2.1   巨噬细胞自噬与肺部疾病关系研究的时间脉络   见表1。 2.2   巨噬细胞自噬   巨噬细胞是免疫系统的重要组成部分，可监测病毒、细菌等病原微生物以及烟尘等颗粒物，通过吞噬作用对其进行降解，以及可通过胞葬作用特异性识别并清除凋亡细胞以维持局部和系统免疫稳态[25]。自噬是维持细胞内微环境蛋白质质量平衡的高度保守的分解代谢过程，可识别并吞食细胞内变性的蛋白质、受损的细胞器和入侵的病原体，"

并将它们降解为可以被细胞重新利用的小分子物质，对于维持细胞内环境稳态至关重要[26]。对于具有吞噬作用的巨噬细胞，其自噬活性尤为重要，不仅影响巨噬细胞极化状态而且直接参与巨噬细胞胞葬作用。然而，多个研究提出自噬存在两面性，即研究认为基础水平自噬可以促进巨噬细胞胞葬作用以及极化反应平衡，最终减轻炎症反应[27-28]；而病理情况下出现自噬过度激活现象，导致巨噬细胞胞葬作用受损以及极化反应失衡[29-31]。近期研究指出，个别自噬相关基因的高表达不足以说明自噬活性升高，自噬活性的评价应综合考虑整个自噬流过程，尤其是自噬底物的降解能力[32]。因此，自噬活性与巨噬细胞功能状态的关系及其对机体炎症稳态的影响值得综合分析及深入探讨。 2.2.1   自噬过程   自噬是细胞在自噬相关基因(autophagy related genes，Atg)的调控下利用溶酶体降解自身受损细胞器和大分子物质的过程，按顺序主要分为自噬发生、自噬体形成、自噬溶酶体融合和底物降解等步骤[33]。从自噬发生到最终底物降解的一系列连续且动态的过程称为自噬流(autophagy flux)，自噬流中的任一环节受损都会导致自噬无法完成。迄今为止，已经发现40多个自噬相关基因，他们互相协调又分工作用于自噬的各个环节[33]。Unc-51样激酶1(Unc-51-like kinase 1，ULK1)-Atg13-Atg101-FIP200复合物是自噬发生的关键，并受上游腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路的调控[34-35]，该复合物在Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinostitol3-kinases，PI3K)介导下进一步扩增。Atg12-Atg5-Atg16复合物的形成和Atg8的激活在自噬体的形成中至关重要[36]，Atg8是酵母中微管相关蛋白1轻链3(microtubul-associated protein 1 light chain 3，LC3)的同源物，存在LC3-Ⅰ和活化型LC3-Ⅱ两种形式[37]，并通过整合体1(sequestosome 1，SQSTM1)又名p62，与泛素化底物链接，促进自噬体成熟[38]。成熟的自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，并借助溶酶体水解酶降解为可被细胞重新利用的小分子物质，同时伴有p62表达下降，至此整个自噬流完成(图3)。LC3是目前公认的自噬标记物，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加曾被认为是判断自噬活性增强的金标准[39]。但近年来研究提出，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加只代表自噬体合成增加，若p62表达未能协同下降将出现自噬空泡聚集现象，是自噬降解能力下降，自噬流受阻的表现[18]。 此前也有研究发现溶酶体膜蛋白2缺失小鼠由于溶酶体合成障碍，导致自噬溶酶体无法融合，细胞内出现自噬空泡聚集现象，此时虽然LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加，但自噬流停滞在自噬体形成阶段，自噬未完成[19]。