2.1 纳入文献基本情况 文献[1-9]研究了鹿茸再生的组织学基础及鹿茸再生的组织学过程；文献[9-15]研究了鹿茸干细胞的发现及干细胞鉴定结果；文献[16-19]研究了鹿茸干细胞所处微环境及微环境各组分间的相互作用；文献[20-31]研究了多种生长因子对鹿茸干细胞及微环境的影响。文献[32-36]研究了鹿茸多肽在皮肤伤口愈合及软骨细胞和成骨样细胞增殖中的作用，及鹿茸多肽对骨伤愈合刺激作用和延缓关节软骨的退变作用。 2.2  鹿茸再生的组织基础 组织学研究发现，鹿角脱落前期，在纵向切面上角柄远端部分变得粗糙且血管化明显。鹿角部分的陷窝苏木精-伊红染色较深，而角柄部分的陷窝颜色较浅，可以清晰地用一条虚拟的黑线将死的鹿角和活的角柄区分开来[1]。角柄的远端的皮肤紧密地覆着在骨质上，没有发现皮下存在疏松结缔组织。鹿角一旦脱落，角柄残桩远端的皮肤随即肿胀并向内迁移以覆盖于断面。这一皮层从外观上看，已经类似于茸皮：油亮且毛发稀疏。组织学分析显示，茸皮的表皮较厚并已经新生了毛囊和大的皮脂腺[2]。与此层紧紧相连的角柄骨膜 (pedicle periosteum，PP)组织也开始增厚，其内部是分化活跃的区域。随着时间的推移，两个新月形的生长中心直接从增厚的远端角柄骨膜形成。一个在前部，另一个在后部。其内部是新生软骨组织，软骨组织上覆盖着一层增生的角柄骨膜细胞。在其后的生长过程中，两个生长中心分别形成了向前及向后的生长点。这两个生长点进一步生长就变成后来的鹿茸主干及眉枝。由鹿茸再生的组织学及形态学研究可以看出，在鹿茸再生的早期阶段，角柄皮肤和角柄骨膜都发生了增生及迁移。驱动鹿茸再生的生长中心则是角柄骨膜细胞的直接衍生物，原角柄骨质部分没有直接参与。然而，组织学及形态学的证据并不能确定鹿茸再生的组织基础就是角柄骨膜。但是，可以得出的结论是鹿茸再生不同于低等两栖生物的断肢再生，它没有经历断端所有细胞的反分化过程[3]，也不是由再生芽基(blasterma)所驱动的，而是增生的角柄骨膜衍生出的生长中心所驱动。因此，鹿茸再生是一种特殊的哺乳动物器官割处再生，很可能是基于干细胞的过程。另一个很有趣的现象是，角柄断面伤口的愈合过程中，在鹿场的开放环境中，如此大的一个创面(角柄直径5-8 cm)，很少有感染或者炎症的发生，因此角柄/鹿茸可以作为一个天然免疫研究模型。 通过对鹿茸再生过程的组织学及形态学研究发现，鹿茸的周期性再生源于角柄骨膜组织膨大而形成的生长中心。Li等[4]设计了一个巧妙的角柄骨膜剔除实验，从角柄残桩上完全剔除角柄骨膜组织，其后在角柄骨膜缺失的情况下观察鹿茸的再生情况。结果发现，在角柄骨膜完全剔除侧，一头鹿在整个生茸季节完全没有生茸的迹象，而对照侧角柄却长出了完整的三叉茸。另一个精巧的实验用以验证角柄的骨质部分是否参与了鹿茸再生，使部分剔除角柄骨膜，结果发现鹿茸的发生/再生出现在剩余角柄骨膜末端与其上覆盖着皮肤的交汇处，完全没有角柄骨质的参与。通过插膜实验将一块不透膜插入到骨质和覆盖的皮肤之间[5]，结果发现，插入的不透膜阻止了皮肤组织参与鹿茸的再生，所有3组不透膜插入组都再生出了无皮鹿茸。这些实验精准无误地将鹿茸再生的组织基础锁定为角柄骨膜，正是它驱动了每年周期性的鹿茸再生，没有皮肤和骨质的参与。 