2.1   神经纤毛因子1结构   神经纤毛因子1最初是作为神经元导向和突触形成的因子而被人们认识，近年来人们发现神经纤毛因子1在骨折愈合过程中也发挥重要的作用。 神经纤毛因子1存在于大部分的脊椎动物中，是相对分子质量约为1.3×105的跨膜糖蛋白，神经纤毛因子1分为胞外区、跨膜区和胞内区3部分。神经纤毛因子1蛋白从N端到C端分别是a1、a2、b1、b2、c、跨膜区、胞内区。a1和a2主要结合信号素3，少部分信号素3也结合b1，b1 和 b2 主要结合凝血因子Ⅴ/Ⅷ、血管内皮生长因子及其受体、转化生长因子β及其受体、血小板衍生生长因子及其受体、肝细胞生长因子及其受体、Ca2+、CendR肽等符合C端规则的因子[2-4]；疏水的跨膜区参与神经纤毛因子1二聚体化。胞内区包含一个有突触后密度蛋白95、Discs蛋白和紧密连接蛋白ZO-1组成的PDZ膜序，羧基端有丝氨酸谷氨酸丙氨酸三联体[2]。胞内区可结合多因子而发挥作用，例如GIPC-PDZ结构域含家族成员1、SRC同源性3结构域结合蛋白4、突触蛋白、整合素α5、突触后密度蛋白95、Discs蛋白和紧密连接蛋白ZO-1等[5-7]。另外，神经纤毛因子1还结合Raft交联蛋白和半乳糖凝集素1 [8-9]。见图3(此图由Figdraw绘制)。神经纤毛因子1蛋白一旦合成很稳定，主要通过Ras相关蛋白Rab11A依赖性途径(“慢循环”)进行蛋白回收[10]。神经纤毛因子1蛋白翻译后进行包括糖胺聚糖修饰等糖基化修饰及甲基化修饰等[11-12]。"

2.2   神经纤毛因子1在骨折愈合中促进血管再生    2.2.1   神经纤毛因子1与动脉毛细血管细胞   毛细动脉血管生成是骨折愈合的关键事件，毛细动脉血管由内皮细胞和周细胞组成。神经纤毛因子1缺陷会导致外周微血管病变和血管生成障碍[13-14]。神经纤毛因子1促进内皮细胞迁移，在细胞迁移过程中，神经纤毛因子1激活细胞外基质中的细胞分裂周期因子42，使内皮尖端细胞形成丝状伪足，从而促进血管内皮迁移[15]。REZAEI等[4]研究发现在人脐静脉血管内皮细胞中，C型凝集素相关蛋白视多西素-αβ诱导神经纤毛因子1激活下游通路，导致细胞骨架增多、细胞硬度增强，促进了细胞间力传递，加速血管内皮细胞的迁移。神经纤毛因子1上调二甲基精氨酸二甲氨基水解酶的表达,降解不对称二甲基精氨酸蛋白,从而发挥维持血管稳态的作用 [16]。见图4。"

周细胞是包裹毛细血管和小静脉内皮细胞的可收缩细胞，在维持血管稳定性和完整性方面发挥着至关重要的作用。神经纤毛因子1对周细胞的稳定有重要作用。经己烯雌酚治疗的小鼠，出现子宫毛细血管幼稚化以及周细胞较少的现象；这是因为血管内皮因子受体2和共受体神经纤毛因子1等血管生成因子浓度低，最终造成血管密度低和脉管系统不成熟[17]。 2.2.2   神经纤毛因子1与两种生长因子   在骨折愈合的过程中,神经纤毛因子 1 通过促进血管内皮细胞和周细胞生长而发挥促血管作用,这种作用与血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子这两种因子密切相关。首先，神经纤毛因子1通过血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子途径发挥促进血管内皮生长的作用。血管内皮生长因子包括A-E以及胎盘生长因子共6种，神经纤毛因子1可以通过血管内皮生长因子促进血管出芽、成管[18]。