异体皮质人工骨复合物治疗骨折不愈合及骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.51.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：异体皮质干燥异体骨为多孔状结构，孔均匀且相互贯通，孔径200 µm 左右，在形态结构上与人类无机骨极为相似。
目的：观察应用骨形态发生蛋白-骨髓间充质干细胞-异体皮质人工骨复合物治疗骨折不愈合及骨缺损的临床效果。
方法：选择33例创伤性骨缺损患者，其中男19例，女14例；年龄26-85岁。首先提取患者自体骨髓间充质干细胞，进一步以异体皮质人工骨为支架材料，同时导入骨形态发生蛋白和骨髓间充质干细胞，通过人工合成方式制成骨形态发生蛋白-骨髓间充质干细胞-异体皮质人工骨复合物，植入骨缺损处，每例植入人工骨复合物20-45 g。
结果与结论：随访6个月-2.5年，根据Mankin及Komender等对同种异体骨移植结果的评分标准，满意32例，不满意1例。复查X射线片示32例达骨性愈合，其中新鲜骨折愈合时间2-7个月，陈旧性骨折愈合时间4-9个月。同种异体松质骨6-9周开始与自体骨融合爬行替代。1例感染性骨缺损移植后迟发性感染，去除内固定及同种异体骨，置管冲洗、局部稳定后再次植骨愈合，随访2年1个月骨感染未复发；1例钢板松动致骨折未愈合，再次行内固定、自体骨移植后骨折愈合。表明应用骨形态发生蛋白-骨髓间充质干细胞-异体皮质人工骨复合物治疗骨折不愈合及骨缺损无明显不良反应，修复效果良好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 异体人工骨, 骨髓间充质干细胞, 骨形态发生蛋白, 移植, 骨缺损, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Dried allogeneic cortical bone has a porous structure, with uniform and interconnected holes at an aperture of about 200 μm, and the morphological structure is very similar to human bone.
OBJECTIVE: To study the clinical effects of the compound graft of allogeneic cortical bone, bone marrow mesenchymal stem cells and bone morphogenetic protein in the treatment of fracture nonunion and traumatic bone defects.
METHODS: Thirty-three patients with traumatic bone defects were enrolled, including 19 males and 14 females, aged 26-85 years. First, autologous bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured. Then allogeneic cortical bone as scaffold material was implanted with bone marrow mesenchymal stem cells and bone morphogenetic protein to synthesize allogeneic cortical bone complex that was grafted into bone defects (20-45 g per case).
RESULTS AND CONCLUSION: All the patients were followed up for 6 months to 2.5 years. According to the Mankin and Komender standard evaluation of allogeneic bone transplantation, there were 32 cases with satisfaction and one case with dissatisfaction. The X-ray films at reexamination showed that 32 patients had bone healing, with fresh fracture healing time of 2-7 months and old fracture healing time of 4-9 months. The allogeneic cortical bone complex began to be fused with autologous bone through creeping substitution 6-9 weeks after transplantation. One case, which had delayed infection, had bone union by removing internal fixation, placing irrigating tube and grafting after local stability. During the follow-up of 25 months, no relapse was found. Another case had nonunion because of plate loosening, and received secondary internal fixation and autogenous bone graft. The allogeneic cortical bone complex exhibits no evident side effects and is effective in the treatment of fracture nonunion and traumatic bone defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, tissue engineering, stem cells, bone morphogenetic proteins

中图分类号:

R318

王斌，吕浩然，王伟雄，李燊. 异体皮质人工骨复合物治疗骨折不愈合及骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(51): 8821-8826.

Wang Bin, Lü Hao-ran, Wang Wei-xiong, Li Sheng. Allogeneic cortical bone complex for fracture nonunion and bone defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(51): 8821-8826.

