2.1 双相磷酸钙陶瓷化学组成对骨诱导性的影响 目前研究表明，材料中钙磷离子的降解/再沉积是双相磷酸钙陶瓷具有骨诱导性的重要影响因素，生物陶瓷的化学组成影响降解/再沉积的速率及其生物活性。Wu等[15]通过控制烧结温度合成羟基磷灰石及含有不同含量磷酸三钙的双相磷酸钙陶瓷，观察置入蒸馏水中不同时间点材料的降解及再沉积情况，发现羟基磷灰石在3 d和28 d均未出现明显降解，含有较少磷酸三钙的双相磷酸钙陶瓷在3 d未出现明显降解，而   28 d时出现了孔隙的增大，提示材料出现了降解，随磷酸三钙含量的进一步增高，材料降解现象更明显，且在早期就出现了片状的磷灰石沉积并随时间延长沉积量增大，提示降解后的材料出现了再沉积。Daculsi等[16]将羟基磷灰石、双相磷酸钙陶瓷、磷酸三钙陶瓷植入兔、小鼠、大鼠皮下，观察到磷酸钙陶瓷溶解现象，且溶解之处有新晶体形成，新形成的针状微晶体与磷酸钙陶瓷本身的晶体结合在一起，红外吸收光谱鉴定新形成的晶体为碳磷灰石，与骨组织的磷灰石晶体相似。目前认为生物陶瓷中钙磷离子的释放是其生物活性的来源，磷灰石层的沉积对骨组织的生成具有促进作用[17-18]。Yuan等[8]将孔隙结构相似的羟基磷灰石和双相磷酸钙陶瓷分别植入犬大腿肌肉内，发现虽然两组材料成骨过程相似，但双相磷酸钙陶瓷中成骨的发生要早于羟基磷灰石。其原因可能为双相磷酸钙陶瓷中含有溶解性更好的磷酸三钙，钙磷离子释放得较多，使位于肌肉组织局部微环境中的钙磷离子浓度较早达到过饱和状态，进而较早发生磷灰石的沉积。Habibovic等[9]将双相磷酸钙陶瓷和碳磷灰石植入山羊背肌中，虽然碳磷灰石的化学组成与骨组织更为相似，但在碳磷灰石中并未观察到新骨形成，分析原因可能为虽然碳磷灰石较快的降解速率可为骨生成提供一个富含钙磷的微环境，然而其孔隙结构无法保持稳定，因此影响了材料骨诱导性的发生。       大量体内外研究表明，在骨组织工程支架的应用中羟基磷灰石化学性质稳定，能够为骨组织生长提供支架，但其降解吸收较慢，不能为新骨形成提供富含钙磷离子的微环境；磷酸三钙及碳磷酸钙等降解速度虽较快，但其降解后对支架材料的结构会产生明显的影响，也不利于新骨的形成。双相磷酸钙陶瓷由羟基磷灰石和β-磷酸三钙组成，通过对其组成比例和制备条件的优化可以形成较为理想的组织工程支架，并具有适宜的降解/再沉积速率，从而在促进骨组织生长的同时保证生物材料结构的稳定性[19]。另外，某些盐类离子的替换可以调控降解速率，例如碳酸根和硅酸根替代的磷酸钙相比于化学计量的羟基磷灰石具有较快的降解速率[20]。     另外，有研究显示生物陶瓷的化学组成会影响蛋白吸附。Zhu等[21]合成晶体大小、孔隙率等微结构相似的羟基磷灰石和双相磷酸钙陶瓷，浸入蛋白溶液中孵育2 h后，BCA法测定溶液中剩余蛋白量，结果显示双相磷酸钙陶瓷吸附纤维蛋白原、胰岛素、Ⅰ型胶原的能力显著高于羟基磷灰石。此项研究表明双相磷酸钙陶瓷较羟基磷灰石具有更高的蛋白吸附能力，可为不同化学组成陶瓷对骨形态发生蛋白等成骨相关蛋白吸附的影响提供参考，但其具体机制仍有待进一步研究。 2.2 双相磷酸钙陶瓷物理结构对骨诱导性的影响 除化学组成以外，目前认为材料的物理结构也可对其骨诱导性的发生产生重要影响。生物陶瓷的物理结构主要包括孔隙结构及表面微形貌两方面。通常认为，数百微米的大孔结构主要影响诱导成骨的量，而微孔尤其是数微米及几百纳米的微孔则是决定材料骨诱导性的关键因素。