肝硬化部分切除后肝再生及结构变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.53.016

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (53): 9196-9202.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.53.016

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肝硬化部分切除后肝再生及结构变化

郑晓筠，罗倩欣，陈倩琪，熊喜峰，刘玉荣，马宁芳

广州医科大学基础学院组织学与胚胎学教研室，广东省广州市 510182

修回日期:2013-09-19 出版日期:2013-12-31 发布日期:2013-12-31
通讯作者: 马宁芳，博士，教授，广州医科大学基础学院组织学与胚胎学教研室，广东省广州市 510182 nfma@gzhmc.edu.cn
作者简介:郑晓筠，女，1990年生，广东省东莞市人，广州医科大学临床学院在读学士，主要从事肝硬化方面的研究。 383271008@qq.com
基金资助:
广东省2011年大学生创新实验项目(2011)*

Regeneration and structural changes of mouse cirrhotic liver after partial hepatectomy

Zheng Xiao-jun, Luo Qian-xin, Chen Qian-qi, Xiong Xi-feng, Liu Yu-rong, Ma Ning-fang

Department of Histology and Embryology, School of Basic Sciences, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182,Guangdong Province, China

Revised:2013-09-19 Online:2013-12-31 Published:2013-12-31
Contact: Ma Ning-fang, M.D., Professor, Department of Histology and Embryology, School of Basic Sciences, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China nfma@gzhmc.edu.cn
About author:Zheng Xiao-jun, Department of Histology and Embryology, School of Basic Sciences, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China 383271008@qq.com
Supported by:
the College Students’ Innovative Experimental Projects of Guangdong Province (2011)*

摘要/Abstract

摘要：

背景：肝脏自身具有强大的再生能力，临床资料显示大部分肝癌患者合并有肝硬化，切除肿瘤后肝脏质量可逐渐恢复，提示硬化的肝脏仍具备修复潜能。

目的：尝试用肝部分切除方法诱导小鼠硬化肝组织内具再生能力的细胞增殖，观察再生肝脏的结构变化。

方法：使用CCl₄皮下注射方法制备小鼠肝硬化模型。对肝硬化小鼠行肝部分切除，于切除后1，3，5，7，10，14及21 d取小鼠肝组织并称质量。观察比较肝部分切除后不同时间小鼠再生肝组织的结构变化；评估肝再生率；免疫组化方法分析肝星形细胞标志分子结蛋白及肝星形细胞活化标志分子α-平滑肌肌动蛋白的表达变化；5-溴脱氧尿核苷标记技术对增殖细胞进行定性、定位。

结果与结论：肝硬化小鼠肝部分切除后第1，3，5，7，14，21天肝再生率分别为6.58%，22.03%，21.39%，29.05%，45.22%，50.98%。苏木精-伊红染色和Masson染色显示CCl₄注射8周后呈早期肝硬化病理改变，肝部分切除后肝组织结构逐步改善。免疫组化结果显示肝部分切除后第1天再生肝组织内结蛋白表达减少，但第3天至第14天呈上升趋势，21 d则明显减少；肝再生过程中各时间点α-平滑肌肌动蛋白表达依时递减。5-溴脱氧尿核苷阳性细胞在肝部分切除后1-7 d主要为肝细胞，肝部分切除后14-21 d阳性细胞定位于肝血窦内皮及窦腔内。结果表明早期肝硬化小鼠大部肝切除后3 d出现明显的再生反应，并逐步恢复正常的肝组织结构。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 器官移植, 器官移植基础实验, 肝硬化, 四氯化碳, 小鼠, Masson染色, 肝部分切除, 肝再生, 结蛋白, α-平滑肌肌动蛋白, 5-溴脱氧尿核苷, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Liver possesses a powerful regenerative capacity. It is reported that the most patients suffering from hepatocelluler carcinoma are accompanied with liver cirrhosis. The liver weight can be gradually restored after tumor resection, which indicated a regenerative potential of cirrhosis liver.

OBJECTIVE:To try to use partial hepatectomy to induce proliferation of cells with regeneration capacity in cirrhotic liver of mice, and to observe the structural changes of regenerated liver.

METHODS: The liver cirrhosis model of mouse was produced by injecting CCl₄ liquid subcutaneously. The mice with liver cirrhosis were subjected to partial hepatectomy. The residual liver was dissected and weighted at 1, 3, 5, 7, 10, 14 and 21 days after partial hepatectomy. The structural changes of regenerating livers were compared after partial hepatectomy at various time points. Liver regeneration rate was evaluated. Immunohistochemical method was used to analyze desmin and alpha-smooth muscle actin expression in the hepatic satellite cells. The 5-bromo-2-deoxyuridine incorporation labeling method was used to exhibit and localize the regenerating cells.