图/表（结果） 3

2.1 参与者数量分析 按意向性分析处理，33例患者均进入结果分析。

2.2 随访时间 本组患者均获随访，随访时间6个月- 2.5年，平均1.1年。

2.3 同种异体骨移植结果及不良反应 本组满意32例；不满意1例。32例切口均Ⅰ期愈合，未发生与植入物相关的不良反应。切口换药未见明显异常，10-14 d拆线。有1例患者于术后4 d出现发热，体温最高为 38.6 ℃，给予对症处理无特殊。

复查X射线片示32例达骨性愈合，其中新鲜骨折愈合时间2-6个月，平均4个月；陈旧性骨折愈合时间3-10个月，平均7.3个月。骨形态发生蛋白-骨髓间充质干细胞-异体皮质人工骨复合物6-9周开始与自体骨融合爬行替代。

感染性骨缺损移植后迟发性感染1例，去除内固定及骨形态发生蛋白-骨髓间充质干细胞-异体皮质人工骨复合物，置管冲洗、局部稳定后再次植骨愈合，随访1.1年骨感染未复发。

2.4 典型病例

病例1：63岁男性患者，因“摔伤致右肩部肿痛，活动受限1 d”入院，入院查体：右肱骨近端肿胀，压痛阳性，活动受限，行右肩关节正斜位片示：右肱骨外科颈粉碎性骨折，肱骨头粉碎，关节面塌陷，骨缺损2 cm× 3 cm×3 cm。

诊断为“右肱骨外科颈骨折”。经骨折线植入骨形态发生蛋白-骨髓间充质干细胞-异体皮质人工骨复合物约40 g，直视下复位见其对位对线良好，取肱骨近端解刨锁定钢板牢靠固定。术后3 d复查X射线片见骨折对位对线良好，钢板固定牢靠，螺钉长短合适。出院后定期门诊拍片复查。术后半年复查时可见肩关节活动正常，拍片可见骨折骨性愈合，见图1-3。

病例2：75岁女性患者，因“摔伤致左髋部肿痛，活动受限半天”入院，入院查体：左髋部肿痛，活动受限，左下肢外旋短缩畸形。行左髋关节正侧位片显示左股骨转子间骨折(Evans分型：1型1度)^[9]，诊断为“右股骨转子间骨折”，考虑到患者高龄，合并有骨折疏松症，有骨折延迟愈合甚至骨不连可能，遂术中给予经动力髋螺钉近端主钉钉孔注入骨形态发生蛋白-骨髓间充质干细胞-异体皮质人工骨复合物约15 g。术后复查X射线片显示骨折对位对线良好，内固定牢靠；术后3 d指导患者行股四头肌收缩活动及踝关节、膝关节屈伸活动，术后6周下地扶拐站立，术后8周行阶段性负重锻炼，术后12周复查X射线片见骨折愈合良好，骨折线消失，骨痂包裹骨折断端并有连续骨小梁经过骨折线处，见图4，5。

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引言

材料方法

设计：回顾性病例分析。

时间及地点：于2011年6月至2013年3月在广州医科大学附属第二医院完成。

对象：

病例纳入标准：严重粉碎性骨折及手术治疗后出现骨不愈合需2次手术的病例作为此次研究对象，所有病例均在伤后2周内并确定无感染情况下进行手术；对于骨干部粉碎性骨折选择交锁髓内钉固定，关节内粉碎性骨折采用解剖型锁定钢板固定，开放性粉碎性骨折采用单臂外固定架固定^[5]。对于开放性骨折伴软组织感染及全身多发脏器功能损伤、感染所致骨不连等病例则排出此次研究范围。

