移植人脐带间充质干细胞修复新生大鼠脑白质损伤髓鞘化障碍

doi:10.12307/2026.248

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (19): 4890-4896.doi: 10.12307/2026.248

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移植人脐带间充质干细胞修复新生大鼠脑白质损伤髓鞘化障碍

张书绢1，徐倩倩1，王超1，李芸慧2，朱艳萍3

1新疆医科大学儿科学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2皖南医学院研究生院，安徽省芜湖市 241002；3新疆医科大学第一附属医院新生儿科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2025-09-10 接受日期:2025-11-30 出版日期:2026-07-08 发布日期:2026-02-14
通讯作者: 朱艳萍，博士，主任医师，新疆医科大学第一附属医院新生儿科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:张书绢，女，1996年生，硕士，主要从事新生儿疾病方向的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(地区科学基金项目)(82060288)，项目负责人：朱艳萍

Transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells to repair myelination disorders in neonatal rats with white matter injury

Zhang Shujuan1, Xu Qianqian1, Wang Chao1, Li Yunhui2, Zhu Yanping3

1School of Pediatrics, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Graduate School of Wannan Medical College, Wuhu 241002, Anhui Province, China; 3Department of Neonatology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2025-09-10 Accepted:2025-11-30 Online:2026-07-08 Published:2026-02-14
Contact: Zhu Yanping, MD, Chief physician, Department of Neonatology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhang Shujuan, MS, School of Pediatrics, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (Regional Science Foundation Project), No. 82060288 (to ZYP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

新生大鼠脑白质损伤模型：大鼠在出生后第2-4天建立新生大鼠脑白质损伤模型，其脑发育阶段相当于人类胎龄24-32周，是早产儿脑白质发育的关键窗口期。常用方法主要有脂多糖诱导炎症、缺氧缺血处理或两者结合，以模拟临床早产儿感染和缺血缺氧的病因学背景。该模型能在分子与组织学层面再现髓鞘生成障碍、少突胶质细胞成熟停滞和神经炎症等病理特征，并在行为学实验中表现为学习和记忆功能缺陷。因此，该模型不仅可用于研究发病机制，也为验证干细胞治疗等新干预手段提供了可量化和可重复的实验平台。
少突胶质细胞：是中枢神经系统中负责髓鞘形成的主要细胞，分化过程呈现高度阶段性。首先，少突胶质前体细胞起源于胚胎神经管，具有增殖和迁移能力，常用标志物为神经胶质抗原2和血小板源性生长因子受体α；随后进入髓鞘形成前阶段，这是由前体细胞向成熟少突胶质细胞分化的关键过渡期，易受损伤和炎症影响，特征分子包括被O4抗体识别的硫酸化半乳糖神经鞘脂以及被O1抗体识别的半乳糖神经鞘脂；最终细胞分化为成熟少突胶质细胞，能够合成和维持髓鞘，典型标志物为髓鞘碱性蛋白、髓鞘少突胶质糖蛋白等。