RESULTS AND CONCLUSION:The liver regeneration rates of the mice with liver cirrhosis at the 1, 3, 5, 7, 14, 21 days after the partial hepatectomy were 6.58%, 22.03%, 21.39%, 29.05%, 45.22%, and 50.98% respectively. The results of hematoxylin-eosin staining as well as Masson staining showed the pathological early cirrhosis features of the liver after CCl₄ treatment for 8 weeks and the structure of residual livers improved gradually after partial hepatectomy. Immunohistochemical results demonstrated that the expression of desmin in regenerating liver was decreased at 1 day after partial hepatectomy, but showed an uptrend from 3 to 14 days and decreased at 21 days. The expression of alpha-smooth muscle actin decreased gradually at every time point after partialhepatectomy. The 5-bromo-2- deoxyuridine-positive nucleus localized in hepatocytes at 1-7 days and mainly localized in hepatic sinusoid endothelium and intracavity at 14-21 days after partial hepatectomy. The regenerative reaction of mouse cirrhotic liver appeared at 3 days after partial hepatectomy and the structure of normal regenerating liver will be improved and restored gradually.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: liver cirrhosis, partial hepatectomy, liver regeneration, desmin, actins

中图分类号:

R318

郑晓筠，罗倩欣，陈倩琪，熊喜峰，刘玉荣，马宁芳. 肝硬化部分切除后肝再生及结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(53): 9196-9202.

Zheng Xiao-jun, Luo Qian-xin, Chen Qian-qi, Xiong Xi-feng, Liu Yu-rong, Ma Ning-fang. Regeneration and structural changes of mouse cirrhotic liver after partial hepatectomy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(53): 9196-9202.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 实验共选用雄性小鼠60只制作肝硬化模型，其中11只在造模过程中死亡，存活 49只，选取5只小鼠用于组织病理学鉴定，证明造模成功率为82%。剩余的44只早期肝硬化小鼠进一步实施肝大部切除，死亡4只，术后存活率88%。肝切除后第1，3天分别取5只小鼠，其余时间点各取6只小鼠进行指标观察。
2.2 肝部分切除后的肝再生率 肝硬化小鼠肝部分切除后第3天肝质量明显回升，见图1。

肝部分切除后第1，3，5，7，10，14，21天肝再生率分别为6.58%，22.03%，21.39%，29.05%，45.22%，50.98%，见图2。

2.3 肝部分切除前后肝组织的结构变化 见图3，4。

苏木精-伊红染色结果显示，CCl₄皮下注射8周后小鼠肝小叶结构破坏，肝细胞有空泡样变及脂肪变，Massson染色显示肝小叶间胶原纤维增生并伸入肝小叶内形成间隔，与周围增生的纤维间隔互相连接、包绕分割原来的肝小叶形成假小叶，呈现出早期肝硬化改变。对肝硬化小鼠实施肝部分切除后第1-5天肝组织结构与造模前肝织相比结构无明显变化；肝部分切除后第7天再生肝组织结构出现改善，随术后时间推移肝细胞脂肪变现象逐渐减少，肝小叶间增生的胶原纤维减少或消失，至肝部分切除后21 d肝小叶结构基本恢复正常。

与硬化肝相比差异均有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)；肝部分切除后各时间点α-平滑肌肌动蛋白表达比切除前明显减少，肝再生过程中α-平滑肌肌动蛋白表达依时递减，与硬化肝相比肝部分切除后14 d及21 d的α-平滑肌肌动蛋白表达差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2012年1至12月在广州医科大学基础学院组织学与胚胎学教研室完成。

材料：

实验动物：健康成年昆明雄鼠60只，体质量28-35 g，清洁级，由广东省南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK粤2011。

实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

小鼠肝硬化部分切除后肝再生及其结构变化实验的主要试剂及仪器：

方法：

肝硬化小鼠的肝再生模型制作及取材：将CCl₄与食用粟米油以1∶1比例混合备用。健康雄性昆明小鼠(n=60)皮下注射CCl₄-粟米油混合液(6 mL/kg)，2次/周，共8周。随机选取5只小鼠，取肝组织制作切片，常规苏木精-伊红染色，根据临床肝纤维化诊断分期标准，进行肝组织病理学鉴定^[7-8]。出现肝实质广泛性破坏、肝内纤维增生、假小叶形成为早期肝硬化判断依据，进一步对肝硬化小鼠实施肝部分切除。以10 g/L戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉肝硬化小鼠，按Higgins等^[9]经典方法进行肝部分切除动物模型改良，切除小鼠肝脏左叶、右叶，保留中叶及胆囊、尾叶。在剑突下取正中切口，轻轻挤出肝脏左叶于肝蒂部结扎后切除，然后从剑突右下方轻轻挤出右叶和后叶，并把右叶和尾叶一起结扎切除。秤取并记录切除的肝左叶、右叶及尾叶质量(被切除的各叶质量约占原肝质量的60%)，关闭腹腔。于肝部分切除后1，3，5，7，14，21 d腹膜下注射5-溴脱氧尿核苷50 mg/kg，2 h后取小鼠残余肝组织并秤质量，将各时间点所取的肝组织置于体积分数4%甲醛溶液中固定，常规方法制做肝石蜡切片备用，另一部分置液氮冻存，提取蛋白备用。