因此，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加的同时p62表达降低才是自噬流完成和自噬效率评价的标准[18，40]。 2.2.2   自噬调控巨噬细胞极化   巨噬细胞具有高度异质性和可塑性，其表型和功能取决于所处微环境[41]。其中主要包括经典活化(或促炎)巨噬细胞(M1)和替代活化(或抗炎)巨噬细胞(M2)。促炎M1与抗炎M2两种表型间的转化，或其表型丰度分布的变化称为巨噬细胞极化[42]。在经脂多糖处理的巨噬细胞中发现LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和p62蛋白的表达水平协同增加现象，同时溶酶体相关标记蛋白LAMP1/2表达降低，说明巨噬细胞自噬流受阻，此时巨噬细胞表型以M1为主，诱导机体脓毒症反应[43]。富氢盐水溶液可增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值同时降低p62蛋白的表达，促进自噬流通畅，使巨噬细胞向M2表型极化，从而缓解大鼠的肺部炎症反应[44]。而自噬基因Atg5敲除导致巨噬细胞M1表型增加，诱发炎症紊乱[45]。上述研究提示，自噬流受阻将促进巨噬细胞向促炎M1表型极化，增加促炎因子和趋化因子的释放，自噬流通畅可促进巨噬细胞极化为M2表型，抑制机体炎症反应。"

2.2.3   自噬调控巨噬细胞胞葬作用   胞葬作用是指吞噬细胞清除凋亡细胞的过程。经典的胞葬作用包括“寻我”“食我”、细胞骨架重组和消化4个过程[46-49]。通过胞葬作用，一方面清除凋亡细胞，以免其继发性坏死引起机体炎症损害；另一方面实现巨噬细胞由促炎向抗炎表型的转化，共同维持机体炎症稳态。自噬与巨噬细胞胞葬作用关系密切，具有多种共同调节因子[50]，尤其体现在细胞骨架重组和消化阶段。研究发现自噬相关蛋白Atg5、Atg7等参与了巨噬细胞骨架凹陷并形成“吞噬杯”(phagocytic cup)的过程。此外，LC3相关的吞噬，即通过自噬溶酶体形式降解内吞物，是胞葬作用重要的消化机制[51-52]。抑制巨噬细胞自噬活性将严重影响其吞噬以及消化降解能力。SANJURJO等[53]发现，Atg7基因敲除使巨噬细胞食我受体c-mer原癌基因酪氨酸激酶表达水平降低，并抑制胞葬作用，且减少M2型巨噬细胞标志物CD163的表达；Atg5缺陷或高脂孵育诱导自噬流受阻的巨噬细胞均存在吞噬后的降解能力显著下降现象[35，54]。 综上，自噬障碍将导致巨噬细胞极化反应失衡，并损害巨噬细胞胞葬作用，使得M1巨噬细胞数量激增，加剧机体炎症反应；自噬流通畅可调节巨噬细胞极化稳态并促进胞葬作用，减轻凋亡细胞堆积，缓解炎症损伤(图4)。 2.3   巨噬细胞自噬在肺部疾病中的作用机制   急性或持续的慢性炎症反应是肺部疾病的共同病理特征。巨噬细胞参与肺部免疫调节、病原体和凋亡细胞的清除以及损伤修复等多个环节。多数研究认为激活巨噬细胞自噬可抑制肺部炎症反应，但部分研究提出巨噬细胞自噬过度激活加剧肺部炎症反应。因此，深入剖析巨噬细胞自噬活性与肺部疾病的关系，对于理清疾病的发病机制和防治策略至关重要。 2.3.1   巨噬细胞自噬在急性肺损伤中的作用   急性肺损伤是由细菌感染、脂多糖、脓毒症、高氧和氯等多种致"

病因素引起的临床综合征，其病理特征是肺泡和肺实质的急性炎症反应，伴有中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润和肺泡出血[55]，随着病情加重可发展为急性呼吸窘迫综合征[56]。 大部分研究表明巨噬细胞自噬的激活可抑制炎症反应、减少细胞凋亡，从而在急性肺损伤中起到保护作用。如在脂多糖或脓毒症诱导的急性肺损伤模型中发现，通过增强肺泡巨噬细胞自噬活性，可抑制NOD样受体蛋白3(Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat protein 3，NLRP3)炎症小体的合成，释放缓解炎症状态，从而改善了肺损伤[57-58]。