摘要
背景：髓鞘化障碍是早产儿脑白质损伤的核心特征。近年来，人脐带间充质干细胞用于多种脑损伤动物模型研究中，显示具有修复髓鞘的能力。阐明人脐带间充质干细胞促进神经髓鞘化的调控机制，将有助于优化治疗策略并推动临床应用转化。
目的：探讨人脐带间充质干细胞对脑白质损伤新生大鼠少突胶质细胞谱系成熟停滞所致髓鞘化障碍的修复作用。
方法：选取72只2日龄Sprague-Dawley大鼠，随机分为假手术组、脑白质损伤组和人脐带间充质干细胞移植组，每组24只。采用小剂量脂多糖联合缺氧缺血建立新生大鼠脑白质损伤模型。造模后第14天，通过苏木精-伊红染色观察脑白质病理改变，结合免疫组织化学染色、蛋白免疫印迹实验和实时荧光定量聚合酶链式反应联合检测少突胶质细胞系转录因子2、神经胶质抗原2、髓鞘碱性蛋白阳性表达、蛋白及mRNA表达水平。造模后第28天，通过劳克坚牢蓝染色观察神经髓鞘形成情况，通过莫里斯水迷宫实验测试大鼠空间学习记忆能力。
结果与结论：①造模后第14天，苏木精-伊红染色结果显示：脑白质损伤组大量细胞变性坏死及神经纤维排列紊乱；人脐带间充质干细胞移植组细胞形态接近正常，神经纤维排列较为整齐；②造模后第14天，各组间少突胶质细胞系转录因子2阳性表达、蛋白及mRNA表达水平无统计学差异(P > 0.05)；与假手术组相比，脑白质损伤组神经胶质抗原2阳性表达、蛋白及mRNA表达水平上调(P < 0.05)，而髓鞘碱性蛋白阳性表达、蛋白及mRNA表达水平下调(P < 0.05)；与脑白质损伤组相比，人脐带间充质干细胞移植组神经胶质抗原2阳性表达、蛋白及mRNA表达水平下调(P < 0.05)，而髓鞘碱性蛋白阳性表达、蛋白及mRNA表达水平上调(P < 0.05)；③造模后第28 天，劳克坚牢蓝染色结果显示：与假手术组相比，脑白质损伤组神经髓鞘表达减少(P < 0.05)；与脑白质损伤组相比，人脐带间充质干细胞移植组神经髓鞘表达增加(P < 0.05)；④造模后第28 天，莫里斯水迷宫结果显示：与假手术组相比，脑白质损伤组逃避潜伏期时间延长、穿越平台次数减少(P < 0.05)；与脑白质损伤组相比，人脐带间充质干细胞移植组逃避潜伏期时间缩短、穿越平台次数增加(P < 0.05)；各组间平均游泳距离无统计学差异(P > 0.05)。结果表明，人脐带间充质干细胞可促进脑白质损伤新生大鼠少突胶质细胞谱系发育成熟，修复髓鞘化障碍并改善认知功能。

https://orcid.org/0000-0001-5621-3409 (朱艳萍)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 人脐带间充质干细胞, 脑白质损伤, 少突胶质细胞, 髓鞘, 新生大鼠

Abstract: BACKGROUND: Myelination deficits are a core feature of white matter injury in preterm infants. In recent years, human umbilical cord mesenchymal stem cells have been applied in various animal models of brain injury, demonstrating the capacity to promote myelin repair. Elucidating the regulatory mechanisms by which human umbilical cord mesenchymal stem cells enhance neural myelination will contribute to optimizing therapeutic strategies and facilitating clinical translation.
OBJECTIVE: To clarify the reparative effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells on myelination disorders caused by maturation arrest of the oligodendrocyte lineage in neonatal rats with white matter injury.
METHODS: Seventy-two two-day-old Sprague-Dawley rats were randomly divided into a sham-operated group, a white matter injury group, and a human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group, with twenty-four rats in each group. A neonatal rat white matter injury model was established by a combination of low-dose lipopolysaccharide and hypoxia-ischemia. Fourteen days after modeling, hematoxylin-eosin staining was used to observe pathological changes in white matter. Immunohistochemistry, western blotting, and real-time quantitative polymerase chain reaction were used to detect the positive expression, protein expression, and mRNA expression levels of oligodendrocyte transcription factor 2, glial antigen 2, and myelin basic protein. Twenty-eight days after modeling, Luxol fast blue staining was performed to observe myelin formation, and the Morris water maze test was used to evaluate spatial learning and memory ability.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Fourteen days after modeling, hematoxylin-eosin staining showed that a large number of cells in the white matter injury group were degenerated and necrotic, and the arrangement of nerve fibers was disordered; while the cell morphology in the human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group was close to normal, and the nerve fibers were arranged more neatly. (2) On day 14 after modeling, there was no statistically significant difference in the positive expression, protein, and mRNA levels of oligodendrocyte transcription factor 2 among the groups (P > 0.05). Compared with the sham-operated group, the positive expression, protein, and mRNA levels of glial antigen 2 in the white matter injury group were upregulated (P < 0.05), while the positive expression, protein, and mRNA levels of myelin basic protein were downregulated (P < 0.05). Compared with the white matter injury group, the positive expression, protein, and mRNA levels of glial antigen 2 in the human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group were downregulated (P < 0.05), while the positive expression, protein, and mRNA levels of myelin basic protein were upregulated (P < 0.05). (3) On day 28 after modeling, Luxol fast blue staining results showed that compared with the sham-operated group, the white matter injury group had decreased myelin expression (P < 0.05). Compared with the white matter injury group, the human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group had increased myelin expression (P < 0.05). (4) On day 28 after modeling, Morris water maze results showed that compared with the sham-operated group, the white matter injury group had prolonged escape latency and decreased platform crossing times (P < 0.05). Compared with the white matter injury group, the human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group had shortened escape latency and increased platform crossing times (P < 0.05). There was no statistical difference in average swimming distance between the groups (P > 0.05). These results suggest that human umbilical cord mesenchymal stem cells can promote the maturation of oligodendrocytes in neonatal rats with white matter injury, repair myelination disorders, and improve cognitive function.