肝再生率计算方法^[10]：

根据造模前、造模后小鼠肝质量计算肝再生率，小鼠总肝质量按5.5%体质量计算。

肝组织病理学检测：切片行常规苏木精-伊红染色、Masson 染色，光学显微镜下观察肝组织结构变化。

结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白定性及定量检测、5-溴脱氧尿核苷显色：用免疫组织化学方法对结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白进行定性检测，5-溴脱氧尿核苷免疫组织化学方法显示5-溴脱氧尿核苷阳性标记细胞。肝组织切片经熔蜡、水化、枸橼酸缓冲液抗原修复(5-溴脱氧尿核苷免疫组织化学染色切片需用4 mol/L HCl预处理)、30 g/L 过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶10 min后滴加体积分数10%山羊血清封闭30 min，一抗 4 ℃冰箱过夜，PBS 冲洗后依次加二抗孵育1 h，DAB显色，苏木精复染、脱水、中性树胶封固，显微镜下观察。常规Western Blot方法定量检测结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白表达。

主要观察指标：肝再生率；肝组织病理学改变；肝星形细胞标志分子结蛋白及其活化分子α-平滑肌肌动蛋白的定性、定量表达；5-溴脱氧尿核苷标记。

统计学分析：由本文作者使用SPSS 10.0软件对数据进行统计学处理。不同时间点肝再生率比较采用配对t 检验，以P < 0.05表示对比组之间差异有显著性意义。

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讨论

生理状态下肝为相对静止的器官，但在肝叶切除或其他原因所致的肝细胞缺失后，残余的肝实质细胞(成熟的肝细胞)及非实质细胞(包括胆管上皮细胞、肝血窦内皮细胞、枯否细胞及Ito细胞)将先后进入增殖状态以补充肝细胞数量、代偿肝脏功能^[11-12]。文献报道正常小鼠肝部分切除后30 min 内便有早期反应基因的表达，同时伴有转录因子STAT3、活性核因子κB的高表达，细胞的DNA合成加速，从部分肝切除到肝细胞DNA合成的启动只需10-12 h，合成高峰在术后24 h。肝大部切除后,残余的肝细胞平均历经3/2(约1.67)个增殖周期以完成肝的再生，整个过程持续 5-7 d^[13-17]。通常肝再生研究多采用Higgins等^[9]的大鼠肝大部切除模型，即切除肝左叶及中叶(占总肝质量的60%-70%)，保留肝右叶及尾叶，近来也有许多研究将Higgins的肝大部切除模型用于小鼠肝再生研究^[12-14]。考虑到小鼠与大鼠胆道结构的差异，文章依照课题组改良后的肝大部切除方法，保留小鼠贴近胆囊的中叶以保证胆汁的正常流通，获得较为理想的手术成活率^[18]。肝质量/体质量比、肝再生率等指标是评估肝再生状况的常用指标，尤其是肝再生率排除了肝再生过程中体质量变化的影响，能比较准确的反映肝再生情况。本实验综合观察此2项指标，结果显示其变化趋势基本一致。已有的研究证实正常小鼠在实施肝脏部分切除后，肝脏可在7-10 d恢复原有的质量，完成再生过程^[19-20]，本实验中肝硬化小鼠部分切除后肝再生率及肝质量/体质量比值变化相对缓慢，至术后21 d肝脏回复至原肝质量的50%以上，说明与正常小鼠相比，早期肝硬化部分切除可促进肝质量逐步恢复，尽管其再生的启动及速度均有延后。