角柄骨膜无疑是驱动鹿茸再生的组织基础，但是包括角柄骨膜在内的角柄并不是与生俱来的。在青春期雄鹿的额外脊上有一块被称之为生茸区骨膜的组织，角柄则是它的直接衍生物。生茸区骨膜的发现被称之为鹿茸研究史上的里程碑[6]。将生茸区骨膜移植到鹿身体的其他部位，如前额或者前腿，可以在移植处形成完整的鹿茸，这种鹿茸和正常的鹿茸一样拥有角柄并能够每年周期性再生[7]。利用病毒载体对萌发前的生茸区骨膜进行LacZ标记[8]，结果发现随后生成的角柄及初角茸中，几乎所有类型的组织中都有Xgal阳性细胞的存在，包括间充质、前软骨、软骨、骨，说明角柄和鹿茸的组织细胞都来源于生茸区骨膜。将生茸区骨膜细胞进行长时间体外培养，能形成一个较大的透明状骨质柱。在组织学上，这些骨柱的结构井然有序，类似于角柄或鹿茸中的骨小梁。其中央区域较多的是分化了的细胞，它们活跃地形成胞外基质，在外围是分化程度低的梭形细胞[9]。生茸区骨膜无疑是一块极为特殊的组织，其内的细胞包含了鹿茸发生及再生所需的全部信息。另外，生茸区骨膜还具有类似胚胎组织的多能性，能衍生出间充质、前软骨、骨等多种组织。因此，决定鹿茸发生、再生的组织基础分别是生茸区骨膜及角柄骨膜，它们很有可能是一种多能干细胞组织。 2.3  鹿茸干细胞 生茸区骨膜无疑是一块极其特殊的组织，Li等[9]将生茸区骨膜总结为一块后生遗留的胚胎组织。因而，鹿茸的周期性再生是一种基于干细胞的过程，生茸区骨膜的直接衍生物角柄骨膜也是一种特殊的成体干细胞组织。最近的研究发现生茸区骨膜、角柄骨膜细胞都表达相当水平的胚胎干细胞特异标记物CD9，Oc4，SOX2和Naong[8]。另外，这两种细胞均有较高的端粒酶及Nucleostemin蛋白活性。端粒酶与细胞的自我更新能力紧密相关[10]。Nucleostamin的表达与干细胞增殖及蝾螈的芽基再生形成有关[11-12]。近期，研究表明角柄骨膜细胞还表达Stro-1[13]，一种间充质干细胞标记物。通过干细胞表面标记物测定，已经可以确定生茸区骨膜和角柄骨膜细胞均为特殊的成体干细胞。鉴定干细胞，另一个极具说服力的是分化潜能实验。已有数个不同研究小组对生茸区骨膜及角柄骨膜细胞的分化潜能进行了研究[14]。体外培养时，在微粒体培养体系中添加地塞米松和抗坏血酸，生茸区骨膜和角柄骨膜细胞都能分化为软骨细胞及成骨细胞[15]。有趣的是，当在生茸区骨膜及角柄骨膜的培养基中添加亚油酸或者在生茸区骨膜细胞培养基中添加兔血清时[14]，它们会分化为脂肪细胞。最近，通过与已知的C2Cl2肌肉祖细胞系进行共培养，成功地将生茸区骨膜细胞诱导为多核的肌肉前体细胞。在培养基中添加半乳糖凝集素1也能达到相同的效果。当生茸区骨膜细胞被培养在能够促进神经元分化的N2培养基时，它能够分化为神经元样细胞，在细胞的4周有类似神经轴突的结构。这些实验清晰地证明了，生茸区骨膜和角柄骨膜细胞，特别是生茸区骨膜细胞均具有多能性，在适当的条件下能分化为多种类型的细胞，因而，鹿茸再生是一种基于干细胞的割处再生过程。 2.4  鹿茸干细胞微环境及组分间相互作用 在每年的再生周期中，角柄骨膜中的干细胞被激活、应答以驱动周期性的鹿茸再生。