Key words: human umbilical cord mesenchymal stem cells, white matter injury, oligodendrocytes, myelin sheath, neonatal rats

中图分类号:

张书绢, 徐倩倩, 王超, 李芸慧, 朱艳萍. 移植人脐带间充质干细胞修复新生大鼠脑白质损伤髓鞘化障碍[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(19): 4890-4896.

Zhang Shujuan, Xu Qianqian, Wang Chao, Li Yunhui, Zhu Yanping. Transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells to repair myelination disorders in neonatal rats with white matter injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(19): 4890-4896.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 为满足统计学要求并保证组间差异的显著性，各实验组样本量均≥6。实验共使用78只Sprague-Dawley
大鼠，脑白质损伤模型制备过程中死亡6只，最终纳入结果分析的数量为72只，符合统计学标准。
2.2 各组大鼠脑白质组织病理学改变 造模后第14天，苏木精-伊红染色结果显示，假手术组脑白质结构完整，细胞大小均匀、形态规则，核质分界清晰，神经纤维排列整齐；脑白质损伤组结构明显破坏，细胞水肿、核固缩及坏死显著，细胞间隙增宽，神经纤维走向紊乱且疏松；人脐带间充质干细胞移植组脑白质病理改变较脑白质损伤组明显缓解，组织结构相对完整，细胞形态接近正常，神经纤维排列较为规整，见图2。

2.3 各组大鼠脑内少突胶质细胞系转录因子2、神经胶质抗原2、髓鞘碱性蛋白阳性表达水平 造模后第14天，免疫组织化学染色结果显示，各组间少突胶质细胞系转录因子2阳性表达无统计学差异(P > 0.05)；与假手术组相比，脑白质损伤组神经胶质抗原2阳性表达增加约88.9%、髓鞘碱性蛋白阳性表达减少约39.7%(P < 0.05)；与脑白质损伤组相比，人脐带间充质干细胞移植组神经胶质抗原2阳性表达减少约23.5%、髓鞘碱性蛋白阳性表达增加约43.9%(P < 0.05)，见图3、表1。

2.4 各组大鼠少突胶质细胞系转录因子2、神经胶质抗原2、髓鞘碱性蛋白的蛋白及mRNA表达水平 造模后第14天，蛋白免疫印迹实验与实时荧光定量聚合酶链式反应检测结果显示，各组间少突胶质细胞系转录因子2的蛋白及mRNA表达水平无统计学差异(P > 0.05)；与假手术组相比，脑白质损伤组神经胶质抗原2的蛋白表达水平上调约91.2%及mRNA表达水平上调约199.0%(P < 0.05)，而髓鞘碱性蛋白的蛋白表达水平下调约60.0%及mRNA表达水平下调约68.3%(P < 0.05)；与脑白质损伤组相比，人脐带间充质干细胞移植组神经胶质抗原2的蛋白表达水平下调约20.0%及mRNA表达水平下调约41.8%(P < 0.05)，而髓鞘碱性蛋白的蛋白表达水平上调约57.9%及mRNA表达水平上调约103.0%(P < 0.05)，见图4、表2。

