2.1   动物选择   股骨头坏死动物模型选择上大体分为四足动物和双足动物2种，四足动物主要有兔子、大鼠、小鼠、猪、犬、羊[9-10]；两足动物主要有鸡、鸵鸟、鸸鹋等[11-13]。大型动物猪、犬、羊、鸵鸟、鸸鹋等股骨头大小与人类相似，但价格昂贵，且饲养困难，所以多用于创伤性股骨头坏死造模或者小规模SONFH 造模，不适合大规模造模应用[14]。而对于SONFH，出于对模型的可重复性和操作性考虑，在实验动物选择上往往选择大鼠、小鼠、兔子、肉鸡等易饲养、价格便宜的小型动物。近年来随着动物实验模型的发掘，灵长类动物树鼩也在SONFH的动物造模中显现出来，不同动物优缺点比较见表1。 "

2.1.1   兔子   兔子作为哺乳动物与人类基因较为相似，且价格便宜易饲养，在SONFH的模型中应用较多，也相对比较成熟。兔子相较于大鼠和小鼠股骨头较大，方便进行手术操作，在研究细胞移植、探索组织工程、复合材料在股骨头坏死中的治疗作用时应用较多。XU等[15]建立了兔SONFH 模型，之后将羧甲基壳聚糖/海藻酸盐/间充质干细胞/内皮祖细胞复合物通过髓芯减压的方式植入坏死兔子股骨头内，该复合物由无细胞毒性的羧甲基壳聚糖/海藻酸盐支架为细胞生成和细胞间通讯提供三维环境，并且该支架可以增强骨隧道和附近骨组织之间的联系使骨向内生长，降低软骨下骨折和塌陷风险；间充质干细胞/内皮祖细胞共培养促进成骨和血管生长因子分泌，通过显微CT、免疫组化等方法观察到此种复合物可以明显促进血管和成骨生成，抑制脂肪生成，促进了激素诱导的兔股骨头坏死的修复。XU等[16]合成了一种含有纳米纤维素、纳米羟基磷灰石和 Ⅰ型胶原蛋白的弹性气凝胶支架，并利用纳米纤维素携带细胞衍生因子1和硬化蛋白单克隆抗体，之后将载有细胞衍生因子1和硬化蛋白单克隆抗体的气凝胶支架植入激素诱导的股骨头坏死兔子模型中，通过X射线片、CT和苏木精-伊红染色发现植入气凝胶支架的坏死兔股骨头内以支架为中心可以看到明显的新骨形成，该支架复合物具有明显的成骨、成血管和修复骨缺损的能力，未来有希望在骨修复治疗中发挥作用。 2.1.2   大鼠   大鼠价格低廉，易于繁殖和饲养，有着和人类相似的基因型，便于取材和鉴定，但造模时较难形成股骨头坏死后期塌陷症状，在探索SONFH的发病机制、治疗方法和新药研发时常被选择。PENG等[17]通过细胞实验发现糖皮质激素可以通过活性氧/JNK/c-Jun信号通路诱导成骨细胞的自噬和凋亡，从而引起股骨头坏死，并结合大鼠体内实验表明自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可以降低激素对于成骨细胞凋亡的影响，改善骨小梁形态和数量，防止激素对于大鼠股骨头微观结构的破坏，具有开发成SONFH治疗药物的潜力。CHEN等[18]研究发现大鼠在激素给药后会出现高氧化应激，致使抗氧化酶的表达下降，导致破骨细胞活跃，随后引起股骨头坏死的发生，提出抑制活性氧产生从而抑制破骨细胞生成可能会抑制股骨头坏死的进展。而褪黑素是一种内分泌激素，具有较强的抗氧化能力。LI等[19]观察褪黑素在甲泼尼龙琥珀酸钠诱导的大鼠SONFH模型中的作用，发现褪黑素可以通过抑制铁死亡，减弱糖皮质激素诱导的活性氧生成，增强成骨分化，减轻SONFH大鼠的骨质流失，增加骨小梁面积，未来可能在预防和治疗SONFH方面发挥作用。 2.1.3   小鼠   小鼠在SONFH模型造模中应用也较多，但相较与大鼠，小鼠的股骨头较小，不便于取材和观察鉴定，所以在模型中的应用常受限制。