一般资料：本组纳入患者33例，其中男19例，女14例，无合并损伤；年龄26-85岁，平均56.8岁。车祸伤16例，坠落伤6例，摔伤11例；其中内固定失败骨不愈合10例，严重粉碎性骨折13例，开放性骨折或感染性骨缺损5例，陈旧性骨折需矫形植骨5例；肱骨外科颈和肱骨干骨折5例，肱骨髁上髁间粉碎性骨折4例，股骨髁间髁上粉碎性骨折7例，胫骨开放(GustiloⅠ、Ⅱ型)粉碎性骨折5例，股骨干骨折5例，股骨转子间骨折1例，胫骨平台骨折6例。局限性骨缺损23例，范围3 cm×3 cm× 2 cm-7 cm×4 cm×3 cm；整段骨缺损10例，范围在2 cm以内。

干预方法：

骨髓间充质干细胞的培养^[6]：用16号骨穿针自患者双侧髂前上棘及髂后上棘穿刺，抽取骨髓10-15 mL，采用多点穿刺方法，每个穿刺点抽取不超过5 mL。加入D-Hank’s液摇匀，细胞悬液按1∶1.5比例加到细胞分离液上层进行密度梯度离心(2 500 r/min，20 min)。小心吸取富含有核细胞的中间细胞层(富含骨髓基质细胞)，以D-Hank’s液吹打洗涤细胞离心清除分离液后，分3份加入含有DMEM培养液(含体积分数20%胎牛血清、10 mg/L谷胺酰胺)的细胞培养瓶中分别培养，7 d后换液，后每3 d换液1次，直至贴壁细胞铺满整个培养孔的底面。用0.25%胰酶消化传代，并作细胞计数。

骨髓间充质干细胞的鉴定：分离获得的骨髓基质细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性：细胞为典型的成纤维细胞样，呈漩涡状贴壁生长，体外扩增至12代，细胞形态不发生明显改变，高表达间质细胞标记CD73(SH3，4)、CD105(SH2)、CD166，不表达造血细胞标记CD34、CD45；在适宜的诱导条件下，能够较为容易地分化为成骨细胞及脂肪细胞，且具有多向分化能力，由此初步鉴定分离培养的为骨髓间充质干细胞。

骨形态发生蛋白与异体人工骨复合物的制备：于紫外线下照射消毒，无菌操作下在异体人工骨中加入液态骨形态发生蛋白，最终使骨形态发生蛋白的质量浓度为 20 g/L。

骨形态发生蛋白-骨髓间充质干细胞-异体皮质人工骨复合物的制备：分别在骨形态发生蛋白与异体人工骨复合物中加入上述培养的传代3次以内的骨髓间充质干细胞悬液，混匀。将细胞离心后去上清，使其悬浮于胶原骨形态发生蛋白-DMEM混合液中，调整细胞终浓度约为5×10⁹L^-1。

手术方法：对于骨折不愈合者清除骨折端瘢痕及硬化组织，对于新鲜骨折按照常规处理。复位时注意保持肢体长度和力线，充分止血。均采用合适固定物，其中交锁髓内针固定4例(股骨干4例)，单臂外固定架固定6例(胫骨6例)，钢板内固定23例(其中肱骨干4例、肱骨髁上髁间粉碎性骨折4例、股骨髁间髁上粉碎性骨折8例、胫骨平台7例)。骨折端缺损处植入骨形态发生蛋白-骨髓间充质干细胞-异体皮质人工骨复合物，植骨量为 20-45 g，平均26.5 g。根据术中出血情况放置引流管后逐层缝合。

术后处理：术后使用抗生素，根据伤口情况决定停药时间，伤口按时换药，抬高患肢，进行促进消肿，止血等对症处理。术后引流量少于15 mL时拔除引流管，但不能超过72 h，积极指导患者功能锻炼。对于不同患者实施不同功能锻炼方法，遵循循序渐进原则，将年龄、骨折类型、稳定程度、手术方法等因素考虑在内。术后2周伤口拆线。

下肢功能锻炼方面主张尽早床上活动，一般术后一二天即开始行被动关节功能活动及股四头肌等长收缩，根据X射线片示骨痂形成情况嘱患者于术后3-5周开始拄双拐下地，若骨质疏松严重或不稳定型骨折患者，拄拐下地时间可推迟一二周，术后10-12周骨折骨性愈合后嘱患者逐渐弃拐活动。