2.5 各组大鼠神经髓鞘表达水平 造模后第28天，劳克坚牢蓝染色结果显示，与假手术组相比，脑白质损伤组神经髓鞘表达减少约47.3%(P < 0.05)；与脑白质损伤组相比，人脐带间充质干细胞移植组神经髓鞘表达增加约56.4%(P < 0.05)，见图5、表3。

2.6 莫里斯水迷宫实验评估各组大鼠空间认知功能 造模后第28-33天，莫里斯水迷宫实验结果显示，与假手术组相比，脑白质损伤组在定向航行训练中逃避潜伏期明显延长，空间探索实验中穿越平台次数减少约69.2%(P < 0.05)；与脑白质损伤组相比，人脐带间充质干细胞移植组自训练第3天起逃避潜伏期缩短，且在空间探索阶段穿越平台次数增加约95.4%(P < 0.05)；各组间平均运动距离无统计学差异(P > 0.05)，见表4。

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引言

早产儿脑白质损伤主要发生于妊娠24-32周的早产儿[1]，可导致运动障碍、智力低下、学习困难及远期精神异常等典型神经发育缺陷。目前，临床对早产儿脑白质损伤的治疗仍以对症支持为主，如感染预防、呼吸及循环管理、营养支持等，但缺乏有效的针对性治疗，因此亟需探索新的早期干预策略以改善预后。少突胶质细胞是中枢神经系统中负责髓鞘化的关键细胞，起源于神经干细胞衍生的少突胶质前体细胞，经髓鞘形成前少突胶质细胞阶段，逐渐分化为成熟少突胶质细胞，并开始产生髓磷脂[2]。少突胶质细胞分化成熟的关键时期恰与早产儿脑白质损伤的易感高峰期重叠，对炎症和缺氧缺血极为敏感，是脑白质损伤病变的主要靶细胞[3]。研究表明，少突胶质细胞成熟停滞所致的髓鞘化障碍是早产儿脑白质损伤的核心病理特征[4]，通过调节少突胶质细胞谱系发育紊乱以促进白质修复，被认为是实现有效治疗的潜在切入点。
近年来，干细胞移植治疗脑损伤逐渐成为研究热点[5]。其中，人脐带间充质干细胞因具有优越的增殖、分化和免疫调节潜能，以及低免疫原性、取材便捷和无伦理争议等优势，成为理想的细胞移植来源。课题组前期研究发现，人脐带间充质干细胞可减少细胞凋亡、促进内源性神经干细胞增殖与分化，从而改善新生大鼠脑白质损伤模型的神经功能损伤[6]。进一步研究显示，人脐带间充质干细胞并非主要通过直接分化为成熟少突胶质细胞进行替代性补偿，而是依赖旁分泌机制释放神经营养因子和趋化分子(如脑源性神经营养因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子等)，以支持宿主少突胶质前体细胞的分化与髓鞘形成，从而改善髓鞘化障碍[7-8]。
在神经缺血模型中，人脐带间充质干细胞共培养可显著减少细胞凋亡并提升神经营养因子分泌[8]；在多发性硬化动物模型中，人脐带间充质干细胞来源外泌体通过调控Wnt/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路，促进少突胶质前体细胞向成熟少突胶质细胞分化并修复髓鞘损伤[9]。然而，人脐带间充质干细胞是否能通过调节少突胶质细胞谱系发育紊乱来缓解早产儿脑白质损伤相关的髓鞘化障碍，仍缺乏系统证据。鉴于此，该研究通过建立新生大鼠脑白质损伤模型，经侧脑室定向移植一定剂量人脐带间充质干细胞进行干预，综合评价人脐带间充质干细胞对白质病理学改变、少突胶质细胞谱系相关分子(通用少突胶质细胞标志物：少突胶质细胞系转录因子2；少突胶质前体细胞标志物：神经胶质抗原2；成熟少突胶质细胞标志物：髓鞘碱性蛋白)表达、髓鞘形成及空间认知能力的影响，这将有助于从细胞谱系发育、髓鞘重建到神经功能改善多个层面验证人脐带间充质干细胞的作用机制，以期为干细胞治疗早产儿脑白质损伤提供新的实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照性动物实验。实验方案设计见图1。