多个研究发现靶向mTOR信号通路抑制巨噬细胞自噬参与了急性肺损伤的病理过程[59-60]，新型 H2S 供体 GYY4137等抑制mTOR信号通路进而激活肺泡巨噬细胞自噬活性的策略均表现出良好的缓解急性肺损伤效果[60-61]。但是，有研究提出肺泡巨噬细胞自噬的激活可通过诱导自身凋亡进而加剧肺损伤。例如，在肠缺血再灌注诱导的急性肺损伤小鼠模型中发现，受损肺组织产生的补体C5a可促进LC3Ⅱ的表达，但诱导肺泡巨噬细胞凋亡，加重肺损伤；沉默小鼠Atg5基因后，缓解了巨噬细胞凋亡，并降低肺损伤程度[62]。据此指出，自噬过度激活将诱导巨噬细胞凋亡，导致病理蛋白的累积和炎症因子释放增多，进而加剧肺损伤。但上述研究仅仅用LC3Ⅱ蛋白表达水平或者电镜下自噬体数量来衡量自噬活性显然存在局限性，此类研究未进一步探索自噬降解能力，实际上很有可能是自噬体累积和自噬空泡现象导致自噬流受阻进而诱发巨噬细胞凋亡。如有研究证实，急性肺损伤动物模型中存在LC3Ⅱ表达增加和自噬体累积现象，通过抑制自噬体形成，降低LC3Ⅱ表达同时增加p62表达水平，缓解了肺泡巨噬细胞凋亡并促进巨噬细胞向M2表型的极化，从而减轻肺损伤[63]。 综上，巨噬细胞自噬对于维持自身内环境稳态和功能稳定进而缓解急性肺损伤的炎症损伤至关重要，个别所谓巨噬细胞自噬过度激活对急性肺损伤不利的观点，由于其未探索自噬降解能力，进而评价自噬流是否通畅，因而存在片面性。 2.3.2   巨噬细胞自噬在感染性肺炎中的作用   感染性肺炎是由细菌、病毒、衣原体、支原体等病原微生物引起的肺炎，其中最为常见的是由细菌引起的细菌性肺炎[64]。研究表明，冠状病毒、嗜肺军团菌等病原体可在宿主肺泡巨噬细胞的液泡内复制，通过干扰巨噬细胞自噬逃避免疫防御[65-66]。CHEN等[28]在军团菌肺炎小鼠模型肺组织中发现巨噬细胞溶酶体功能受损并阻断自噬降解，敲除组蛋白去乙酰化酶6可上调溶酶体膜蛋白2和Rab7的蛋白水平，促进自噬-溶酶体通路，进而增强巨噬细胞的杀菌能力，缓解炎症反应。Rab7表达上调除了促进溶酶体功能外，还可促进巨噬细胞骨架重组进而促进胞葬作用效率[67-68]。此外，研究发现肺泡巨噬细胞自噬活性与其感染的菌株类型有关。DISTEL等[69]在鲍曼不动杆菌诱导的小鼠肺炎模型发现，感染非复制菌株(如19606菌株)的吞噬体会与LC3阳性空泡共定位，形成自噬溶酶体，将病原体降解；而感染复制菌株(如398菌株)的吞噬体不与LC3阳性空泡共定位，逃逸了LC3相关吞噬途径的降解，从而在巨噬细胞内存活和复制。综上，病原体的复制能力和逃避宿主免疫防御的机制与巨噬细胞自噬活性紧密相关，因此，巨噬细胞自噬可作为探究病原体与宿主之间相互作用机制的研究新靶向。 然而，部分研究提出巨噬细胞自噬可能被某些病原体利用来促进自身的存活和繁殖进而加重肺部炎症损害。如：在金黄色葡萄球菌诱导的小鼠肺炎模型中发现，巨噬细胞LC3和Beclin1表达上调，进而抑制巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬作用。3-甲基腺嘌呤抑制自噬体形成可增强巨噬细胞吞噬作用，进而减轻肺组织炎症损害[70]；对鹦鹉热衣原体肺炎人群的研究发现，肺组织Beclin1、LC3蛋白表达增加，巨噬细胞吞噬作用存在缺陷[71]。但是，上述研究只用Beclin1、LC3等自噬发生和自噬体形成的相关因子表达来衡量自噬活性，没有对自噬降解效率进行监测，不能准确反映自噬活性，上述结论的依据并不充分。实际上XIA等[72]在型病毒性肺炎小鼠模型中发现，巨噬细胞LC3表达上调的同时存在p62表达升高现象，提示自噬流阻断和自噬体累积，与细胞因子风暴现象密切相关。 综上所述，病原体可通过干扰自噬途径来逃避免疫防御。虽然巨噬细胞自噬与感染性肺炎发生发展的关系存在一定的争议，但经深入分析不难发现，肺巨噬细胞自噬流通畅是巨噬细胞发挥其免疫防御功能，防止肺炎进一步恶化的关键。