上肢早期实行肩关节，肘关节，腕关节等屈伸活动。根据X射线片示骨痂形成情况嘱患者于术后3-5周行阶段性负重锻炼。

随访方式：所有病例术后2周后拆线后出院，出院后6周第1次复查，过3个月第2次复查，半年后第3次复查，1至1年半后第4次复查。

每次复查拍正侧位X射线片，观察骨折愈合情况，骨痂生长情况及植入骨有无吸收。体格检查其功能活动是否恢复，有无疼痛及畸形愈合。

同种异体骨移植结果评分标准：根据Mankin等^[7]及Komender等^[8]对同种异体骨移植结果的评分标准，将结果分为：①满意：术后伤口愈合良好，期间可出现一过性发热和少量渗出；X射线片示植入骨无吸收；骨愈合最终完成；无肿瘤复发；肢体局部强度和功能恢复正常或轻度受限，无疼痛，日常活动恢复正常，无并发症。②不满意：出现明显排斥反应，大量渗出，伤口延迟愈合或窦道形成；X射线片示植入骨超前吸收；肢体局部疼痛，日常活动受限；出现感染、骨不连等并发症或肿瘤复发，骨不愈合，植骨取出、甚至截肢。

主要观察指标：骨折愈合、骨痂生长情况及植入骨吸收情况。

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讨论

目前临床上通常通过植入修复材料来修复骨缺损或治疗骨折不愈合，植入修复材料主要应起以下作用：①骨传导作用：移植物主要帮助骨形成支架作用，即以移植物为支架，使宿主的血管和细胞进入植入物，形成新骨，移植物坏死被吸收并逐渐被新骨替代。②诱导成骨作用。新鲜自体骨虽是最理想的植骨材料，其本身既具有诱导成骨作用又具有骨传导功能，但自体骨量有限，且取骨会给患者带来一些并发症，同时也存在连接缓慢、成骨不足等问题。
近年来同种异体骨的移植以其相容性好，弹性模量与自然骨相近而越来越受到重视。异体皮质骨的形态、几何形状、生物力学强度与自体骨相似；有良好生物相容性；来源充足，经过脱细胞、脱蛋白等处理，异体骨的抗原性进一步降低；异体皮质干燥异体骨为多孔状结构，孔均匀而相互贯通，孔径200 µm 左右，因此在形态结构上与人类无机骨极为相似。已证实异体干燥骨经取有机质等处理后具有良好的生物相容性和骨亲和性，无排斥反应，同时异体骨为生物降解材料，当植入骨缺损区可迅速引导宿主骨长入干燥异体骨孔隙内，其本身逐渐被降解，最终被新骨所替代，因而是一种理想的骨缺损修复材料^[10] 。基于上述原因，试验应用异体骨结合含骨形态发生蛋白及骨髓间充质干细胞的自体红骨髓能诱导异位骨形成，这些骨形成和内生骨化是相似的。此外，异体骨支架接种骨髓间充质干细胞能促进骨愈合能力，在异位移植中也有成骨的特性，还有研究表明异体骨有良好诱导骨产生的特性，异体骨在软组织中的组织相容性好，无炎症细胞浸润，因此被广泛应用于研究中^[11] 。
本组术后32例达骨性愈合，虽未与自体骨移植作随机对照，但愈合时间及临床效果与文献报道的自体骨移植有相同疗效^[12] 。骨形态发生蛋白-骨髓间充质干细胞-异体皮质人工骨复合物既可起到机械充填和新骨沉积的支架桥梁作用，又可互相取长补短，共同完成移植骨的爬行替代生长过程，增强了促进骨愈合和修复骨缺损的能力。而以天然或合成物为支架，以自身细胞为生长中心，以生长因子为生长、分化促进剂的组织工程骨正逐渐成为研究的热点^[13-14] 。
本课题组在细胞培养等基础研究方面有比较多的经验^[15-16] ，所以骨髓间充质干细胞培养比较成功。骨髓间充质干细胞是骨髓中的一种多功能细胞，具有自我增殖和多向分化潜能，可诱导分化为成骨细胞^[17] 。由于它取材方便，培养方法相对简单，已被广泛作为种子细胞用于骨折和骨缺损修复和重建。骨形态发生蛋白是存在于人体和动物体内的一种蛋白质，是已经被证实的干细胞合化诱导剂，能够诱导未分化的骨髓基质干细胞向成骨细胞和软骨细胞转化^[14] ，将骨形态发生蛋白植入骨坏死区域，可刺激新骨形成并且促进骨髓细胞转变为成骨细胞^[15] ，从而促进骨折愈合和骨缺损修复^[18] 。研究表明，骨形态发生蛋白没有种的抗原性，同种和异种骨形态发生蛋白移植无明显排斥反应^[17] 。用共聚焦显微镜方法发现，骨形态发生蛋白使间充质干细胞转化的成骨细胞间通讯水平增强；流式细胞仪检测出进入增殖期的成骨细胞比例显著增加。尽管骨形态发生蛋白具有较强骨诱导活性，但临床未推广普及，主要有以下因素限制其应用：骨形态发生蛋白诱导成骨的效果在骨修复中的作用已为众多学者所公认，但是如果将骨形态发生蛋白单独植入骨缺损区域，其将很快弥散，并不能在局部起到很有效的诱导成骨作用；骨形态发生蛋白在骨组织中含量甚微，提取困难；基因工程重组骨形态发生蛋白技术复杂，成本价格昂贵；外源骨形态发生蛋白体内吸收快，半衰期短，难以达到治疗效果。异体骨结合含骨形态发生蛋白及骨髓间充质干细胞的自体红骨髓能诱导异位骨形成，并且这些骨形成过程和内生骨化是相似的^[19-20] 。
　