表面微形貌主要包括粗糙度、表面孔隙、晶体粒度大小等，其中表面粗糙度是定量评价表面微形貌特点的重要指标。     为研究大孔对成骨能力的影响，本课题组曾用200-400 μm、600-800 μm及1 000-1 200 μm的制孔剂制备多孔双相磷酸钙陶瓷，3组材料孔隙率一致，以相同形状和大小植入家犬背部肌肉内。植入6周后组织形态学结果显示3类材料均可诱导骨形成，但单位体积内成骨量600-800 μm组最多，200-400 μm组次之，1 000-1 200 μm组最少。相似的另一实验分别以1-3 mm及0.2-0.3 mm粒径的双相磷酸钙陶瓷颗粒植入家犬背肌内，6周后均观察到骨形成，但成骨量有差异。Fukuda等[22]为研究大孔尺寸对骨诱导中成骨过程的影响并探索相关机制，应用选择性激光消融技术制成底面直径3.3 mm、高15 mm的具有特殊结构的钛圆柱体，每个圆柱体内均有横截面为正方形、对角线长分别为500，600，900，1 200 μm的贯通整个圆柱体的孔隙，并运用化学和热处理方法制备具有相同纳米级微结构的内表面。体外模拟体液浸泡后各组孔隙中均有磷灰石层的沉积。将材料植入比格犬背肌16周后，观察到虽然各组均有新骨形成，但500 μm组和600 μm组成骨量最大，并且成骨量最大处位于距洞口5 mm处。此研究用特殊结构的钛种植体，在体外置于相同的离子环境中，体内植入相同部位，排除了化学成分的影响，直观地证明了大孔结构对生物材料骨诱导性的影响。Habibovic等[23]认为相互连通多孔结构中的孔隙具有重要作用，因为它们提供了一个流体运动较弱的保护性环境，给予了细胞充足的成骨分化空间。另外，较窄较深的孔隙对周围组织中的肌源性及纤维源性因子相对不敏感。然而，骨诱导没有发生在材料更深的位置，是因为骨诱导还受体液扩散、血管化及组织长入的影响。材料外围区域血供相对丰富有利于骨组织的形成，因此，距材料两端5 mm的位置可能是500 μm组和600 μm组血管化水平、可获得的钙磷离子水平及流体运动的最佳平衡[22]。     材料的微孔结构对骨诱导性影响较大，材料制备过程中烧结温度等可对材料的晶体大小、比表面积及表面微形貌产生影响，其不仅可影响陶瓷的机械强度，也可影响材料骨传导性及骨诱导性的发       挥[19, 24-25]。Habibovic等[26]将相同化学成分的双相磷酸钙陶瓷分别用1 150 ℃和1 300 ℃烧结，制成形状大小相同的陶瓷块，两者具有相似的大孔结构及孔隙率，但双相磷酸钙陶瓷1150晶体较小，具有丰富的微孔，比表面积远远高于双相磷酸钙陶瓷1300。检测两者的抗压强度，双相磷酸钙陶瓷1300为      11 MPa，而双相磷酸钙陶瓷1150仅为2 MPa。将两种陶瓷植入山羊背部肌肉中，12周后观察发现9/11只动物的双相磷酸钙陶瓷1150中有新骨形成，而所有动物体内的双相磷酸钙陶瓷1300中均没有新骨形成。Zhu等[21]将相同的双相磷酸钙陶瓷浆料用不同的方法干燥，从而生成了化学组成相同但微结构不同的双相磷酸钙陶瓷1和双相磷酸钙陶瓷2，以测定不同微结构双相磷酸钙陶瓷的蛋白吸附能力。其中双相磷酸钙陶瓷1的孔隙率、比表面积高于双相磷酸钙陶瓷2。用等量的蛋白溶液分别与双相磷酸钙陶瓷1和双相磷酸钙陶瓷2孵育2 h后，BCA法测定结果显示，双相磷酸钙陶瓷1的纤维蛋白原和胰岛素吸附量显著高于双相磷酸钙陶瓷2，而吸附Ⅰ型胶原的量则没有明显差异。Li等[27]将双相磷酸钙陶瓷粉用不同压力和烧结温度制成3种不同的陶瓷片，其中双相磷酸钙陶瓷1150、双相磷酸钙陶瓷1300常压处理，而双相磷酸钙陶瓷1150D则经高压处理。