LIU等[20]应用小鼠对SONFH模型进行改进，应用天冬酰胺酶、血管紧张素Ⅱ结合地塞米松对小鼠进行SONFH造模，通过股骨头血管灌注的方法发现该造模方法可引起股骨头血管数量明显减少，苏木精-伊红染色可以观察到股骨头空骨陷窝形成，骨小梁骨折，造模成功率达70%，此种造模方法有利于模拟股骨头坏死时的环境，为SONFH模型建立提供了一个新方向。 2.1.4   鸡   鸡作为双足动物，有着与人类较为相似的负重方式，相比较于兔子、大鼠等四足哺乳动物，易形成股骨头坏死后期股骨头塌陷症状，适用于生物力学因素在股骨头坏死中的作用研究，并且与鸵鸟和鸸鹋等大型鸟类相比，易饲养、价格便宜，适合大规模造模应用，作为双足动物在SONFH动物模型上应用较多[21]。YU等[22]用甲泼尼龙 20 mg/kg连续作用7 d进行鸡SONFH造模，有2只鸡在56 d时观察到了明显跛行。PANG等[23]用甲泼尼龙对鸡进行SONFH造模也出现了明显跛行，并且通过研究发现自噬可能参与了激素诱导鸡股骨头坏死的发病机制，为SONFH的预防和治疗提供了新思路。但鸡的基因与人类相似性较低，且解剖和生理结构研究不深入，从而限制了它的应用。 2.1.5   树鼩   树鼩作为灵长类动物，繁殖和生命周期短，繁殖率高，体型适中，易于喂养，具有许多与人类相似的特征，全基因组测序显示，树鼩与人类的同源性高于小鼠、大鼠和狗[24]。CHEN等[25]采用6个月大的雄性树鼩进行SONFH 造模，连续3 d腹腔注射脂多糖300 μg/kg，每次间隔24 h，之后连续3 d注射甲强龙 130 mg/kg，第2周之后每周2次腹腔注射甲强龙 130 mg/kg，持续12周，组织切片结果显示骨小梁稀疏、变薄、骨折、排列紊乱，显微CT评估骨结构出现塌陷，该研究为SONFH动物模型提供了一个新方向。但树鼩的基因组序列研究尚不透彻，未来随着树鼩基因序列研究的深入，因其与人类较为相似的同源性，有希望在SONFH动物模型造模中发挥更重要的作用。 2.2   激素选择及给药方式   激素的种类较多，临床应用时主要根据疾病的不同特点选择用药，按照激素临床作用持续时间的长短可以将其分为短效、中效和长效3类，而在动物实验激素选择上，大多数研究者集中在中效的醋酸泼尼松龙、甲强龙和长效的地塞米松磷酸钠上[26-28]。而对于激素的给药方式主要有腹腔注射、皮下注射、肌肉注射等，可以通过短期冲击、长期给药、间断给药等几种方法进行选择。见表2。"

短期冲击：该方法的特点是通过短时间大剂量激素冲击建立SONFH模型。崔镇海等[29]用SD大鼠通过臀肌注射甲强龙40 mg/kg，1次/d，连续给药6 d进行造模，8周抽取动物行CT检测未发现股骨头坏死；16周后通过检测发现骨小梁密度不均匀，股骨头前上部出现类圆形低密度区，局部出现骨质疏松。杨丰合等[30]用新西兰大白兔进行早期造模，第1天给予耳缘静脉注射脂多糖10 μg/kg， 24 h后给予甲强龙20 mg/kg，连续3 d臀肌注射给药，造模成功，但造模死亡率高达70%。短期冲击造模方便简单，便于操作，适用于大数量造模，但造模死亡率较高。 长期给药：该方法的特点是给予低剂量激素长期干预进行SONFH模型建立。张立岩等[31]在兔的双侧臀肌交替注射地塞米松磷酸钠10 mg/kg，每3 d 1次，连续给药6周，6周后MRI检测发现软骨下骨坏死、囊变，组织学观察骨小梁稀疏变细，骨细胞核固缩，空骨陷窝率为(49.0±0.3)%。王新民等[32]在兔的臀部肌注醋酸泼尼松龙8 mg/kg，每周2次，连续干预4周，成功造模，且未出现模型死亡。长期给药造模时间较长，实验可重复性高，模型稳定，造模死亡率较短期冲击明显降低，但造模时间较长，所以不适用于大样本量造模。  间断给药：该方法的特点是间歇给药，是结合短期冲击、长期给药进行的改良。