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近年来同种异体骨的移植以其相容性好，弹性模量与自然骨相近而越来越受到重视。异体皮质骨的形态、几何形状、生物力学强度与自体骨相似；有良好生物相容性；来源充足，经过脱细胞、脱蛋白等处理，异体骨的抗原性进一步降低；异体皮质干燥异体骨为多孔状结构，孔均匀而相互贯通，孔径200µm 左右，因此在形态结构上与人类无机骨极为相似。已证实异体干燥骨经取有机质等处理后具有良好的生物相容性和骨亲和性，无排斥反应，同时异体骨为生物降解材料，当植入骨缺损区可迅速引导宿主骨长入干燥异体骨孔隙内，其本身逐渐被降解，最终被新骨所替代，因而是一种理想的骨缺损修复材料。基于上述原因，本研究应用异体骨结合含骨形态发生蛋白及骨髓间充质干细胞的自体红骨髓能诱导异位骨形成，这些骨形成和内生骨化是相似的。此外，异体骨支架接种骨髓间充质干细胞能促进骨愈合能力，在异位移植中也有成骨的特性，还有研究表明异体骨有良好诱导骨产生的特性，异体骨在软组织中的组织相容性好，无炎症细胞浸润，因此被广泛应用于研究中。
本组术后32例达骨性愈合，虽未与自体骨移植作随机对照，但愈合时间及临床效果与文献报道的自体骨移植有相同疗效。骨形态发生蛋白－骨髓间充质干细胞－异体皮质人工骨复合物既可起到机械充填和新骨沉积的支架桥梁作用，又可互相取长补短，共同完成移植骨的爬行替代生长过程，增强了促进骨愈合和修复骨缺损的能力。而以天然或合成物为支架，以自身细胞为生长中心，以生长因子为生长、分化促进剂的组织工程骨正逐渐成为研究的热点。

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