2.1   外泌体    2.1.1   外泌体的组成、生物学功能   外泌体是一种由内膜起源储存于多囊泡中，通过质膜融合而释放到细胞外的具有双层脂质膜结构的纳米级小囊泡(直径为30-100 nm)，携带核酸和蛋白质等多种具有生物活性的内容物，不仅能够介导细胞间信号转导和信息交流，还参与了人体内各种疾病的病理生理过程[9-10]。来源于不同细胞的外泌体中都携带有四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、膜转运和融合蛋白(GTPases、annexins、flotillin)、主要组织相容性复合体(MHCⅠ类/Ⅱ类)、热休克蛋白(HSP70、HSP90)等[11]，表面蛋白及内部生物学物质(蛋白质、mRNA、miRNA以及DNA)等决定了外泌体的特异性[10，12]。外泌体具有介导细胞间通讯的生物学功能，可通过蛋白质和生物活性脂配体直接激活细胞表面受体，与靶细胞膜、靶细胞融合或作为信号小体，传递效应分子和多功能信号复合体来维持正常细胞生理功能(包括免疫监视、血液凝固、干细胞维持、组织修复等)及通讯功能[11]，当外泌体的正常生物学功能失衡就会导致其病理学改变(包括肿瘤的发生与转移、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、HIV感染等)[11，13]。因此许多研究者将视野转移到外泌体研究，并发现神经细胞可分泌外泌体[14-15]，且人体的体液如血液、尿液、母乳、脑脊液中都可以检测到外泌体的踪迹[16-18]。 2.1.2   外泌体与神经系统   中枢神经系统中的星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞及神经元均可分泌外泌体[19-21]，外泌体或胞外囊泡可参与髓鞘胶质细胞与神经元之间的相互作用，从而促进神经元的存活，促进小胶质细胞介导的免疫反应和突触装配与塑形，也可作为有毒蛋白及炎症因子载体，参与神经细胞退行性变(如阿尔茨海默病、帕金森病)，加快损伤神经元死亡等[22]。目前，有学者提出神经源性外泌体可作为诊断帕金森病及阿尔茨海默病的生物标记物[23-24]。来自于胚胎和哺乳动物的神经元在受到刺激后将会释放囊泡样外泌体[25]，如少突胶质细胞释放的外泌体可参与神经元-神经胶质双向通讯模式，有助于神经元的完整性[26]；许旺细胞释放的外泌体可提高轴突的再生率[27]；小胶质细胞表面激活时会脱落微囊样胞外囊泡，该囊泡含有白细胞介素1β[28]；YIN等[29]发现神经元来源外泌体含有高表达的miR-21-5p，并诱导了M1小胶质细胞的极化，从而导致神经元死亡；ABDULLAH等[30]在星形胶质细胞培养中也证明了外泌体的存在，并且星形胶质细胞分泌的外泌体可清除脑内淀粉样蛋白β。因此，中枢神经系统中神经细胞与外泌体有着密切的联系，这些外泌体既可参与神经元之间的通讯及保护作用，也可导致神经元的凋亡。 2.1.3   外泌体在创伤性脑损伤诊断中的应用价值   创伤性脑损伤的整个损伤过程可能与组织代谢、血管内皮损伤、胶质细胞活化以及炎症因子释放有关，其病理生理改变是一个动态变化的过程，且往往不能通过影像学表现出来，尤其是长期遭受头部撞击的军人及运动员，难以诊断为创伤性脑损伤，针对这类患者目前还没有基于血液检测的生物标记物[2-3]。 诊断性标记物指示疾病的进展、严重程度和潜在的治疗干预措施。创伤后体液中生物标记物的变化对创伤性脑损伤的进展及严重程度起着关键性的作用，可用于追踪创伤性脑损伤不同阶段的进展情况，这些生物标记物随时间的动态变化可能代表了创伤性脑损伤的病理生理及分子水平的变化，其不仅有助于创伤性脑损伤的诊断，而且可以评估创伤性脑损伤患者的临床预后。胞外囊泡包括外泌体、微囊泡，外泌体所介导细胞间的生物学信息交流及其携带母体细胞的生物学信息(包括细胞蛋白、RNA、miRNA等)等特点使其可能成为创伤性脑损伤新的生物标记物。WINSTON等[31]的一项前瞻性研究表明，在患有轻型创伤性脑损伤的军人血浆中检测到与创伤性脑损伤神经病理有关的蛋白质水平，与无脑外伤病史的对照组相比，接受轻型创伤性脑损伤暴露的受试者血浆中神经源性外泌体表达的Aβ42水平显著升高，这意味着在轻型创伤性脑损伤患者神经源性外泌体中存在神经退行性改变的生物标志物。有研究表明从中枢神经系统分离出的外泌体或胞外囊泡所含有的蛋白质及RNA定量可作为神经系统疾病状态的生物标志物[12]。