1.2 时间及地点 实验于2023年6月至2024年12月在新疆医科大学动物中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物和分组 选取72只SPF级2日龄Sprague-Dawley新生大鼠(雌雄不限)，购自新疆医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK (新)2018-0003。大鼠饲养于12 h光/暗交替的环境中，温度控制在24-25 ℃，相对湿度保持在40%-50%，自由摄食饮水。依据随机数字表法，将72只新生大鼠分为假手术组、脑白质损伤组和人脐带间充质干细胞移植组，每组24只。实验方案经新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会批准(IACUC-20200318-65)。
1.3.2 主要仪器 动物低氧实验系统(上海塔望智能科技有限公司)；脑立体定位仪(上海玉研仪器有限公司)；全自动数字玻片扫描系统(德国蔡司公司)。
1.3.3 主要试剂及细胞 人脐带间充质干细胞(CP-CL11，武汉普诺赛生命科技有限公司)；组织RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒(中国诺唯赞生物公司)；免疫组化试剂盒(批号2301059710，福州迈新生物技术开发有限公司)；劳克坚牢蓝染色试剂盒(上海歌凡生物科技有限公司)；少突胶质细胞系转录因子2和神经胶质抗原2一抗(中国华安生物有限公司)；髓鞘碱性蛋白一抗(Abcam，美国)；脂多糖(Sigma，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 脑白质损伤模型的建立和人脐带间充质干细胞移植
(1)制备脑白质损伤模型：参照Vannucci模型[10]、课题组前期研究[11-12]，采用小剂量脂多糖诱导炎症联合缺氧缺血方法建立新生大鼠脑白质损伤模型。Sprague-Dawley大鼠出生后第2天，脑白质损伤组和人脐带间充质干细胞移植组大鼠经腹腔注射脂多糖溶液(0.05 mg/kg)，假手术组注射等体积无菌PBS，24 h后在异氟烷麻醉下，脑白质损伤组及人脐带间充质干细胞移植组暴露左侧颈总动脉，结扎左侧颈总动脉近端和远端并切断，随后将大鼠置于恒温缺氧箱(37 ℃，气体成分：体积分数8% O₂+体积分数92% N₂)中缺氧2.5 h，之后返回母鼠笼继续饲养。假手术组仅行左侧颈总动脉分离，不予结扎和缺氧处理。
(2)人脐带间充质干细胞移植：取第3代人脐带间充质干细胞，依据课题组前期关于最佳移植剂量的研究成果[11]，采用无钙镁PBS(pH 7.2-7.4，含0.1% BSA与0.02% DNase I)重悬，将细胞浓度调整为2×105个/3 μL人脐带间充质干细胞悬液，移植前经40 μm滤网过滤并置冰上保存。移植前依据大鼠脑立体定位图谱设定侧脑室注射坐标[13]，并通过注射微量蓝黑墨水验证坐标准确性，以确定正式实验注射坐标：颅脑中缝与前囟交叉点后1.5 mm、左1.5 mm、深2 mm。造模后24 h内实施干预处理。其中，人脐带间充质干细胞移植组经侧脑室注射2×105个细胞/ 3 μL人脐带间充质干细胞悬液，假手术组和脑白质损伤组则注射等体积无菌PBS。移植操作在立体定位仪指导下进行，严格控制针入角度和深度，注射速度为1 μL/min，注射完成后针头停留2 min，以确保注射液准确进入侧脑室。