ZHENG等[33]用大鼠进行SONFH造模，通过尾静脉注射脂多糖 0.2 mg/kg，24 h后给予甲强龙 100 mg/kg腹腔注射3 d，为了预防大鼠自发的骨修复，于第2-6周每周3次腹腔注射甲强龙 40 mg/kg，期间共有3只大鼠在注射脂多糖后死亡，死亡率为15.8%，造模成功率为75%。间断给药可以避免短期冲击带来的高死亡率，又可以保证动物造模的成功率，但由于间隔时间不同，所以实验可重复性相对较差。  2.3   激素造模    2.3.1   单纯激素造模   激素可以增强骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，抑制骨形成促进骨吸收，造成股骨头坏死[34-35]。但单纯激素造模和临床患者的发生机制不同，所以单纯激素造模适用于对疾病治疗方法的探索，不适用于对发病机制的研究。单纯激素造模往往与激素的种类、用量、用药时间等密切相关，FAN等[36]给予大鼠 21 mg/kg甲强龙皮下注射，持续给药4周，4周后MRI示股骨头水肿，组织病理学观察脂肪细胞增多，骨小梁断裂，造模成功率为70%。ZHANG等[37]用地塞米松进行造模，每周2次大鼠臀肌注射地塞米松，持续6周，通过苏木精-伊红染色大鼠股骨头骨小梁稀疏、变薄、断裂，造模成功率为81.8%。由于大鼠与人类负重方式不同，且大鼠较人类有更强大的骨损伤修复能力，所以很难观察到股骨头的微骨折或者塌陷。而相比较四足动物，双足动物在模拟股骨头塌陷上有相对优势。ZHANG等[38]以每天20 mg/kg的剂量给鸡肌肉注射甲强龙，持续注射7 d进行造模，可以观察到鸡出现明显跛行，有的甚至无法站立，解剖后发现严重者出现了骨骺与骨骺分离、软骨损伤，有的甚至出现关节软骨完全脱落。 单纯激素造模是从病因引发股骨头坏死的发生，造模方式简单，但由于不同动物对激素的敏感性不同，个体差异较大，且激素种类较多，难于标准化。 2.3.2   脂多糖联合激素造模   脂多糖作为SONFH的诱导剂，可诱导免疫刺激因子的产生，诱发血管功能障碍，有助于阐明SONFH的发病机制。脂多糖联合激素可以模拟宿主炎症状态，诱导机体产生微循环障碍，影响血液循环，成功率也相对较高。在已发表的方案中，脂多糖的剂量范围为5 μg/kg至2 mg/kg。时利军等[39]用单次注射脂多糖5 μg/kg联合3次注射甲强龙 20 mg/kg进行SONFH兔造模，造模成功率达81.3%。XU等[15]用单次注射脂多糖  10 μg/kg联合3次注射甲强龙 20 mg/kg进行SONFH兔造模，死亡率达8.3%，造模成功率为76.4%。ZHANG等[40]用同样方法造模，造模成功率为85%。张翔等[41]用兔子进行造模，连续2次注射脂多糖10 μg/kg联合醋酸泼尼松龙25 mg/kg 3次注射，模型具备早期股骨头坏死骨细胞核固缩、脂肪细胞增多、空骨陷窝率增多等特征。韦露等[42] 用2次脂多糖 20 μg/kg联合地塞米松磷酸钠25 mg/kg  3次注射进行SONFH兔造模，未出现模型死亡，造模成功率为75%。相比较兔子，大鼠对脂多糖更有耐药性，在大鼠模型中往往使用更高剂量的脂多糖进行诱导。PENG等[17]前2 d给予静脉注射脂多糖 2 mg/kg，之后连续5 d肌肉注射甲强龙 20 mg/kg，造模成功率达83.3%。CHEN等[43]用脂多糖2 mg/kg连续2 d静脉注射结合甲强龙  20 mg/kg连续3 d肌肉注射，造模成功率达66.7%。大剂量的脂多糖联合大剂量的激素在大鼠SONFH 模型中造模成功率更高[14]。 