MOYRON等[32]通过收集临床创伤性脑损伤患者的血标本，根据格拉斯哥评分将患者分为3组，结果表明各组间外泌体相关蛋白存在差异性表达，但遗憾的是该研究并未明确说明哪一种蛋白可作为创伤性脑损伤的特异性生物标记物。MANEK等[33]在重型创伤性脑损伤患者脑脊液中检测到外泌体，这表明在创伤性脑损伤后受损大脑释放了大量胞外囊泡和外泌体到脑脊液中。由外泌体所分泌的RNA也在脑损伤后被发现，PATZ等[34-35]在创伤性脑损伤患者脑脊液中发现了81个差异性表达的囊泡相关RNA，且miRNA-9及miRNA-451被认为与创伤性脑损伤相关。HARRISON等[36]从创伤性脑损伤小鼠模型的脑中分离出胞外囊泡并从中纯化出RNA进行测序，结果发现胞外囊泡中的miRNA-21(在损伤部位的神经元附近可检测到)表达显著增加，且胞外囊泡中的miRNA-21与神经元中的miRNA-21同步升高，这提示miRNA-21可能作为潜在的生物标记物从损伤神经元中分泌出来。因此，神经细胞衍生的胞外囊泡及外泌体所携带的蛋白和(或)RNA可通过脑脊液或血液获得而作为创伤性脑损伤后的生物标记物，但目前最具诊断价值的标志蛋白或RNA尚未得到进一步的证实。 2.1.4   外泌体在创伤性脑损伤治疗中的应用价值   目前，创伤性脑损伤患者的临床治疗仍然是以减轻脑缺氧、脑水肿、脑代谢紊乱及减少脑细胞凋亡等对症治疗为主，使得创伤性脑损伤的死亡率及致残率没有得到改善。关于创伤性脑损伤高质量的治疗是目前临床工作中急需解决的问题。研究表明，外泌体可穿透血脑屏障到达中枢神经系统，也可以增加血管的渗透性到达靶组织；同时来源于不同细胞的外泌体可以发挥神经保护和治疗作用[37]。CHEN等[38]建立创伤性脑损伤大鼠模型进行相关实验，结果表明星形胶质细胞来源外泌体通过传递GJA1-20k可以被神经元摄取，下调细胞凋亡率，上调线粒体功能而促进神经元的恢复。YANG等[39]构建创伤性脑损伤模型，在损伤后24 h从尾静脉注入富含外泌体的miRNA-124，通过RT-PCR及酶联免疫吸附法检测伤后不同时间段海马小胶质细胞M1/M2表型的特征性基因和细胞因子，结果发现富含外泌体的miRNA-124通过抑制TLR4通路产生小胶质细胞M2极化效应，减轻神经炎症反应。研究表明小鼠创伤性脑损伤后内皮集落形成细胞来源外泌体可以抑制缺氧内皮细胞PTEN的表达，增加AKT及紧密连接蛋白的表达，对维持血脑屏障的完整性有积极的影响[40]。ZHAO等[41]通过消化法在创伤性脑损伤小鼠脑细胞外间隙中分离出外泌体，并用高通量测序检测环状核糖核酸在外泌体中的表达，鉴定出了231个显著性差异表达的环状核糖核酸，并用基因本体论分析表明这些差异性表达的环状核糖核酸可能与神经元的修复、神经系统的发育及神经信号的传递有关，此项研究拓宽了创伤性脑损伤后细胞外间隙基因调控的研究视野，为进一步研究脑外伤的分子机制和潜在的干预治疗靶点提供了新的思路。 2.2   干细胞源性外泌体   2.2.1   干细胞来源外泌体与神经再生   干细胞是一类同时具有自我复制与自我分化能力的细胞，在医学生物领域被称为“万能细胞”，其具有强大的自我更新和稳定能力、极强的多向分化能力及高度增殖能力[42]。但有研究报道某些干细胞的生物学特性可能并不依赖于其强大的自我复制与增殖能力，可能是通过旁分泌或内分泌而产生的某些生物活性物质发挥作用。研究人员发现经过多代培养干细胞而获得的外泌体，当去除培养液中的外泌体后干细胞的保护作用受到削减，这说明外泌体发挥了重要作用[43]。张恩国等[7]阐述了干细胞源外泌体在心血管系统、脑损伤与神经系统、骨骼与肌肉系统、肝脏损伤和肾脏损伤等方面都表现出了强大的修复和保护能力，进一步表明了干细胞来源外泌体在再生医学领域有着巨大的应用前景。DAS等[44]研究表明骨髓间充质干细胞移植减轻了实验动物的继发性神经变性及炎症反应，促进了神经的再生并改善创伤性脑损伤后的结局，但神经功能的改善不一定与干细胞的植入有关，可能与骨髓间充质干细胞来源外泌体相关。在最近的研究中，越来越多的证据表明干细胞来源外泌体可促进创伤性脑损伤后神经的再生，恢复损伤后的神经功能。 2.2.2   干细胞来源外泌体在创伤性脑损伤治疗中的应用价值  干细胞的治疗主要为其“归巢”、分化和远距离调控能力。无论是原发性脑损伤还是继发性脑损伤都会导致神经细胞凋亡从而影响创伤性脑损伤的预后。