今后研究中，应全面评价自噬流是否通畅来反映自噬活性，并为巨噬细胞自噬在病原体与宿主相互作用中的机制研究提供可靠的理论依据。 2.3.3   巨噬细胞自噬在慢性阻塞性肺疾病中作用的两面性   COPD是以气流阻塞为典型症状的慢性支气管炎症和(或)肺气肿，可诱发肺心病和呼吸衰竭，严重影响患者生命质量。全球40岁以上人群COPD发病率高达9%-10%，是全球公共卫生安全的重大威胁[73]。长期直接或间接接触香烟烟雾是引起COPD的主要诱因，研究表明，香烟烟雾会阻碍COPD患者肺泡巨噬细胞自噬降解过程[74-75]。多个研究发现COPD患者肺泡巨噬细胞中存在LC3Ⅱ和p62协同升高现象同时伴有泛素化蛋白的积累，提示自噬降解障碍和自噬流受阻[51]。此外，研究发现，脂质激酶Rubicon在肺泡巨噬细胞中的表达降低，进而造成LC3相关吞噬的功能障碍，胞葬作用受损，增加了炎症递质的释放[51，76-78]。WANG等[79]在细颗粒物(particulate matter 2.5，PM 2.5)诱导的COPD大鼠模型中发现，肺泡巨噬细胞溶酶体功能受损使自噬体与溶酶体融合障碍，自噬体积累，导致M1巨噬细胞比例增多，增加了促炎因子的释放。通过补肺益肾方上调肺泡巨噬细胞的自噬通量可抑制COPD大鼠中PM 2.5诱导的肺部炎症。上述研究表明，巨噬细胞自噬流受损会造成胞葬作用受损或极化反应失调，进而导致坏死性细胞凋亡增多，以及M1巨噬细胞数量增加，加剧机体炎症反应。 但值得注意的是，不同于急性肺损伤和感染性肺炎，COPD是一种慢性渐进性疾病，疾病后期易引起肺组织胶原纤维增生，此时，M2巨噬细胞数量增多并参与肺组织损伤修复过程[80]，激活自噬将促使巨噬细胞向M2型极化，但此时M2巨噬细胞对肺组织损伤修复的作用易导致肺纤维化，加剧COPD病情[81]。 综上所述，维持巨噬细胞自噬流通畅仍然是COPD患者肺部炎症稳态的关键，但是由于重度COPD常伴有肺组织胶原纤维增生，此时M2巨噬细胞的主要作用体现在促进组织损伤修复，自噬的持续激活增加了M2巨噬细胞表型极化，加剧胶原纤维增生，对疾病恢复产生不利影响，体现出肺巨噬细胞自噬的两面性。 2.3.4   巨噬细胞自噬在肺纤维化中的双重效应   肺纤维化是由遗传、感染和环境暴露等多种原因引起的间质性肺病，最为常见的是病因不明的特发性肺纤维化[82]。另外，长期接触某些有害物质如硅尘、煤尘、石棉等，也可能导致肺纤维化[83]。在肺纤维化早期阶段，以慢性肺部炎症及弥漫性肺泡损伤为主要病理表现，随着肺纤维化的进展，以成纤维细胞增殖和大量的细胞外基质沉积为特征[84-85]。 肺纤维化初期，M1巨噬细胞表型丰度增加，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6和趋化因子等大量促炎因子导致急性炎症和肺组织损伤[20]。巨噬细胞自噬流通畅可通过调控M1/M2表型平衡以及减少巨噬细胞凋亡等多种途径缓解肺纤维化初期的炎症紊乱[85-89]。二氧化硅暴露使肺组织LC3Ⅱ、p62以及泛素化蛋白表达增加，以及肺泡巨噬细胞中自噬体增加、溶酶体减少，导致自噬流受阻，从而诱导凋亡和高迁移率族蛋白B1释放增多，加剧肺部炎症反应和肺纤维化进程[87-89]；祖卡姆颗粒和薯蓣皂甙等中药及天然提取物均可通过促进肺巨噬细胞自噬流通畅，控制炎症反应、延缓肺纤维化进展[86，89]。 随着肺纤维化进展，肺部病理表现以细胞外基质成分沉积和纤维增生为主，此时M2巨噬细胞可通过释放抗炎因子如转化生长因子β等促进成纤维细胞分裂增殖，加重肺组织纤维化[20]。二氧化硅粉尘暴露会抑制mTOR通路，进而增加巨噬细胞中LC3和Beclin1蛋白表达和炎症因子的释放，促进人胚肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化[90]。从特发性肺纤维化患者肺组织分离的巨噬细胞中发现LC3Ⅱ表达增加和线粒体自噬增强现象，激活自噬将使M2巨噬细胞标记物转化生长因子β1表达进一步增加，加重其纤维化程度，而抑制自噬会阻断转化生长因子β1的表达和成纤维细胞分化，缓解肺纤维化[91]。