脂多糖联合激素造模，模型成功率高，是较为常用的造模方法[44]。单次或双次低剂量脂多糖注射和随后的3次高剂量激素注射是兔子目前较为成熟的联合造模方案，大鼠对脂多糖耐药性较强，所以大鼠模型中需要大剂量的脂多糖联合激素使用。 2.3.3   马血清联合激素造模   由于临床SONFH患者一般在使用激素相关疾病的基础上发生，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、感染性休克、肾病综合征等疾病[45]，这些疾病都有一个共同特征，即身体在应用激素之前已经存在脉管系统或免疫系统紊乱。而马血清可以引起变态反应，为了建立动物模型模拟SONFH在临床中的实际情况，研究人员用马血清结合激素进行SONFH建模。佟鹏等[46]给予兔耳缘静脉注射马血清10 mL/kg，14 d后再次注射1次，再次间隔14 d；给予醋酸泼尼松龙8 mg/kg臀肌注射，1次/d，连续注射6 d；造模8周后通过X射线片观察到股骨头骨皮质变薄，骨密度降低，MRI检查出现明显的双线征，符合股骨头坏死早期临床表型的特征。WANG等[47]先给予10 mL/kg马血清1次，2周后连续2 d每天注射5 mL/kg马血清，间隔2周后给予醋酸甲泼尼龙7.5 mg/kg，每3 d 1次，连续给药6周，兔子造模成功率为84.62%。洪加源等[48]用与WANG等[47]相同的马血清给药方法和剂量联合甲强龙4 mg/kg每周1次，连续4周进行SONFH兔造模，造模成功率为91.7%。 马血清联合激素造模与临床上SONFH的发生与疾病进展过程在一定程度上具有一致性，对于SONFH的临床治疗、药物研发具有一定意义[49-50]。 2.3.4   改良造模   四足动物由于与人类不同的负重方式，很难从生物力学角度模拟出股骨头承重的真实状态，而双足动物大多为非哺乳动物，与人类基因型相差很大，对激素的敏感性与人类存在很大差异。无论是四足的兔子和大鼠还是双足的鸡，都难以模拟出激素诱导股骨头坏死的整个变化过程。多数SONFH 的实验模型都停留在股骨头坏死初期阶段，大都因脓毒症或者死亡而未能发生股骨头坏死的晚期塌陷。为了寻找能够模拟出股骨头坏死整个过程的实验方法，LI等[51]基于3D打印技术，以对细胞无任何毒性的树脂作为原材料发明了一种适合兔子髋关节的加压装置，可以对股骨施加压缩载荷，这种加压装置可以模拟人正常站立位股骨头的应力。该研究先给予兔耳缘静脉注射脂多糖10 μg/kg，24 h后连续 3 d给予甲强龙20 mg/kg，3周后将不同曲率的加压装置植入兔子体内，通过苏木精-伊红染色发现加压装置区域局部出现软骨缺损和软骨下骨折，出现了股骨头塌陷，并且股骨头损伤的程度可以由加压装置的曲率半径变化而控制，可以对曲率半径进行修改模拟股骨头坏死的不同阶段。此种改良方式复刻了股骨头坏死的病理特征，动物模型可以出现股骨头塌陷、软骨缺损和软骨下骨折，提高了动物模型对临床的保真度，但实验操作难度较大。 生物力学在股骨头坏死中的作用一直以来都是临床工作者在疾病治疗中关注的重点。LI等[52]为了研究生物力学在SONFH中的作用机制，分别将激素诱导后的大鼠进行尾悬吊实验和跑步机运动，通过尾悬吊实验模拟卸载状态，跑步机运动模拟超负荷状态；磁共振显示超负荷状态下大鼠股骨头出现异常T1WI信号和高强度T2WI信号，而卸载状态下大鼠股骨头内表现出均匀T1WI和低强度T2WI信号；CT显示超负荷状态下大鼠负重区骨髓腔和骨小梁结构异常，而卸载状态下大鼠骨髓腔和骨小梁分布较超载状态下更均匀；通过对比实验得出超重状态下会加速SONFH的发展进程，而卸载状态可以减缓疾病进展，有利于疾病治疗，并通过进一步实验得出卸载状态延缓疾病进展与MALAT1/miR-329-5p信号传导有关，由此得出生物力学力通过MALAT1/miR-329-5p/PRIP信号传导加重SONFH的发生。该研究也为临床股骨头坏死患者早期的拄拐负重提供了理论支撑，为研究生物力学在股骨头坏死发病机制中的作用提供了参考。见表3。"