1.4.2 脑组织样本取材 造模后第14天，各组随机抽取12只新生大鼠，其中6只用于整脑取材制备脑组织玻片，通过苏木精-伊红染色观察各组大鼠脑白质病理改变、免疫组织化学染色检测少突胶质细胞系转录因子2、神经胶质抗原2、髓鞘碱性蛋白阳性表达，另6只用于区域组织取材提取总蛋白和RNA，通过蛋白免疫印迹实验和实时荧光定量聚合酶链式反应法检测少突胶质细胞系转录因子2、神经胶质抗原2、髓鞘碱性蛋白的蛋白及mRNA表达水平；造模后第28天，各组随机抽取6只新生大鼠，进行整脑取材制备脑组织切片，通过劳克坚牢蓝染色观察神经髓鞘形成情况。
(1)整脑取材：大鼠经异氟烷诱导麻醉后，开胸暴露心脏。经左心室灌注生理盐水及40 g/L多聚甲醛(各约5 mL至肝脏变白或大鼠抽搐僵硬)固定，迅速断头取脑，剥离全脑组织并置于40 g/L多聚甲醛中后固定48-72 h，固定后组织依次经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，用于后续制备4 μm厚度脑组织玻片。
(2)区域组织取材：大鼠经异氟烷麻醉后，迅速断头取脑。于冰盘上快速剥离头骨，留取侧脑室周围脑组织，置于预冷的微量离心管中，然后转移至-80 ℃冰箱保存备用。
1.4.3 苏木精-伊红染色 各组脑组织切片经脱蜡和梯度水化后，于苏木精溶液中染色3 min，经自来水返蓝30 min，再用伊红溶液复染1 min，随后行梯度脱水并以中性树胶封固。光学显微镜下观察并采集图像，结合细胞形态、核质比、炎性细胞浸润及组织结构完整性等病理学指标进行分析，以评价脑白质损伤情况并验证模型是否成功建立。
1.4.4 免疫组织化学染色 各组脑组织切片经脱蜡和梯度水化后，采用柠檬酸钠缓冲液进行热修复，待自然冷却至室温后，严格按照试剂盒说明操作，依次滴加内源性过氧化物酶阻断液、非特异性阻断液，室温下各孵育30 min，随后滴加经抗体稀释液稀释的一抗：少突胶质细胞系转录因子2(1∶2 000)、神经胶质抗原2(1∶2 000)、髓鞘碱性蛋白(1∶5 000)，置于4 ℃湿盒中过夜孵育(12-16 h)。次日，PBS冲洗后依次滴加生物素化羊抗兔IgG聚合物、链霉亲和素-过氧化物酶复合物，室温下各孵育30 min。3，3′-二氨基联苯胺显色，苏木精复染细胞核，经梯度脱水、透明处理后封固。光镜下观察并采集图像，利用Image J软件测定各指标平均吸光度值。
1.4.5 蛋白免疫印迹实验 各组取30 mg侧脑室周围脑组织样品，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行匀浆裂解。采用BCA法进行蛋白定量，浓度均一化处理后加入5×Loading buffer上样缓冲液，100 ℃金属浴变性10 min。等量取样后经12.5% SDS-PAGE(150 V，60 min)分离蛋白，转膜至聚偏二氟乙烯膜上(100 V，60 min)，5%脱脂奶粉封闭2 h后，4 ℃下孵育一抗过夜[少突胶质细胞系转录因子2(1∶2 000)、神经胶质抗原2(1∶2 000)、髓鞘碱性蛋白(1∶1 000)，内参β-actin(1∶1 000)]，经TBST洗膜3次后，室温下孵育HRP标记二抗(1∶10 000)2 h。通过ECL化学发光法显影，利用Image J软件分析条带灰度值，以β-actin作为内参进行定量标准化。
