In vitro culture of embryos and establishment of embryonic stem cell lines

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.024

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: The successful establishment of human embryonic stem cell lines in vitro is of great significance to human embryonic development mechanism and developmental biology, cell and tissue transplantation in the treatment of certain diseases.

OBJECTIVE: To summarize the progress of in vitro culture of embryos and establishment of embryonic stem cell lines, to explore the influential factors for in vitro culture of embryos, and the methods of culturing human discarded embryos, isolating inner cell mass and establishing embryonic stem cell lines, as well as the establishing conditions for embryonic stem cell lines.

METHODS: With the key words of “embryo, embryonic stem cells, coculture, sequential culture”, the first author searched CNKI and SCI databases for literatures concerning in vitro culture and transplantation of embryos and establishment of embryonic stem cell lines published from 2000 to 2014. Systematic evaluation was conducted. Finally, 58 literatures were retained for result analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: The culturing condition for embryos in vitro is the key factor affecting embryo transfer outcomes, including culture medium component and culture system. In previous studies, the component and application of culture medium have changed greatly, and the culture system has altered from single culture to coculture and sequential culture. Ethical issues and embryonic origin restrictions restrict the establishment of human embryonic stem cell lines. Clinically discarded low-quality embryos can be used as one of the material sources to establish human embryonic stem cell lines, which can effectively lessen the problem of embryo shortage during the establishment of human embryonic stem cell lines and reduce ethical disputes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

Key words: Embryonic Stem Cells, Embryo Culture Techniques, Embryo Research

CLC Number:

R318

Wang Fang, Chen Shao-wei. In vitro culture of embryos and establishment of embryonic stem cell lines[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(14): 2273-2277.