3种陶瓷大小形状相同但微结构不同，其中双相磷酸钙陶瓷1150的晶体较小，孔隙率是双相磷酸钙陶瓷1300、双相磷酸钙陶瓷1150D的2倍，比表面积也显著高于后两者。将3种陶瓷置于胎牛血清中孵育1，4，7 d后，BCA法测定结果表明双相磷酸钙陶瓷1150在各个时间点的蛋白吸附量均远远高于双相磷酸钙陶瓷1150D和双相磷酸钙陶瓷1300，将小鼠成肌细胞C2C12分别与3种陶瓷片复合培养4，7，14 d后，检测结果表明在双相磷酸钙陶瓷1150D各时间点碱性磷酸酶的表达均高于后两者。为研究微结构在骨诱导中发挥作用的机制，Li等[28]将双相磷酸钙陶瓷B和具有较高孔隙率和较大比表面积的双相磷酸钙陶瓷A分别浸入胎牛血清中孵育1，4，7 d，BCA法检测材料的蛋白吸附情况，检测结果显示双相磷酸钙陶瓷A的蛋白吸附量显著高于双相磷酸钙陶瓷B。将两种材料分别与人脂肪干细胞以普通方法复合培养1，4，7，14 d后，检测人脂肪干细胞的DNA结果显示，各个时间点细胞的增殖差异没有显著性意义。双相磷酸钙陶瓷A组细胞中蛋白含量较高，说明双相磷酸钙陶瓷A材料上的细胞活性较高。双相磷酸钙陶瓷A组单位数量细胞碱性磷酸酶的表达在各时间点显著高于双相磷酸钙陶瓷B组，提示双相磷酸钙陶瓷A上培养的细胞其成骨分化的程度较高。7 d后二甲酚橙染色的荧光影像显示在双相磷酸钙陶瓷A的表面有大面积连续的红色荧光影像，表明表面上的细胞有大量钙盐沉积，而双相磷酸钙陶瓷B上仅有少量散在的红色影，表明双相磷酸钙陶瓷A组细胞中的无机成分显著高于双相磷酸钙陶瓷B组。将两种陶瓷片在含体积分数50%胎牛血清的培养基中浸泡后再与人脂肪干细胞复合培养，并在4，7，14 d时检测发现两种陶瓷上细胞碱性磷酸酶的表达较未浸泡的陶瓷均有增加，且双相磷酸钙陶瓷A增幅更大。说明具有较大比表面积的双相磷酸钙陶瓷A富集了较多的蛋白，包括与成骨诱导相关的蛋白，从而刺激未分化的干细胞骨向分化。将两种陶瓷植入羊体内，双相磷酸钙陶瓷A表现出骨诱导性，而双相磷酸钙陶瓷B则没有，表明较大的比表面积对成骨诱导具有重要作用。Yuan等[7]将相同化学组成的双相磷酸钙陶瓷用1 150 ℃和     1 300 ℃两种温度烧结，形成大孔结构相似、小孔尺寸及孔隙率不同的双相磷酸钙陶瓷1150、双相磷酸钙陶瓷1300两种材料，并分别与人骨髓间充质干细胞复合培养，7 d后real-time PCR检测结果表明与成骨分化相关的基因水平在双相磷酸钙陶瓷1150显著高于双相磷酸钙陶瓷1300。碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙蛋白、骨涎蛋白、骨桥蛋白、S100A4和Runx2表达水平在不同陶瓷之间也具有显著差异，双相磷酸钙陶瓷1150组较高，并认为双相磷酸钙陶瓷1150比表面积较大，材料吸附的蛋白较多，从而引起成骨基因表达的差异。Habibovic等[10]将化学成分相同的双相磷酸钙陶瓷分为3组，分别以1 100，  1 150，1 200 ℃常规烧结，发现烧结后材料化学组成无变化，3组材料大孔直径及大孔孔隙率无统计学差异，但烧结温度越低大孔壁上的微孔数量越多，且陶瓷晶体的尺寸越小陶瓷的微孔孔隙率越大，比表面积越大。将3组材料分别植入10只山羊背肌中，6周后发现各组中有新骨形成的动物数量有差异，其中双相磷酸钙陶瓷1100 6/10只、双相磷酸钙陶瓷1150 7/10只，双相磷酸钙陶瓷1200 3/10只。