1.4.6 实时荧光定量聚合酶链式反应法 各组取30 mg侧脑室周围脑组织样品，TRIzol法提取总RNA，并按试剂盒说明书进行反转录和扩增反应(体系体积20 μL)。反转录程序：42 ℃孵育15 min合成互补脱氧核糖核酸；85 ℃加热5 s灭活反转录酶，4 ℃终止反应。扩增程序：94 ℃预变性 30 s，94 ℃变性5 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸 10 s，循环40次。引物序列：少突胶质细胞系转录因子2上游：5’-AAA GGT GTG GAT GCT TAA CAG AGA C-3’，下游：5’-CCG GAG ACG ATC TAG GCT TTC-3’；神经胶质抗原2上游：5’-GCC AAC TCA CCT ACC ACA CC-3’，下游：5’-CTT GCT GCT GGT GTT GTC TT-3’；髓鞘碱性蛋白上游：5’-CCG CCT CAG AAG ACA GTG ATG TG-3’，下游：5’-TTT GGG TCT GCT GTG TGC TTG G-3’；β-actin上游：5’-CCT CTA ATG ACA ATC CGA GGA T-3’，下游：5’-CTG AGT AGC ATG AGG ACG AAC GAC-3’；引物由上海生工生物工程股份有限公司生产提供。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。
1.4.7 劳克坚牢蓝染色 各组脑组织玻片进行脱蜡、水化、醇化，配制劳克坚牢蓝染色液(取45 mL去离子水+5 mL冰醋酸配成10%冰醋酸溶液，每100 mL 劳克坚牢蓝染色液中加入0.5 mL 10%冰醋酸)，然后将切片在60 ℃预热的劳克坚牢蓝染色液中孵育4 h，孵育结束后取出切片在乙醇及碳酸锂溶液中浸泡染色，根据显色情况终止操作，经梯度脱水、透明处理后封固。光镜下观察并采集图像，利用Image J软件测定平均吸光度值。
1.4.8 莫里斯水迷宫实验 造模后第28天进行莫里斯水迷宫实验(每组6只)。实验前5 d进行定位航行训练，每天固定时间将大鼠依次从水池4个象限放入水中，记录大鼠找到平台所需时间作为逃逸潜伏期。大鼠找到平台后停留5 s计时完成，若60 s内未找到平台，则引导至平台停留10 s，逃逸潜伏期记为60 s。第6天进行空间探索实验，撤去平台，让大鼠从原平台对角位置落水，自由游泳60 s，使用跟踪软件记录穿越平台次数及总游泳距离。
1.5 主要观察指标 ①各组大鼠脑白质病理改变；②各组大鼠脑内少突胶质细胞系转录因子2、神经胶质抗原2和髓鞘碱性蛋白表达水平；③各组大鼠神经髓鞘形成情况和空间学习记忆能力。
1.6 统计学分析 使用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0进行数据统计和图表绘制。计量数据以x±s表示。多组比较时，若方差齐采用单因素方差分析，并进行Tukey事后检验；若方差不齐则采用Brown-Forsythe方差分析，并进行Dunnett-t事后检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过新疆医科大学生物统计学专家审核。