血管内皮生长因子受体有3种，其中血管内皮生长因子受体1，2与血管内皮细胞关系紧密，而血管内皮生长因子受体3与淋巴内皮细胞关联较多。在没有内皮糖蛋白等配体情况下，神经纤毛因子1优先与细胞内的血管内皮生长因子受体1结合；在有配体情况下，神经纤毛因子1优先与细胞膜上的血管内皮生长因子受体2结合[10，18]。神经纤毛因子1与血管内皮生长因子及其受体等形成复合物会进一步募集相关因子，例如神经纤毛因子1/血管内皮生长因子复合物触发胰岛素样生长因子1受体相互作用蛋白1、突触蛋白、Ras同源基因家族成员A/Ras同源基因家族成员A相关蛋白激酶、有丝分裂原活化蛋白激酶激酶3/6级联反应来激活p38丝裂原活化蛋白激酶[7]。COLOTTI等[19]发现神经纤毛因子1与血管内皮生长因子受体1，2互相作用，并且参与整合素α5β1/可溶性血管内皮生长因子受体1复合物介导的内皮细胞黏附和迁移。在血管的生成过程中，神经纤毛因子1与血管内皮生长因子关系密切，共同发挥促进血管生长的作用。H型血管作为毛细血管的一种亚型，可能也接受神经纤毛因子1与血管内皮生长因子的促进作用。血小板衍生生长因子可促进内皮祖细胞的迁移和分化，增强了H型血管和骨骼的形成[20]。血小板衍生生长因子BB可诱导骨膜蛋白表达和募集，促进骨和H型血管再生[21]。神经纤毛因子1可通过血小板衍生生长因子发挥促进H型血管生长的作用。 其次，血小板衍生生长因子与周细胞之间有密切的关系。神经纤毛因子1与血小板衍生生长因子D结合可移位到内皮细胞的连接处。并且，在血小板衍生生长因子D的诱导下，神经纤毛因子1与血小板衍生生长因子受体β相互作用(在内皮细胞和周细胞之间)，作为血小板衍生生长因子D-血小板衍生生长因子受体β的辅助受体，在周细胞的细胞通讯中发挥一定作用[22]。DHAR等[23]研究发现神经纤毛因子1与血小板衍生生长因子B互相作用，将周细胞募集至新生血管处，促进血管再生。 2.2.3   神经纤毛因子1与H型血管   H型血管由垂直排列的血管柱组成，并且通过血管环或拱门连接形成网状结构，是一类高表达血小板内皮细胞黏附分子和内皮黏蛋白的动脉毛细血管，主要由血管内皮细胞和周细胞组成，主要存在于长骨的干骺端和内膜等骨生成活跃的区域，在骨-血管偶联中起到关键作用，也是促进骨折愈合的新靶点之一[24-30]。H型血管是动脉毛细血管的一种亚型，神经纤毛因子1促进动脉毛细血管中内皮细胞迁移和周细胞稳定性，而神经纤毛因子1是否促进H型血管生成有待进一步研究。破骨细胞、成骨细胞、软骨细胞和内皮细胞通过分泌血小板衍生生长因子BB促进H型血管生长，内皮细胞还可以分泌血管内皮生长因子促进H型血管的生长，而神经纤毛因子1作为2种因子的共受体，是否也通过血管内皮生长因子途径、血小板衍生生长因子途径促进H型血管生长有待进一步研究。 2.3   神经纤毛因子1在骨折愈合中对骨的作用    2.3.1　神经纤毛因子1与骨细胞  成骨细胞、破骨细胞、肥大软骨细胞等是完成骨折愈合的主要骨细胞，其中成骨细胞是数量最多的细胞。成骨细胞和胶原纤维组成编织骨，形成板状骨，最终完成骨折愈合。破骨细胞不仅吸收骨折端无活动的骨片，而且会在骨折断端堆积Ca2+，为成骨细胞提供必需的营养。肥大软骨细胞在软骨痂变为硬骨痂时候逐渐凋亡，协同编织骨的形成。 在骨折愈合过程中，骨细胞中神经纤毛因子1有着重要的作用。