Figures/Tables 1

2.1 胚胎体外培养 2.1.1 胚胎体外共培养作用机制人的卵母细胞、输卵管上皮细胞、胎儿成纤维细胞等作为辅助细胞或体细胞，为胚胎发育初期提供营养物质[15]。相关研究发现这些辅助细胞或体细胞与胚胎共培养均取得了不错的效果[16]。目前，国内外已有不少关于人早期胚胎共培养的相关文献报道，但关于共培养支持胚胎体外发育作用的相关机制，以及克服早期胚胎体外发育阻断的原理并不完全明确。影响共培养效果的因素很多：第一，在胚胎发育过程中能自分泌或旁分泌一些对早期胚胎有利的物质，研究最多的是生长因子[17-18]；第二，共培养体系可代谢降解或除去培养液中胚胎发育过程中产生的胚胎毒性因子等；第三，共培养细胞可能通过体细胞与胚胎的直接接触促进胚胎发育。 2.1.2 影响胚胎体外培养的因素胚胎体外培养条件是影响胚胎移植结局的重要因素，其中包括培养液的成分和培养体系[19]。在过去的研究过程中，培养液的构成及应用已经发生了很大的变化，培养体系也从单一培养发展到共培养、序贯培养。胚胎培养液的改进：胚胎体外培养是指将胚胎放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育[20]。胚胎早期生长发育的成败与其体外培养环境条件有直接关系。早期胚胎体外培养需要模拟母体环境，使得早期胚胎能够在更接近生理的条件下生长发育，从而获得与体内胚胎更加接近的发育潜能，以提高妊娠率[21]。近年来，胚胎移植结局成功率不断提高，很大一部分应该归功于培养液成分的改进，进而改善了胚胎的潜在质量，提高妊娠率。现有研究已经表明，添加一定比例的蛋白成分到培养液中有利于胚胎的体外发育，而且胚胎发育良好[22]。胡泊等[23]探讨了胚胎培养液等对胚胎早期生长发育和临床妊娠率的影响，认为不同发育时期的胚胎使用序列培养液可以根据胚胎的生长提供所需求的营养成分，使培养至囊胚阶段具有发育潜能的胚胎数增加，在提高着床率和妊娠率的基础上，减少移植的胚胎数。蛋白成分也是早期胚胎培养的一种添加到培养液中用于提高哺乳动物体外囊胚发育率的重要物质[24]。血清是胚胎培养液中添加的主要蛋白源，通常被作为蛋白成分来源。Deaton等[25]研究表明血清成分复杂，包括一些还未确定的物质，血清在提供蛋白的同时含有微量的血红蛋白和内毒素，对胚胎发育产生有害因子，对配子和胚胎产生不良影响。同时也有研究认为血清中的某些成分还能有促胚胎干细胞分化的作用[26-27]。这些因素就决定了血清对胚胎的影响也是复杂多元不稳定的，对胚胎的质量有很大影响。另外，研究发现血清还影响胚胎的冷冻保存效果。近些年来人们一直在努力寻找胚胎培养液中能替代血清的物质，但至今没有单独利用血清替代物成功建系的报道。 Sjöblom等[28]研究发现培养液中生长因子对促进胚胎发育至囊胚有重要的影响。生长因子主要通过胚胎自分泌或旁分泌方式起作用。多数生长因子为生长促进剂，但是还存在一些生长因子的抗体，它们为生长抑制剂，会阻断这些作用。生长因子间通过复杂的相互作用在胚胎体外培养过程中发挥重要作用[29]。一些生长因子和其受体的表达贯穿整个胚胎的体外培养过程，一些生长因子和其受体的表达则只在某一特定的胚胎体外培养阶段，还有一些生长因子和其受体根本没有任何表达。李真等[30]研究胚胎分泌生长因子的量与胚胎质量的关系，发现生长因子浓度与囊胚形成率有相关性，胚胎培养液中生长因子在胚胎的表达和分泌水平预示着胚胎的生长发育和妊娠率，从而有利于了解胚胎功能状态及生存潜力，这就为胚胎的收集提供了可能。培养体系的改进：①共培养：是指在胚胎体外发育的培养液中加入一些体细胞作为营养细胞与胚胎一起培养，如输卵管上皮细胞或子宫上皮细胞共同培养等，建立共培养体系以促进胚胎发育，克服胚胎体外发育阻断，提高胚胎移植率。Mercader等[31]研究数据也支持共培养胚胎移植能够提高受精率和妊娠率。但是共培养一直存在异议，涉及到大量的干扰因素，包括制作辅助细胞程序复杂、可能增加污染机会、体外培养时间的延长可能对胚胎有不利的影响，或冻存复苏技术尚需要研究与探索，致使对培养液的营养成分和胚胎代谢的研究都非常困难。因此仍不能像体内环境那样有效地发育，还需要在理论基础和应用上进一步深入研究体细胞共培养对早期胚胎体外发育的影响及其作用机制，为改善体外培养环境和复杂培养液的研制提供模型。②序贯培养：随着研究的深入，培养液的成分不断的改良。