讨论

流行病学研究显示，约50%胎龄< 28周的极早产儿存在不同程度的脑白质损伤[3]。早产儿脑白质损伤的高发时段多集中在妊娠24-32周，极易受到炎症及缺氧缺血等因素的影响，导致少突胶质前体细胞分化受阻，继而引发髓鞘化障碍或脱髓鞘[14]。目前临床针对早产儿脑白质损伤的有效治疗手段仍极为有限，亟需开发有效干预策略以改善早产儿神经发育结局和生活质量[15]。既往研究证实，出生后2-4 d大鼠的大脑发育程度与妊娠24-32周的早产儿相近[16-18]，二者在代谢易损性及病理演变方面具有高度相似性[19]。基于此，该研究通过对2日龄新生大鼠进行炎症及缺氧缺血刺激，成功建立脑白质损伤模型。苏木精-伊红染色显示，脑白质损伤组白质结构明显破坏，细胞水肿、核固缩及坏死显著，神经纤维排列紊乱疏松。此外，分子生物学分析结果显示，少突胶质前体细胞异常聚集但成熟少突胶质细胞密度下降，神经髓鞘形成减少并伴随认知功能障碍，这进一步验证了模型的可靠性，更为后续干预研究提供了可量化的评价体系。
少突胶质细胞谱系的成熟受阻是早产儿脑白质损伤的核心病理特征[20]。在大脑发育过程中，为确保髓鞘在正确的时间和位置形成，少突胶质细胞谱系的转化与成熟受到细胞内外多种因素精密调控，包括特定基因的时序性表达、细胞微环境中的信号分子以及神经营养因子的动态变化等[21-22]。该研究在少突胶质细胞谱系分析中发现，脑白质损伤组神经胶质抗原2表达升高，而髓鞘碱性蛋白表达下降，少突胶质细胞系转录因子2表达无显著差异，提示成熟少突胶质细胞减少主要源于少突胶质前体细胞向成熟少突胶质细胞分化阻滞，而非谱系总量缺失。这一发现与临床病理模型高度吻合[23]，即脑白质损伤多呈现大量少突胶质前体细胞积聚、但成熟少突胶质细胞严重缺乏的特征性改变。DUFOUR等[24]研究也进一步揭示，在缺氧/炎症微环境的刺激下，髓鞘形成前少突胶质细胞因线粒体功能障碍和代谢失衡发生选择性凋亡，尽管少突胶质前体细胞池可通过代偿性增殖机制出现短暂扩张，但其向成熟少突胶质细胞分化的能力受到多种病理因素的持续抑制，最终导致髓鞘形成障碍和神经功能损害。该研究认知功能检测亦支持这一结论，脑白质损伤组莫里斯水迷宫实验逃避潜伏期延长、平台穿越次数减少，而各组大鼠平均运动距离无显著差异，提示空间学习与记忆能力受损并非由运动障碍引起，而主要归因于髓鞘缺失所致的神经传导障碍。这与临床观察相一致，即早产儿髓鞘化延迟与长期认知及行为障碍密切相关[25-26]。
近年来，人脐带间充质干细胞对神经系统疾病尤其是脑损伤的保护作用已有报道[27]。然而，人脐带间充质干细胞确切的神经保护机制尚不清楚。ZHU等[28]报道人脐带间充质干细胞可以通过调节胶质细胞功能和改善远期行为结局来促进脑恢复。该研究干预实验显示，人脐带间充质干细胞可显著降低神经胶质抗原2表达、恢复髓鞘碱性蛋白水平，而少突胶质细胞系转录因子2变化不显著，提示人脐带间充质干细胞促进髓鞘形成主要通过解除少突胶质前体细胞分化阻滞而非增加细胞总量。已有研究显示，少突胶质前体细胞分化阻滞通常与Notch/Wnt信号通路异常激活、炎症递质过度表达(如白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α)及神经活动缺失相关[29-30]，而人脐带间充质干细胞通过旁分泌外泌体(如miR-26a-5p抑制Notch信号通路)解除分化阻滞，促进少突胶质前体细胞向成熟少突胶质细胞转化[31-32]。这些结果提示，干预策略应聚焦于调控神经免疫微环境和促进分化，而非单纯增加少突胶质细胞数量。此外，该研究还发现人脐带间充质干细胞干预可促进神经髓鞘表达，同时伴随认知功能恢复，表明人脐带间充质干细胞可通过促进髓鞘再生间接修复神经网络功能。先前的动物研究也支持这一观点，TAPIA-BUSTOS等[33]在新生鼠全身缺氧模型中发现，间充质干细胞移植治疗可显著提高成熟少突胶质细胞存活率和髓鞘化。另一研究报道，人脐带间充质干细胞在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型中，通过调节星形胶质细胞功能、减少脑内炎症反应、增强神经元的可塑性再生，从而促进脑功能恢复[34]。这些结果进一步验证了髓鞘修复在认知功能恢复中的核心作用。
综上，人脐带间充质干细胞能够通过促进脑白质损伤新生大鼠少突胶质细胞谱系发育成熟，修复髓鞘化障碍并改善认知功能异常，从而实现神经修复作用。然而，该研究未对人脐带间充质干细胞的体内存活率及存活时间进行追踪，这在一定程度上限制了对人脐带间充质干细胞作用机制的深入理解。后续研究可采用荧光标记或生物发光成像等追踪技术，进一步评估移植细胞在脑内的动态分布及存活情况，这将为临床制定治疗方案提供关键依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

移植人脐带间充质干细胞修复新生大鼠脑白质损伤髓鞘化障碍

Transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells to repair myelination disorders in neonatal rats with white matter injury

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