CHOE [31]研究发现内胚层缺乏神经纤毛因子1会导致斑马鱼面部软骨严重缺陷。ZHOU等[32]以中国汉族400名绝经后妇女为研究对象，采用靶向二代测序技术进行检测，发现神经纤毛因子1 rs2070296与股骨颈的骨密度/骨质疏松风险显著关联、神经纤毛因子1 rs180868035与腰椎和股骨颈的骨密度显著关联；神经纤毛因子1 rs180868035转染的成骨细胞/破骨细胞与野生型相比，突变细胞的成骨标志物表达降低而破骨标志物的表达升高；另外，突变体神经纤毛因子1 rs180868035转染减缓成骨细胞增殖，促进其凋亡，而对破骨细胞有相反作用。HAYASHI等[33]通观察肢体间充质中信号素3A表达缺失的转基因小鼠出现骨体积显著降低、骨吸收高、骨形成低的情况，进而观察信号素 3A与神经纤毛因子1作用被切断的转基因小鼠，发现小鼠的骨量减少；他们采用可溶性鸟苷酸环化酶信号刺激因子模拟信号素3A的作用，结果显示神经纤毛因子1表达升高，骨质疏松症得到改善。ZHANG等[34]发现MC3T3成骨细胞在高糖干预下，信号素3A及神经纤毛因子1的表达降低，成骨分化被抑制；通过补充神经纤毛因子1的配体SEMA3A，可增加MC3T3以及糖尿病动物中的成骨细胞标志物表达，同时动物的骨密度和骨量也增加。PAN等[35] 研究发现敲除miR-148a的小鼠破骨细胞减少、骨量增加；而神经纤毛因子1是miR-148a的靶点蛋白，即敲除 miR-148a会诱导神经纤毛因子1表达升高从而增加骨量。木犀草素通过促进信号素3A、神经纤毛因子1表达最终增强了成骨细胞标志物的表达[36]。神经纤毛因子1过表达会引起成骨细胞中碱性磷酸酶、骨钙素、骨保护素、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2等成骨标志蛋白表达上调和破骨细胞的形成和分化减缓，从而最终起到增加骨量的作用[36-37]。神经纤毛因子1高表达会减少脂多糖对ATDC5软骨细胞样细胞的损伤，减少细胞凋亡和细胞外基质降解[38]。神经纤毛因子1低表达导致成骨细胞数量减少，软骨细胞增殖率降低，细胞黏附增加，细胞衰老程度增加[35，39]。髓核祖细胞/间充质干细胞通过神经纤毛因子1相关的级联反应发挥骨修复和维持骨稳态作用[40]。另外，H型血管的内皮细胞表达更高的转化生长因子β，这些因子可以促进骨祖细胞存活和增殖[24]，而神经纤毛因子1也是转化生长因子β的受体，神经纤毛因子1是否通过H型血管促进骨细胞生长有待进一步研究。具体见表1。"

2.3.2   在骨折愈合过程中发挥作用的神经纤毛因子1的上下游分子   在骨折愈合过程中，神经纤毛因子1上下游有一些关键分子。神经纤毛因子1上游正调控因子有肺腺癌转移性相关转录本1等 [41]，神经纤毛因子1负调控因子有miR-148a、miR-320a、miR-485-3p等[35，41-42]。神经纤毛因子1下游有神经丛蛋白A1、盘状蛋白结构域受体酪氨酸激酶2以及Runt相关转录因子2、骨钙素、骨桥蛋白等骨标志蛋白。神经纤毛因子1通过抑制盘状蛋白结构域受体酪氨酸激酶2的降解，促进其表达[43]。神经纤毛因子1正调控Runt相关转录因子2、骨钙素、骨桥蛋白、细胞外信号调节激酶[43-44]。具体见表2。 2.4   神经纤毛因子1在骨折愈合中促进骨-血管偶联    2.4.1　神经纤毛因子1是成骨-破骨细胞偶联的关键因子  神经纤毛因子1作为信号素3A的受体，既可以通过抑制破骨细胞的核因子κB受体活化因子配体抑制破骨细胞分化，也可以通过WNT/β-连环蛋白等途径促进成骨分化[44]。