按照早期胚胎在发育的不同时间对不同营养成分需求和代谢的变化，配制出阶段性的系列培养液，针对不同发育时期的胚胎进行培养液序列更换，满足胚胎在体外不同发育阶段生长的需要以促进胚胎的体外发育[32-33]。这种方法满足了胚胎的营养物质供应及其生理需求，使胚胎在体外条件下也能顺利发育到囊胚阶段，有效减少了多胎妊娠的发生[34]。 1998年，Gardner等[35]在哺乳类胚胎生理学基础上，研制出序贯培养这一种新的体外培养方法，不但有助于提高胚胎的种植率、改善妊娠结局，而且为其他新的培养体系方法的研究奠定了基础。2003年，孙云霞[36]通过实验探讨了序贯培养法是否较传统的单一培养液培养法更有利于胚胎的体外培养，结果发现序贯培养法更适合于胚胎的体外培养，可获得质量更高的胚胎。然而由于序贯培养时换液次数多，受外界环境影响大，污染机会相对较多，因此，必须有严格的实验室质控程序与无菌操作做基础，尽可能减少对胚胎的影响。 2.2 人胚胎干细胞系建立的影响因素 2.2.1 材料来源伦理问题及胚胎来源的限制束缚着人胚胎干细胞系的建立。人胚胎干细胞建系所用的基础胚胎，绝大多数都是来自辅助生殖临床助孕成功后患者自愿捐赠的冷冻胚胎，少部分是直接捐赠于科研的胚胎，这些胚胎来源的干细胞系远不能满足科学研究以及临床试验的需要。早在2003年，国外有报道可利用废弃胚胎建立人类胚胎干细胞系[37]。2008年，Lerou等[38]用常规临床实践过程中被废弃的劣质胚胎成功建立了人胚胎干细胞系。因此，认为体外受精治疗中质量较差、发育潜能低、发育迟缓的胚胎仍具有发育潜能，部分胚胎可以发育成囊胚，这些低质量的胚胎也可成为人胚胎干细胞的另一来源。此后，研究人员开始纷纷尝试用临床上人废弃胚胎作为胚胎干细胞建系的材料来源[39]，有效的缓解了建立人胚胎干细胞库过程中胚胎缺乏的问题。国内梁菊艳等[40]最早报道利用废弃胚胎继续囊胚培养研究，为如何选择废弃胚胎培养提供了依据。薛侠等[41]探讨了人胚胎移植后剩余胚胎继续体外培养的价值，可以最大限度地节约资源，同时也可评估胚胎体外继续发育潜能，为干细胞的研究提供资源。杨华等[42]探讨应用卵裂期废弃胚胎培养建立人胚胎干细胞系的方法，研究发现部分废弃的卵裂期胚胎仍具有发育形成囊胚的潜能，并可利用所得的囊胚采用全囊胚培养法建立稳定增殖的人胚胎干细胞系。陈红等[43]研究发现部分低形态学评分的D3废弃胚胎可发育成囊胚，囊胚形成率与形态学评分相关，这些胚胎可作为建立人胚胎干细胞系的材料来源之一。但由于废弃胚胎的发育潜能普遍较差, 选择何种胚胎培养更为高效及囊胚形成率达到多少才能证明培养系统合格，尚未见系统报道。温烯等[44]开始利用废弃胚胎进行囊胚培养的研究，探讨临床上D3丢弃的低质量胚胎培养至囊胚的发育潜能，发现胚胎卵裂球数越多，囊胚形成率越高，胚胎级别越低，囊胚形成率越低，但此方面的研究仍需扩大样本量进行研究探索。 2.2.2 胚胎干细胞所具备的生物学特性从形态学特性来说，胚胎干细胞的形态结构、生长特性及核型与早期胚胎细胞具有相似性。另外，还有其他基本特性，如具有无限自我更新和三胚层多向分化的特性，在胚胎状态下能无限制的分裂增殖；保持高度长期的未分化状态和发育潜能性；可在体外培养条件下建立稳定的细胞系，在适宜的培养条件下具有分化成多种细胞和组织的潜能；具有可操作性能，细胞在体外可以进行遗传操作，易于进行基因改造操作[45]。 2.3 人胚胎干细胞的实验研究现状及临床应用前景 2.3.1 人胚胎干细胞的实验研究现状到目前为止，已发现人胚胎干细胞可被成功诱导分化为造血母细胞[46]、心肌细胞[47-49]、内皮细胞[50]、肌细胞[51]、分泌胰岛素细胞[52]、神经细胞[53-54]，为胚胎干细胞分化细胞的移植研究与应用奠定了实验基础。 2.3.2 人胚胎干细胞的临床应用前景人胚胎干细胞具备发育分化形成胎儿和成体的所有类型组织细胞的能力，利用它有可能在体外培育出特异组织细胞，这种细胞是与供体遗传特征完全相同的细胞，可移植取代体内死亡或无功能的细胞[55-56]。任何涉及丧失正常细胞的疾病都可通过由胚胎干细胞分化而来的例如神经细胞、心肌细胞、肝脏细胞、骨髓、心肌甚至肝脏、肾脏等进行移植治疗，给帕金森综合征、脊髓损伤、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病、肝硬化、白血病、青少年糖尿病、器官衰竭等疾病带来希望[57-58]，尤其是糖尿病移植胚胎干细胞治疗效果更好。"

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