肝星形细胞的激活及增殖是肝纤维化发生过程中的中心环节，一些因素如毒素类、病毒、氧化应激、坏死、细胞凋亡和生长因子均可诱导静止状态的肝星形细胞激活分化为肌成纤维样细胞，此外，肝血管周围成纤维细胞也可分化形成肌成纤维样细胞。活化后的肝星形细胞(即肌成纤维样细胞)的表型特点为高增殖及迁移能力，表达α-平滑肌肌动蛋白及各种细胞外信号转导通路蛋白，并产生大量以胶原为主的细胞外基质成分和细胞因子，导致肝组织微环境及结构的变化^[21-22]。近年陆续有研究报道肝内胆管上皮细胞也参与肝星形细胞的活化和细胞外基质的生成，即肝内胆管上皮细胞同样与肝纤维化过程相关，提示病理状态下肝组织结构的异常变化是多细胞参与的一个复杂的过程，其最根本的原因是病理环境下各相关细胞的激活及分化^[23]。本实验肝硬化模型组织病理学检测结果表明CCl₄处理8周后小鼠肝实质内将出现明显的肝组织坏死、小叶间纤维组织增生及典型的假小叶，达到早期肝硬化分期标准^[24-25]，提示早期肝硬化模型建立成功。传统的观点认为肝硬化为肝脏的不可逆病变，本实验对肝硬化小鼠实施肝部分切除后发现随术后再生时间的延长，原有的肝硬化病理结构、肝脂肪变及空泡样变、纤维增生等现象明显减弱甚至消失，至肝部分切除后21 d肝脏结构趋于正常，说明早期肝硬化组织病理改变可通过肝部分切除得以纠正，但其前提是有效控制肝硬变的诱因如化学损伤、病毒感染等。

结蛋白是肝星形细胞的标志分子，当肝星形细胞向肌成纤维样细胞转化后则表达α-平滑肌肌动蛋白，故α-平滑肌肌动蛋白阳性表达可做为肝星形细胞激活的标志^[26-29]。

本实验发现肝脏术后再生修复过程中结蛋白表达量依时递增，肝部分切除后14 d达峰值，至肝部分切除后21 d结蛋白表达量降低，提示肝星形细胞的增殖在肝部分切除后早期较活跃，肝硬化术后所启动的再生微环境中增殖的肝星形细胞可能参与了肝组织的重建。正常情况下肝脏α-平滑肌肌动蛋白仅表达于血管壁平滑肌细胞及活化的肝星形细胞^[30-32]，本实验中早期肝硬化部分切除后α-平滑肌肌动蛋白阳性表达与结蛋白阳性细胞增殖并不同步，随着术后肝修复时间的延长α-平滑肌肌动蛋白表达则逐渐减少，其可能的原因是：①该再生环境可刺激肝星形细胞的增殖但抑制其活化。②增殖的肝星形细胞向肝实质细胞或其他细胞方向分化。既往对肝星形细胞的研究主要关注于其在肝纤维化进程中的作用，认为在损伤因子刺激下活化的肝星形细胞是肝纤维化发展的核心环节。近来不断有证据证实肝星形细胞具有促进肝组织再生的作用，研究发现肝星形细胞活化受限的小鼠在肝损模型中随损伤持续加重，肝组织修复明显受限^[32]；另有报道在胚胎干细胞诱导分化为肝细胞体系中，将胚胎干细胞与永生化肝星形细胞等肝间质细胞共培养，诱导分化效率明显提高^[33-34]，提示肝星形细胞的功能状态与肝细胞的分化成熟及功能活性密切相关，肝星形细胞可能参与肝细胞的分化和成熟，上述观点与本文结果吻合，具体机制仍需深入探讨。

5-溴脱氧尿核苷可代替胸腺嘧啶在DNA合成期选择性的掺入到处于细胞周期S期的细胞单链DNA核苷酸序列中，做为DNA前体胸腺嘧啶核苷的类似物，5-溴脱氧尿核苷能准确反映细胞的增殖状态，对研究细胞动力学有重要意义^[35]。

正常小鼠肝大部切除后1 d即出现5-溴脱氧尿核苷阳性标记细胞^[18]，本实验采用5-溴脱氧尿核苷标记技术定性观察肝内再生细胞，结果发现术后5 d肝内逐渐出现5-溴脱氧尿核苷阳性标记细胞，表明早期肝硬化部分切除同样能启动再生反应但其再生反应的启动较正常小鼠慢。结合肝组织结构特征及5-溴脱氧尿核苷阳性标记细胞的定位进行判断，肝部分切除后第1周各时间点内的5-溴脱氧尿核苷阳性反应主要定位于肝细胞，而肝部分切除后14-21 d 5-溴脱氧尿核苷阳性细胞主要为血窦内皮细胞、肝星形细胞及肝血窦腔内的血细胞。本实验未对各5-溴脱氧尿核苷阳性细胞进一步分型，但根据组织学形态及位置判定，肝硬化肝部分切除后肝实质细胞最先启动增殖反应，其后则通过肝非实质细胞的增殖来补充和完成肝组织的再生。

实验结果表明早期肝硬化部分切除可明显改善甚至逆转硬化肝的组织结构，然而肝硬化部分切除后肝内有效增殖细胞数的相对减少及肝再生反应滞后等因素，是临床上不可忽视的重要环节，在实际应用中应根据肝功能代偿能力等指标进行科学评估。肝硬化早期进行手术治疗，结合保肝护肝药物，将有望延缓或阻断肝硬化进程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
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Regeneration and structural changes of mouse cirrhotic liver after partial hepatectomy

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