神经纤毛因子1是调节性T细胞的表面标志物。免疫细胞的神经纤毛因子1与其配体信号素4类蛋白A在调节性T细胞上相互作用，增强了调节性T细胞的功 能[45]。神经纤毛因子1在骨折愈合的过程中是否也接受信号素4类蛋白A的调控，而免疫系统和成骨-破骨细胞之间有何联系，有待于进一步的研究。 2.4.2　神经纤毛因子1是骨-血管偶联的关键因子  在骨组织再生过程中，骨-血管偶联是非常关键的，神经纤毛因子1也参与了骨-血管偶联。MC3T3-E1成骨细胞表达神经纤毛因子1 mRNA并与血管内皮生长因子A中的血管内皮生长因子165亚型结合。在成骨细胞中，血管内皮生长因子165亚型与成骨细胞的结合是严格依赖神经纤毛因子1的。?AB?D?-MAS?OWSKA等[46]发现间充质干细胞产生的细胞外泌体中有神经纤毛因子1等蛋白，这些细胞外泌体在体外有抑制毛细血管内皮细胞凋亡和促进血管形成、增强淋巴内皮细胞形成淋巴管的作用；他们对后肢严重缺血的小鼠采用细胞外泌体治疗后，发现小鼠损伤后肢的血管数目增加，血流得到恢复，同时淋巴管的形成也增多。但是，在骨折愈合过程中，神经纤毛因子1发挥促进骨-血管偶联的具体机制有待进一步明确。 2.4.3  其他促骨-血管偶联的因子  骨-血管偶联因子还有缺氧诱导因子1α、血小板衍生生长因子B、狭缝同源物3蛋白、鞘氨醇-1-磷酸受体、乳铁蛋白等。缺氧诱导因子1α是强大的骨-血管偶联因子，也是血小板衍生生长因子B上游的关键因子[47-49]。LIU等[50]研究发现1- 5 mmol/L的镁离子促进人脐静脉血管内皮细胞的小管形成，并且促进成骨细胞系MC3T3-E1分泌血小板衍生生长因子BB，促进成骨细胞的迁移以及碱性磷酸酶的表达，这显示血小板衍生生长因子可能是骨-血管偶联的关键因子。狭缝同源物3蛋白是小鼠模型和人类工程组织中的促血管生成因子。LI等[51]、XU等[52]研究发现狭缝同源物3蛋白来源于成骨细胞，重组的狭缝同源物3蛋白可以促进骨折愈合，可促进绝经后骨质疏松小鼠的断骨再生、减少骨质流失，这说明狭缝同源物3蛋白可能是骨-血管偶联的关键因子。ZHENG等[53]、YANG等[54]研究发现：①与野生型小鼠相比，过表达miR155的小鼠中长骨骨量低，骨折愈合缓慢；②敲除miR155的小鼠骨量高，骨折愈合迅速；③miR155作用的靶点是鞘氨醇-1-磷酸受体，激动鞘氨醇-1-磷酸受体会促进H型血管和骨再生，miR155 通过与鞘氨醇-1-磷酸受体基因的作用发挥减弱成骨和骨量的作用。鞘氨醇-1-磷酸受体在内皮细胞中分布，并且介导细胞增殖、迁移、分化和凋亡等，参与血管的形成，是重要的调节血管的因子[55]，鞘氨醇-1-磷酸受体可能是骨-血管偶联的关键因子。乳铁蛋白是一种转铁蛋白，早期研究就表明它可以促进血管内皮细胞增殖和迁移、促进血管生成，最近研究发现其通过SMAD家族2/3-P38促进成骨细胞和软骨细胞的增殖和分化[56-58]。 神经纤毛因子1在骨折愈合中是否与缺氧诱导因子1α、血小板衍生生长因子B、狭缝同源物3蛋白、鞘氨醇-1-磷酸受体、乳铁蛋白等其他相关骨-血管偶联因子有联系？这些骨-血管偶联因子之间是否有网状的联系？这些骨-血管偶联因子与成骨-破骨偶联因子之间是否有联系？如何发挥作用？这些仍有待进一步的研究。 "