2.4   动物模型评价方法    2.4.1   一般情况观察   SONFH模型建立过程中动物往往会出现食欲不振、大便变稀、精神萎靡、毛发枯燥、脱发、活动减少，有的甚至会出现跛行。模型造模成功后，通过解剖剥离股骨头，从股骨头色泽、形态、骨质状态进行直观观察。时利军等[39]观察到造模成功的兔子股骨头模型出现软骨下坏死，关节面表现出明显的塌陷，股骨头色泽灰暗，骨质变疏松。王继涛等[53]观察到造模成功的小鼠股骨头表面软骨粗糙，有囊性样改变。 2.4.2   影像学检查   无论是临床还是动物实验，影像学检查作为一种无创检查对于判断股骨头坏死有很好的辅助作用。对于实验动物模型而言，在判断模型是否造模成功，往往最常借助的影像学方法有X射线片、Micro-CT和MRI。 X射线片作为影像学检查基础的检查方法，经济简便，侧重于观察骨的结构、位置等病理变化，股骨坏死早期X射线片可以观察到股骨头内密度不均匀，股骨头内出现片状低密度影或者囊性改变。佟鹏等[46]通过X射线片观察到模型兔子关节间隙变窄，骨小梁序列紊乱，骨皮质变薄。但X射线片对于早期坏死并不具备灵敏性，所以单一作为评价标准使用较少，多和其他方式配合使用。 Micro-CT较X射线片分辨率显著提高，可以更清楚地显示骨骼结构，测量骨密度，对于骨小梁敏感性高，且可以进行活体动态成像，便于对动物模型进行观察[54]。SUN等[55]用Micro-CT对造模大鼠检查发现，模型大鼠骨小梁稀疏，部分出现骨小梁断裂，且可以清楚反映出表面软骨情况。董玉雷等[56]用Micro-CT观察激素诱导的大鼠股骨头模型，发现股骨头内骨小梁稀疏、软骨面变薄，软骨下出现囊变、骨坏死，且Micro-CT可以对松质骨骨小梁参数进行定量分析，更便于对模型进行比较评价。 MRI相较于X射线片和Micro-CT对早期股骨头坏死敏感性更强，可以更早更明确地反映出病变部位及大体状态。股骨头坏死 MRI 诊断的阳性标准是T1WI 显示点、细线、片状低信号，或T2WI 显示点、细线、片状高信号。FAN等[36]大鼠造模后通过MRI观察发现股骨头T2WI高信号，大鼠出现了早期股骨头坏死骨髓水肿特征；梁红锁等[57]对造模后的兔子模型进行观察，MRI表现为T1WI片状低信号，T2WI片状高信号，并伴有关节腔积液的产生，兔子模型造模成功。MRI灵敏度高，可作为早期动物模型无创评价的首选方法。 2.4.3   组织病理学检查   组织病理学是诊断骨坏死的金标准[58]，但具有有创性，所以在临床未普遍应用，而在动物模型中，组织学检查常被作为评价模型造模成功的依据。病理状态下，死亡或凋亡骨细胞的增加会导致空骨陷窝率增大，所以骨细胞在陷窝中消失被作为SONFH的主要病理标志[59]。在组织学检测中多采用苏木精-伊红染色方法，杜晨阳等[60]通过苏木精-伊红染色发现激素造模后的兔子骨小梁稀疏、紊乱、断裂，空骨陷窝率增加高达(20.51±2.16)%。ZHAO等[61]对激素诱导的兔子模型进行苏木精-伊红染色发现骨小梁周围成骨细胞减少、细胞核浓缩，骨髓造血细胞减少，脂肪细胞坏死。虽然组织病理学是诊断骨坏死的金标准，但组织学检测往往需要处死动物，不利于接下来实验研究，所以寻找一种无创的替代方法仍是未来的努力方向。 SONFH 动物模型不同评价方法的特点见表4。"