一般而言，成体器官内干细胞的维持需要它们与周围已分化的细胞紧密相连，处于特定的构造中，也就是干细胞的微环境中。干细胞与外界环境通过一系列的外因子包括特异的细胞基质组分及结合生长因子等相互作用，以应对组织中间歇性有规律的自我更新，或者对一定情况的适当应答，如组织损伤，应答组织修复所需要的细胞群转移。干细胞微环境中特异的相互作用力是促发这一系列活动的关键。对鹿茸再生过程的解剖学及形态学研究表明，在鹿茸发生及鹿茸每年的再生过程中，均需要干细胞微环境的参与。 在研究生茸区骨膜萌发及异位茸形成的过程中，Goss等[16]发现生茸区骨膜组织上覆盖的皮肤构成了生茸区骨膜萌发所需的特定微环境。但是有3个部位的皮肤不能提供生茸区骨膜萌发所需的微环境，他们分别是鼻子前端(鼻镜)，尾巴腹面和鹿脊背中线的皮肤，而将生茸区骨膜移植到鹿身体其它任意部位皮下都诱导生茸区骨膜萌发形成异位鹿茸。最近的实验表明，裸鼠的皮肤也不能构成生茸区骨膜萌发所需的微环境，也不能和移植的生茸区骨膜相互作用，并将自身转化成茸皮[17]。将生茸区骨膜移植到鹿的后背，尾巴及裸鼠皮下，仅在皮下膨大形成骨粒。比较鹿的鼻镜，尾腹部皮肤，裸鼠的皮肤，可以发现它们几乎都缺乏毛囊。鹿的背部皮肤确有毛发存在，但这一区域几乎是鹿身上毛发最稀疏的部分，且其中以针毛居多，因此毛囊包括真皮乳突细胞在内一定在相互作用中发挥了重要作用。进一步研究发现在裸鼠模型中共移植生茸区骨膜和鹿皮，生茸区骨膜可以有效地诱导共移植的鹿皮表皮转化为茸皮表皮，这种转化只有在与真皮相连接皮下疏松结缔组织及部分真皮剔除的情况下发生[6]。生茸区骨膜与其上覆盖皮肤构成的微环境，不但可以将鹿皮转化为茸皮，反过来分化的茸皮也激活了生茸区骨膜的快速分裂繁殖。生茸区骨膜细胞的分化命运依赖于它们相对于皮肤内表面的位置。那些贴近内层皮肤的生茸区骨膜细胞分化成了有丝分裂静止干细胞，稍许远离的成了过渡性扩增细胞，更远的分化成了前软骨细胞。鹿皮的相关特性在最近的生茸区骨膜移植实验中也有发现。实验中，将生茸区骨膜组织翻转后移植皮下(使生茸区骨膜细胞层正对皮肤)，自然条件下应分化为过渡性扩增细胞的内层生茸区骨膜细胞却成了分裂静止的干细胞，而外层生茸区骨膜细胞发育成了过渡性扩增细胞[18]。因此，这一微环境中各组分间的作用是相互，必然存在着交换信息的信号物质。下一步的研究如果能够在体外条件下模拟3种不同的干细胞微环境：生茸区骨膜与茸皮相互作用微环境，生茸区骨膜与普通鹿皮相互作用微环境，生茸区骨膜与非萌发皮肤相互作用微环境(鼻镜/后背/尾巴腹部)，并探索体外微环境中各种游离小分子物质的差异并研究其功能,必将有助于探索鹿茸再生之谜。 鹿茸的再生同样也需要角柄骨膜被其上覆盖的皮肤通过物理或化学的方法来激发。在研究角柄骨膜组织采样技术时，Li等[19]发现沿着角柄从远端到近段皮肤和角柄骨质的结合程度是不一样的。近端角柄皮肤和角柄骨膜是疏松结合的，而远端是紧密结合的。由于先前的研究已经发现，生茸区骨膜和其上覆盖皮肤紧密结合是鹿茸发生的先决条件。那么鹿茸的再生是否也需要角柄骨膜和其上皮肤的紧密结合？这样的结合是否也是有助于相关信号分子到达靶位点以诱导鹿茸再生？