同样，ZHU等[92]在硅肺大鼠模型肺泡巨噬细胞中亦发现，LC3和Beclin1表达水平升高，抑制肺泡巨噬细胞自噬活性可减轻病理损伤。因此，肺纤维化晚期，巨噬细胞自噬的持续激活促进肺泡巨噬细胞向M2表型极化，激活成纤维细胞分裂增殖从而加剧肺纤维化，体现出巨噬细胞自噬活性的不利面。 2.3.5   巨噬细胞自噬在哮喘中的双重效应   哮喘是以咳嗽、喘息、鼻塞、呼气性气流受阻等为主要临床症状的肺部慢性疾病，与遗传、过敏反应和环境刺激等多种因素有关。虽然临床症状类似，但由于发病原因、病情严重程度不同其病理机制和治疗策略均有差异，体现出该疾病的复杂性，关于巨噬细胞自噬与哮喘发生发展的关系亦具有两面性。 通过检测Beclin1、Atg5、LC3Ⅱ、p62等自噬相关蛋白发现，在包括室内尘螨等致敏原诱导的过敏性哮喘，无论是气道平滑肌细胞、小气道上皮细胞和纤毛细胞，还是肺巨噬细胞均存在不同程度的自噬激活现象，并且用自噬抑制剂氯喹抑制自噬溶酶体融合以阻碍自噬流后，可以缓解转化生长因子β1高表达和与其相关的纤维化倾向[93]。体外和体内实验均显示布地奈德和辛伐他汀干预后，气道巨噬细胞Beclin1和LC3的表达降低，同时p62表达增加，并缓解气道炎症反应，说明布地奈德和辛伐他汀可通过阻碍自噬流抑制自噬活性进而发挥治疗哮喘的作用[93]。此外，在丙烯酰胺暴露诱发的过敏性哮喘中亦发现肺巨噬细胞线粒体自噬增强现象[94]。多个研究共同提示肺巨噬细胞自噬活性的应激性增强，导致黏液生成增多、平滑肌厚度增加和肺纤维增生等，影响肺功能[95-96]。 不同于肺常驻巨噬细胞，过敏性哮喘患者外周单核细胞来源的巨噬细胞存在自噬抑制现象。虽然HAN等[97]对儿童过敏性哮喘患者的研究发现单核细胞来源的巨噬细胞中自噬相关基因LC3蛋白表达增加，但THEOFANI等[24]的研究显示外周单核细胞来源的巨噬细胞中LC3蛋白表达增加同时存在p62蛋白累积现象，提示其自噬流受阻。因此，HAN等[97]的研究由于未检测代表自噬流状态的p62表达水平，对自噬活性的评价存在一定局限性。同时THEOFANI等[24]研究提示，不同于肺常驻巨噬细胞，过敏原刺激将阻碍外周单核细胞源性巨噬细胞自噬流并促使M1促炎表型丰度增加，哮喘发生时外周巨噬细胞的持续浸润将进一步加重肺部炎症反应[91]。 除了过敏反应引起的哮喘，病原体感染、颗粒物暴露或者脂多糖刺激亦可继发哮喘[98-100]，此时其发病机制与过敏性哮喘存在诸多差异，而与前述的感染性肺炎和急性肺损伤等病理特点一致。现有文献分析显示，继发哮喘疾病初期病理特点与感染性肺炎或急性肺损伤类似，此时肺巨噬细胞自噬流受阻和促炎M1表型丰度增加。而关于过敏性哮喘，致敏原引起的应激性超敏反应可激活肺常驻巨噬细胞自噬，促进M2巨噬细胞的极化，与哮喘患者肺胶原蛋白合成增加和基质细胞过度激活进而加剧哮喘症状相关；同时致敏原可使外周单核细胞源巨噬细胞自噬流受阻，促使M1表型极化和肺组织浸润增加，进一步加重哮喘的炎症反应。因此，关于巨噬细胞自噬活性与哮喘关系的研究应在细化致病原因的基础上进行。 综上所述，巨噬细胞自噬在肺部疾病中存在两面性(图5，表2)。当肺组织病理表现以炎症紊乱为主要特征时，如急性肺损伤、感染性肺炎、轻度COPD和肺纤维化初期以及继发性哮喘，普遍存在巨噬细胞自噬流受阻和活性下降现象，激活自噬并保持自噬流通畅可以通过调控巨噬细胞极化和促进胞葬作用促使肺泡巨噬细胞向M2表型转化，进而维持炎症稳态；但在重度COPD的纤维化阶段和随着肺纤维化进展，巨噬细胞自噬的应激性激活将进一步促进肺泡巨噬细胞向M2表型转化，并参与激活成纤维细胞从而加重细胞外基质沉积和肺纤维化，表现出不利的一面。此外，在过敏性哮喘发病过程中，巨噬细胞自噬的两面性还体现在肺常驻巨噬细胞自噬的激活和外周浸润巨噬细胞自噬的抑制。"

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