方法等密切相关。仅就纳米金属与硅橡胶之间而言,掺入的超细无机物质可降低或减少聚二甲基硅氧烷的孔隙率,从而降低抗张强度和撕裂性能[25]。从大多数文献来看,纳米金属填料对硅橡胶的力学性能的影响不都是消极的结果。将20×10-6的纳米银颗粒掺入颌面修复硅橡胶会降低硅弹性体的肖氏A硬度,但不会影响撕裂强度和颜色稳定性[26]。最近的荟萃分析认为,将填料颗粒加入有机硅弹性体时在力学性能的改变上存在明显差异,纳米填料在拉伸强度、撕裂强度、硬度和断裂伸长率方面显示出优异的比较结果(占所有研究的30.76%),与微填料表现出不一致的机械性能结果[27]。使用1.5%锆英粉、1.5%氧化钇、2%-6%二氧化钛、2%-2.5%氧化锌,2%-2.5%氧化铈、0.5%钛硅氧化物和1%银锌合金等纳米微粒来增强硅橡胶并使得材料更好地承受生物机械损耗和破坏。植入在细胞外基质的材料的机械性质影响细胞信号传导,以调节关键的细胞过程包括分化、凋亡和转化。通过机械应力传导的过程影响细胞和组织的表型,其中结合细胞外基质分子的受体将细胞骨架连接到细胞外基质,并通过下游信号转导有关细胞外基质特性的信息。然后,该信号传导可以诱导细胞行为和命运的变化[28]。纳米金属硅橡胶基复合材料力学性质与细胞生长过程的文献不多,还有许多未知奥秘。 2.1.5 生物耐久性 临床上有少量长期植入体内的硅橡胶假体材料发生老化的报道,老化表现为胶体褪色、变硬、弹性降低,失去修复重建的替代功能,使医患对植入体“一次植入,终生受用”的期望落空,因此植入硅橡胶的生物耐久性是不容忽视的问题。在自然状态下,有机硅受光、热、氧气的影响会发生老化。在体内,长期植入的硅橡胶在其周围包囊中或更远的部位出现硅元素从基胶中迁出形成硅结节肉芽肿的现象,可能是硅橡胶受到体液腐蚀发生硅氧分子链断裂而老化,导致硅移出,确切机制仍未完全清楚[29]。全喉切除术后Provox 2硅橡胶语音假体是重建发音的装置,用电子显微镜观察评估由于故障而被移除的Provox 2语音假体,发现有机硅表面变得粗糙、变形、溶胀、弹性差和半透明,呈现材料老化,机械性能退化,老化过程似乎与气管和食管中存在的氧气及部分生物膜和免疫系统中氧自由基的产生有关[30]。将纳米二氧化钛粒子与有机硅弹性以2%,4%和6%质量比混合制成复合材料,用人工老化方法对复合材料老化处理,结果显示所有人工老化方法均对6%二氧化钛质量比复合材料的拉伸强度没有影响,该配方比材料具有良好的抗衰老性能,二氧化钛纳米颗粒是有机硅弹性抗老化性能增强的补强剂[31]。 钙化是长期植入体内硅橡胶的并发症之一,至今未能彻底有效地解决[32]。硅橡胶钙化对材料机械性能的影响与老化的表现颇为相似,硅橡胶钙化与老化之间的因果关系还不甚明了。 2.1.6 抗菌功能化 硅橡胶材料植入人体后可能发生材料相关细菌感染,植入硅橡胶隆乳术后的感染发生率为1.1%-2.5%,乳房切除硅橡胶假体乳房重建再造术后的感染率最高可达35%[33]。为了预防植入材料相关感染,构建抗菌功能材料成为趋势,文献颇多。抗菌功能材料的表面预处理包括防污表面、接触杀伤表面和结合并释放抗菌剂的表面,这些方法都有其一定的优点和局限性。 金属银的抗菌性能和机制早已为人熟知,金属银释放出的游离银离子与细菌细胞壁上巯基结合,阻断呼吸链,杀死附着在材料表面的细菌。纳米银是由银原子组成的微粒,其比表面积增大,更易氧化而释放银离子,纳米银颗粒的尺寸越小,表面原子数与其内部原子数的比例越高,银离子的释放速率显著增高,这是纳米银的小尺寸效应和表面效应。