如果这个假设成立，那就不难解释为什么角柄远端区域角柄骨膜和其上的皮肤结合非常紧密而近段比较疏松。也就是说，不同的结合程度说明了角柄骨膜不同的应激状态，紧密结合区的角柄骨膜是已经致敏的，在条件具备是可以立即驱动鹿茸的再生，这样的结合也有助于相关信号分子的传递；而疏松结合区域的角柄骨膜是还没有被其上皮肤所致敏的。为了验证这个假设，再次进行了插膜实验[6]。插膜前，在紧密及疏松结合域的交界处截去远端部分从而人为制造了一个角柄残基。为确保截断的正确，沿着角柄的长轴做了一个纵向的皮肤切口以确定疏松和紧密结合的边界。当疏松结合域的角柄骨膜和其上的皮肤被不透膜有效阻隔时，鹿茸再生被有效地抑制了，而阴性对照侧却长出了一个完整的二杠茸。而紧密结合域的膜插入却未能阻碍鹿茸的再生，没有皮肤的参与角柄骨膜长出了一个无皮茸，与疏松区插膜实验形成了鲜明的对比。实验的结果证明了，远端紧密结合区域的角柄骨膜已被致敏，隔离其和皮肤的信号传递并没有能够抑制鹿茸的再生。但是疏松区的信号交流通道一旦阻塞，鹿茸再生即停止。下一步的研究，应该集中于如何寻找抑制鹿茸再生的信号因子。 总而言之，鹿茸的发生及再生都需要有适宜的皮肤参与，这种需求与不同鹿茸组织类型无关，而与鹿茸生成组织的结合程度有关，以驱动扩散诱导因子的分泌。鹿茸生成细胞接受这些信号后，快速增殖及分化以构建鹿茸组织。 2.5 细胞因子与鹿茸再生 鹿茸再生是一种基于干细胞的过程，这种干细胞定位于鹿的角柄骨膜中。研究发现，干细胞微环境及其相互作用在鹿茸再生中起着至关重要的作用。这种相互作用很可能是通过多种生长因子在起作用。研究发现，类胰岛素生长因子在快速生长的鹿茸尖部各个分层：表皮/真皮层、间充质层、前软骨层、软骨层都有表达，但是表达量存在着差异。在真皮/表皮层中，胰岛素生长因子1的含量都比其他三个层中的高[20]。原位杂交和免疫组化发现胰岛素生长因子1在鹿茸尖端及上部的软骨细胞及成骨细胞中均存在阳性信号。然而，在中间及底部部分，胰岛素生长因子1仅在骨组织周围的成骨细胞中刚刚可以检测到[21]。在体外培养时，通过放射性标记发现胰岛素生长因子1对鹿茸软骨膜细胞、鹿茸间质细胞、鹿茸软骨细胞都有促有丝分裂作用[22]。进一步研究发现，鹿茸被锯掉后鹿血浆中的胰岛素生长因子1浓度迅速升高，这表明鹿茸中存在胰岛素生长因子特异性结合位点，远距分泌途径产生的胰岛素生长因子通过血液循环对生长的鹿茸产生作用，刺激鹿茸的快速生长。直接的证据是表皮/真皮层中胰岛素生长因子的含量明显高于其他分层，而且越远离表皮/真皮层含量越低，到骨化区域仅在骨组织周围的成骨细胞中刚刚可以检测到。因而，随着胰岛素生长因子在鹿茸中由尖部到基部含量的下降，各个部分相应的增殖潜能也下降。但是，胰岛素生长因子是如何影响鹿茸快速增殖的，是通过单一的靶位点还是多个信号通路，这一方面的研究还不是非常明确。另一方面，鹿茸的生长周期、体内的胰岛素生长因子水平周期以及性激素周期之间存在着微妙的关系。Suttie等[23-24]报道周期性胰岛素生长因子1水平与角柄及初角茸的生长存在显著地正相关。鹿茸的快速生长期总出现在睾酮周期的低水平期，而在胰岛素生长因子1的高水平期或上升期[23]，对生茸期的雄鹿去势并不影响鹿茸的生长。