随着再生医学的发展，间充质干细胞来源外泌体在创伤性脑损伤的治疗中有着巨大的应用前景，外泌体复杂的蛋白质和遗传物质具有不同的生化潜力，可以参与多种生化和细胞过程且能穿透血脑屏障等[45]。 因此，有学者提出将间充质干细胞来源外泌体转运到创伤性脑损伤受损部位，可能为创伤性脑损伤后神经恢复开辟新的治疗途径，改善创伤性脑损伤的预后。从大鼠骨髓间充质干细胞中提取的外泌体通过神经发生和血管生成作用重建血管，能增强创伤性脑损伤和脑卒中后神经血管的恢复和可塑性，减轻创伤性脑损伤动物模型的神经炎症反应[46-47]。NI等[48]在创伤性脑损伤模型建立后15 min沿眶后途径注入30 μg骨髓间充质干细胞来源外泌体蛋白，结果表明骨髓间充质干细胞来源外泌体能抑制炎症因子的释放，增强抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，还可以通过调节小胶质细胞/巨噬细胞的极化来抑制创伤性脑损伤小鼠早期的神经炎症反应，从而起到神经保护作用。在猪创伤性脑损伤模型中给予间充质干细胞来源外泌体治疗后与对照组相比，表现出减轻神经损伤的严重程度及较快的恢复神经功能[49]。KIM等[50]通过培养间充质干细胞获取含有CD63+、CD81+的外泌体并静脉注射到创伤性脑损伤小鼠体内，结果提示该外泌体改善了小鼠脑损伤后的认知功能障碍。ZHANG等[8]将三维胶原支架条件下培养的骨髓间充质干细胞来源外泌体静脉注射到创伤性脑损伤小鼠模型中，结果显示随着时间变化小鼠的空间认知能力及运动感觉能力得到一定的恢复，且病变边缘新生内皮细胞数量及成熟神经元数量得到显著增加，神经功能得到恢复，该研究首次提出骨髓间充质干细胞来源外泌体可能作为创伤性脑损伤后一种新的“无细胞”疗法。脂肪间充质干细胞来源外泌体在脑损伤中可能通过抑制线粒体介导的细胞凋亡和细胞因子参与的炎症反应表现出神经保护作用[51]。KALANI等[52]研究表明胚胎干细胞来源外泌体通过恢复血管内皮细胞紧密连接蛋白和黏附连接蛋白来修复缺血再灌注损伤导致的神经血管的丢失。研究表明大脑中存在的神经干细胞能够增殖分化为神经细胞，张桂龙等[53]从终止妊娠的胎儿脑组织中分离出神经源性干细胞并培养出神经源性干细胞外泌体，发现外泌体可以被摄取和内吞进入细胞，这表明神经源性干细胞来源外泌体可能成为神经系统相关疾病新的治疗方式。因骨髓间充质干细胞是来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞，在一定条件下可诱导分化形成神经细胞，所以更多的研究表明骨髓间充质干细胞来源外泌体在神经组织再生中可能有着更独特的优势。 2.2.3   干细胞源性外泌体治疗的优势及挑战   尽管人体内存在着多种干细胞，但体内干细胞的总含量比较低，且细胞治疗中对于干细胞的数量及质量要求都很高，还要规避干细胞治疗带来的肿瘤风险、血栓形成、各种不良反应及伦理问题等。外泌体所具有双层脂质膜使其内容物不易被各种酶降解且能自由通过血脑屏障，纳米级的直径可使其避免吞噬细胞的吞噬，其母细胞的生物学信息通过激活细胞表面受体，与靶细胞膜、靶细胞融合和特殊的信号通道产生生物学效应。越来越多的证据表明，外泌体对于创伤性脑损伤的治疗有别于传统的治疗方法，外泌体在创伤性脑损伤治疗中可能是通过下调神经元凋亡、上调线粒体功能、调控小胶质细胞极化和减轻血管内皮细胞缺氧等机制来恢复神经元功能和减轻神经炎症反应，但并不能促进神经血管再生，而且不同细胞来源的外泌体对神经元表现出双重作用，既可保护神经细胞，也可加速神经细胞凋亡。因此，干细胞来源外泌体在创伤性脑损伤中较单纯外泌体有更大的神经治疗潜力，会给创伤性脑损伤患者更精准的治疗，或许能从本质上恢复神经血管的功能及促进神经元的再生，从而更大程度改善其预后，见表1。干细胞源性外泌体能规避单纯干细胞移植所带来的诱导微血管栓塞及免疫排斥反应，其治疗的安全性、作用效果可能会优于单纯干细胞治疗，并且可以在不失去功能的情况下安全储存[46]，可在特定的条件下培养大量干细胞源性外泌体而达到节约成本及时间。尽管干细胞源性外泌体治疗具有诸多优势，但目前在创伤性脑损伤治疗中的作用机制尚不明确，且创伤性脑损伤中的治疗局限于动物实验，临床试验中尚未见相关研究报道；针对外泌体现有的分离方法主要有超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合沉淀法、免疫亲和捕获法等，均具有含量低或纯度低等缺点。因此，对于干细胞源性外泌体在创伤性脑损伤中的治疗仍面临着巨大的挑战。 "