因此,纳米银的杀菌效果显著高于金属银,是高效杀菌剂[34]。当纳米银颗粒的尺寸比病毒还小时,可以通过其表面的银离子对真菌、细菌细胞壁或膜造成直接损伤并进入细胞,引起细胞凋亡或坏死。纳米银有全方位的抗病原微生物性能,能杀灭病毒[35]、真菌[36]、细菌甚至寄生虫而不产生耐药问题[37],在植入材料的抗感染功能化构建应用方面持续受到青睐。将岩藻糖功能化纳米银粒子固定在硅橡胶导尿管表面可以杀灭100%形成生物膜的绿脓杆菌[38],其他纳米微粒如二氧化钛[39]、氧化锌[40]、氧化铜等本体改性硅橡胶也可获得良好的抗菌效果[41]。纳米金属氧化物的抗菌作用与其金属离子释放之间的关系是:纳米氧化锌的抗菌作用因于二价锌离子 的释放;纳米氧化铜的抗菌作用既来自二价铜离子的释放,也来自氧化铜颗粒对细菌的直接破坏;纳米二氧化钛的抗菌作用是纳米颗粒对细菌的直接破坏。 2.2 非金属填料改性硅橡胶的生物相容性 20世纪后半叶,以硅元素为主要成分的计算机芯片无疑是最重要的元件,因此有“硅时代”之称。20世纪末期,诸如富勒烯和碳纳米管之类的纳米碳已经在21世纪兴起了纳米科学和纳米技术,随着石墨烯的新发现,纳米碳和纳米技术得到了进一步发展,并确实开启了一个新的“碳时代”[42]。碳基纳米材料如碳离子、碳纳米管、碳纳米点、纳米石墨烯及其衍生物具有独特的性能,近年来在纳米生物医学中引起了相当大的关注[43],成为硅橡胶的生物相容性改良研究上的新焦点。"
2.2.1 碳离子硅橡胶 碳离子具有较强的杀灭肿瘤细胞效应,在临床上主要用于肿瘤的重离子放疗[44]。通过离子注入技术可将碳离子注入硅橡胶表面,体外显微分析技术显示碳注入的硅橡胶具有表面上不规则的峰和深谷,表面的水接触角降低,表面电荷分布、硅氧速率和化学元素分布发生改变,有利于细胞附着。在碳离子硅橡胶表面培养的真皮成纤维细胞生长更快,主要黏附蛋白的表达水平明显高于硅橡胶培养的真皮成纤维细胞。碳离子硅橡胶上的那些相同的真皮成纤维细胞显示出更明显的黏附和迁移能力[45]。 进一步研究表明,当碳离子注入的剂量小于1×1016离子/cm2时,增强的细胞相容性是剂量依赖性的;当硅橡胶中碳离子注入的最佳值为1×1016离子/cm2,离子注入调节吸附的细胞外基质蛋白构象变化,并介导细胞内信号的表达[46]。将碳离子硅橡胶植入大鼠皮下,其表面胶原蛋白沉积更少、组织包囊更薄[47]。最近有人用双离子注入技术将碳离子和银离子注入硅橡胶的表面,离子注入后新材料的表面粗糙度和拉伸强度增加,体外评估表明低抗原基团符合安全标准,碳/银离子注入硅橡胶的抗菌黏附力和杀菌能力均优于硅橡胶,尤其是针对表皮葡萄球菌,动物体内植入碳/银离子注入硅橡胶,其表面能促进成纤维细胞的黏附,周围包囊的厚度显著降低,故碳离子注入硅橡胶是生物相容性良好的新型材料[48] 。 2.2.2 碳纳米管硅橡胶 碳纳米管是一种具有特殊结构(径向尺寸为纳米级,轴向尺寸为微米级)的一维量子材料,被称为是21世纪最有前途的纳米材料,已被应用于药物输送、基因治疗、生物传感器和组织工程的研究[49],未来在生物医学中将具有巨大的应用潜力。 经过涂层技术将碳纳米管添加在硅橡胶表面以提高其细胞黏附性,涂覆碳纳米管的表面形成了密集堆积的网状结构,表面粗糙度和蛋白质吸附能力增强,在涂有碳纳米管有机硅上的细胞增殖能力增强。碳纳米管涂层被认为可能是解决与硅氧烷植入物相关细胞黏附不易问题的简单有效方法[50]。近年多采用打印技术可将碳纳米管直接嵌入到聚二甲基硅氧烷胶体中,打印的碳纳米管更加牢固地在聚二甲基硅氧烷表面,碳纳米管/ 聚二甲基硅氧烷复合材料也具有更好的机械性能(力学性能)[51]。