然而在体外的无血清培养基中无论是在正常的生理水平还是低谷期睾酮对来源于鹿茸增殖层的细胞都没有直接的促有丝分裂作用。并且，在体外条件下大范围的睾酮浓度并不能促进这些细胞的有丝分裂，但在一定的浓度下(0.1-5.0 nmol)能够降低胰岛素生长因子1的促有丝分裂作用[25]。 鹿茸拥有不可思议的生长速度，在一些大的鹿种中可达到1.0-2.0 cm/d[26]。鹿茸的延长是通过间质细胞的快速分裂和软骨内成骨重塑进行的。TUNEL检测发现在软骨膜，未分化的间充质和鹿茸软骨膜细胞中凋亡的比例较高，而皮肤细胞中凋亡比例低[27]。其中，间充质层TUNEL阳性细胞高达64%这比任何报道的成体组织中的含量都要高。有趣的是，较高的增殖速率恰恰也保持在间充质细胞，皮肤(尤其是毛囊中)和骨膜的细胞中；在软骨膜和骨膜组织的纤维层中，增殖的速率较低，在软骨组织几乎没有。在间充质层细胞中同时存在高度的细胞凋亡及增殖表明这一区域是鹿茸的生长区。这种大范围的细胞程序性死亡及增殖反映了器官发生和组织重塑之间异乎寻常的同步速率，因而，内在的或者系统的调控因子保持着鹿茸组织中生长和凋亡之间的平衡，这正是下一步需要进行研究的重点。检测凋亡相关基因发现，在鹿茸软骨膜/间充质和非矿化的软骨中bcl-2和bax的表达量均比皮肤和矿化的软骨中的高[27]。免疫组化发现，bax表达于间充质，成软骨细胞，软骨细胞，成骨细胞，骨细胞和破骨细胞中。也就是说，在鹿茸的快速再生过程中伴随着细胞的程序性死亡，这一现象贯穿于鹿茸骨骼的发育、生长及重塑过程。这也许可以解释为什么鹿茸保持着惊人的生长速率而不发生癌变。 鹿茸是一种特殊的骨组织，在其纵切面上由远端至近端依次可分为表皮/真皮层、间充质层、前软骨层、过渡区、软骨层及骨。鹿茸免疫组化研究发现，表皮生长因子(EGF)定位于鹿茸的皮肤、间充质、软骨细胞中以及成骨细胞系包括成骨前体细胞，成骨细胞，破骨细胞中。表皮生长因子受体(EGFR)同样表达于间充质、软骨和成骨细胞中[28]。在皮肤中，表皮生长因子受体的分布更加广泛，在真皮层深处的细胞中强烈表达，但在浅层却没有，在真皮细胞的细胞核及其附属物中也没有信号。表皮生长因子受体在覆盖物中的分布和人类皮肤中情况类似。相反，在发育的鹿茸软骨中，信号的分布和啮齿类胎骨类似，这说明，在成体条件下，覆以茸皮的鹿茸中快速生长的软骨具有类似胚胎软骨的特性。鹿茸另一个引人注目的特性是具有血管化的软骨。这是任何其他软骨组织所不具备的。Clark等[29]通过血管造影发现鹿茸中血管大多为动脉，它们主要分布于真皮内准确讲是真皮的底部，也就是所谓的血管层。这些血管来源于鹿茸的基底穿行于真皮内几乎不分叉。它们在鹿茸尖部开始变弯曲并开始分叉。鹿茸尖端的大量血管分支产生了前软骨，软骨，及骨中的静脉血管。有两种理论来解释这一现象。一种可能性是血管延伸，主动脉沿着管槽或管槽上特定的位点通过内皮细胞和支持细胞的增殖自我进行生长。另一种可能是新生血管或摄入性重塑导致的血管萌发，由细小的分支融合，或者由主动脉迁徙分支。血管内皮生长因子是一种高度特异的内皮细胞有丝分裂源，可通过与血管内皮细胞上的受体结合，对内皮细胞发挥强烈的促分裂和趋化作用；同时，血管内皮生长因子可提高血管通透性，使内皮细胞接受刺激因子的作用增强。检测发现鹿茸中存在血管内皮生长因子121和血管内皮生长因子165，且在鹿茸的前软骨和软骨层发现血管内皮生长因子 mRNA的存在[30]。已发现的血管内皮生长因子受体有3种：Fl-t 1(fms-like yrosinekinase-1，VEGFO1)、KDR(kinase domain region，VEGFRO2)、Fl-t 4(VEGFRO3)。三者均属酪氨酸激酶受体，主要分布于内皮细胞。在鹿茸前软骨区域的内皮细胞中有KDR的mRNA存在。这一发现和血管内皮生长因子在鹿茸中有促血管生长作用相吻合。另一个有趣的发现是再生鹿茸中的神经总是跟随着血管的生长。Li等[31]探索鹿茸中神经分布时发现，再生的轴突沿着主要的血管分布，位于真皮层和鹿茸间充质的交界处。神经生长因子mRNA表达于再生的鹿茸中，尤其是鹿茸尖部动脉及微动脉的平滑肌细胞中。因此，鹿茸中血管化软骨中血管的新生或者延伸，很可能是神经调控的，而血管的生成又为神经的快速生长提供了基础。揭示两者的关系，有可能为骨损伤修复和多种软骨疾病的治疗提供新的思路和方法。 近年来，国内的学者对鹿茸多肽进行了广泛的研究，发现其对刺激皮肤生长及骨伤愈合有明显的作用。鹿茸多肽是采集新鲜的梅花鹿鹿茸或马鹿鹿茸，从中提取出的多肽类生物活性因子，为鹿茸的主要活性成分。牛琼等[32]报道称，鹿茸多肽能够显著提高实验鹿部伤口的皮肤愈合速度。鹿茸多肽除能刺激皮肤伤口愈合，对软骨细胞及成骨样细胞的增殖也有明显加速作用，研究结果表明：在体外条件下，10-50 mg/L 鹿茸多肽能明显刺激兔肋软骨细胞和人胚关节软骨细胞及鸡胚成骨样细胞的增殖，其增殖作用有明显的量效关系且无种属特异性[33]。另外，鹿茸多肽对人骨髓间充质干细胞的增殖有明显促进作用, 且能防止骨髓间充质干细胞在体外连续培养过程中异行性的产生，鹿茸多肽的这种特性为种子细胞的优化提供了理论和实验依据[34]。周利秋等[35]通过构建大鼠实验性挠骨骨折模型,研究发现鹿茸多肽可以通过促进骨、软骨细胞增殖及促进骨痂内骨胶原的积累和钙盐沉积而加速骨折愈合。在兔膝骨性关节炎模型中，鹿茸多肽对可抑制膝骨性关节炎过程中软骨细胞凋亡，降低关节液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的水平，一定程度上延缓关节软骨的退变[36]。上述这些结果与Suttie等[23-24]的发现可能存在着某种联系，发现在再生的鹿茸尖部间充质区域存在着大量的Ⅰ及Ⅱ胰岛素样生长因子及其受体。现已知胰岛素样生长因子是一种来自多种组织的，具有促进软骨组织生长的调节因子。另外，生长的鹿茸尖部还存在表皮生长因子这就也许能够解释鹿茸多肽为什么可以促进皮肤伤口愈合[28]。但是，鹿茸多肽是新鲜鹿茸中提取的小肽物质的混合物，其具体的作用物质及其机制现在尚不明确，与鹿茸中已经发现的多种生长因子之间的联系也只是推测，另外鹿茸中现已发现的多种生长因子均在其他组织中发现，并没有一种是鹿茸中所特有的，因此鹿茸或鹿茸多肽的神奇效果可能是几种物质混合作用的结果，其具体的机制还需要更多实验数据的支持。"