与聚二甲基硅氧烷相比,该复合材料在细胞毒性方面没有显著差异,表面上观察到了增强的细胞黏附性,将碳纳米管整合到聚二甲基硅氧烷细胞接种支架中可以使组织再生过程更有效[52]。添加多壁碳纳米管的乙烯基甲基硅橡胶复合材料具有自感应能力且保持低硬度,显示较高的弹性回复率(约20%的塑性变形),将为软组织的修复重建提供新的材料[53]。 大多数聚二甲基硅氧烷弹性体的人工神经引导导管都不透明,在神经修复手术中很难确认受损神经的两个残端位置和愈合状态,必须再次切开导管以观察术后神经的再生情况。通过印刷转移法使用聚二甲基硅氧烷和多壁碳纳米管可制备出透明复合材料,聚二甲基硅氧烷/多壁碳纳米管片材显示出较高的机械强度、一定程度的电导率和高透明度;对大鼠脑组织和坐骨神经的体内可行性测试表明,聚二甲基硅氧烷/ 多壁碳纳米管片具有很高的透明度,可用于人工神经引导导管的进一步开发,尤其是对于那些需要电刺激的组织[54]。 2.2.3 石墨烯硅橡胶 石墨烯是二维蜂窝状原子晶格结构的新型碳材料,具有优异的光、电和力学特性,被认为是一种未来革命性的材料。石墨烯具有抗菌、抗血小板和抗癌活性,在生物医学界引起了学者的极大兴趣[55]。基于石墨烯的复合材料是石墨烯应用领域中的重要研究方向,已在硅橡胶改良上获得成功。 既往硅橡胶弹性体心脏瓣膜容易疲劳(老化),极大地限制了其在瓣膜假体重建中的适用性。将石墨烯纳米片引入两组分的聚二甲基硅氧烷混合物中并使其固化,制备出聚二甲基硅氧烷/石墨烯纳米片复合材料,循环拉伸实验表明,含有250 mg/L石墨烯的有机硅样品可显著改善材料的疲劳性能;同时细胞毒性和血液相容性测试表明,掺入石墨烯纳米片不会对细胞增殖产生不利影响,也不会增加血小板在复合材料表面的黏附[56]。三维石墨烯是一种石墨烯衍生的材料,通过化学气相沉积法将三维石墨烯泡沫浸涂在聚二甲基硅氧烷上,结构表征证实了聚二甲基硅氧烷表面具有互连的三维多层石墨烯结构;在该复合材料表面培养成纤维细胞(L929),细胞存活力(Alamar blue测定)、活性氧产生和纽蛋白免疫荧光成像评价其细胞相容性,在三维石墨烯/聚二甲基硅氧烷复合材料上的细胞活力随着培养时间的增加而增加,在3-6 h的培养时间内复合材料上培养细胞产生的活性氧产生比对照少,成纤维细胞表达黏附蛋白,并在三维石墨烯/聚二甲基硅氧烷表面上良好黏附,机制是三维石墨烯/聚二甲基硅氧烷在培养液中具有适度的接触角、较小的负ζ电势合适表面性能和成纤维细胞诱导了无明显峰的氧化电流信号,+0.9 V氧化电势下的氧化电流随细胞数的增加而线性增加,因此三维石墨烯/聚二甲基硅氧烷复合材料表现出高的细胞相容性[57]。石墨烯的另一衍生物是氧化石墨烯。利用涂层技术将氧化石墨烯涂覆在三维聚二甲基硅氧烷支架,支架的机械强度增加,重要的是该支架能够支持人类脂肪干细胞向成骨细胞谱系的生长和分化,表明其潜在的骨形成过渡结构[58]。 总之,新碳纳米材料对植入硅橡胶的改良研究方兴未艾,学者们认识到纳米填料的尺寸、表面电荷、横向尺寸、维度和表面化学等参数都会对生物系统产生相应的影响,尤其是纳米微粒在体内释放导致的潜在纳米细胞毒性(即纳米相容性、不可控制的纳米生物降解性后果、生物蓄积性)仍然未知。要求对纳米填料硅橡胶进行严格的国际标准化深入研究,以评估改良材料的生物相容性和植入实用性。"
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