Yang等[11]将双相磷酸钙陶瓷陶瓷浆料以1 100 ℃和1 200 ℃两种温度烧结，并植入小鼠后腿肌肉中。45 d后发现烧结温度较低组所有动物体内材料的微孔中均有新骨生成，而烧结温度较高者材料中只有炎症细胞浸润。Cheng等[12]合成具有大孔和微孔结构的双相磷酸钙陶瓷，并将其研磨制成双相磷酸钙陶瓷粉末，此粉末中大孔结构被破坏，但微孔结构保持完整，将上述两种陶瓷植入10只小鼠腿部肌肉中，3个月后发现仅3/10的陶瓷粉末中有新骨生成，而在9/10的块状陶瓷中有新骨生成，此研究表明，完整的孔隙结构对骨形成具有重要意义，同时具有微孔和大孔材料相比于只有微孔而缺乏大孔的材料而言，具有更优越的骨诱导性。     前期研究显示磷酸钙陶瓷在非骨部位植入时新骨形成只发生在孔隙中。Habibovic等[10]将多孔双相磷酸钙陶瓷植入山羊背肌中，12周后组织学观察发现新骨形成主要发生在孔隙中而非材料表面。分析原因可能是相互贯通的孔隙结构更有利于体液的流动并充满整个材料，伴随着体液流动，孔隙结构中钙磷离子浓度逐渐增高并达到过饱和，更利于磷灰石沉积于材料的内表面。而材料周边释放的钙磷离子由于局部体液流动较快，以及血液循环的影响，其浓度不容易达到过饱和，因而磷灰石层不易形成。目前部分学者认为，材料骨诱导性的发生与局部沉积的磷灰石层有关，磷灰石层的存在可能更利于吸附骨形成相关蛋白，从而有利于诱导相关干细胞的骨向分化，启动骨诱导的发生。这就解释了材料的骨诱导总发生在材料中心的孔隙之中，而不是材料表面的原因[10, 26, 29]。     大孔结构可维持材料的形态及力学性能并支持细胞及血管的长入，同时为材料内部局部成骨诱导微环境的形成与维持提供必要的结构基础，而微孔允许体液渗透进入种植体从而增强其生物活性。材料表面的微孔可作为调控材料降解、再沉积并促进材料骨诱导性的关键因素[30]。微孔越多，材料的比表面积越大，因此表面吸附的蛋白越多，而伴随着材料的降解及磷灰石层的再沉积，孔隙的比表面积可进一步增大。伴随此过程吸附的骨形成相关蛋白可与干细胞作用并诱导其骨向分化，促进新骨生成。同时，孔隙结构上的粗糙表面也可能对干细胞具有直接作用，通过影响其黏附形态诱导其定向分化[31]。Li等[28]将两种粗糙度不同的双相磷酸钙陶瓷分别与人脂肪干细胞复合培养，其中双相磷酸钙陶瓷B表面的粗糙度显著高于双相磷酸钙陶瓷A，电镜观察见双相磷酸钙陶瓷B陶瓷片上黏附的细胞更接近功能状态，并认为双相磷酸钙陶瓷B较高的粗糙度有利于细胞在材料上的黏附。 2.3 动物种属对双相磷酸钙陶瓷骨诱导性的影响 目前研究证实双相磷酸钙陶瓷陶瓷在多种动物体内可表现出骨诱导性，包括羊、犬、猪、狒狒、兔、鼠 等[8-12, 16, 25, 32]。而相同材料在大动物如羊、犬及灵长类动物中发生异位成骨的可能性相对较高，而在鼠等啮齿类动物中发生的可能性相对较低，分析原因可能是材料在不同动物体内吸附的蛋白有差异，以及不同动物对材料上吸附骨形成相关蛋白的反应能力有差异。另外有研究发现相同材料植入相同种属的动物体内其骨诱导性的发生还有个体差异，具体机制尚需进行深入研究。 2.4  材料植入部位及材料尺寸对双相磷酸钙陶瓷骨诱导性的影响 材料植入部位对其骨诱导性也有影响。Cheng等[33]将多孔双相磷酸钙陶瓷分别植入小鼠骨折腓骨附近的肌肉中、完整腓骨附近的肌肉中及腿部皮下，6周后发现大部分位于骨折附近区域的材料中有新骨生成，而完整腓骨附近肌肉内的材料中第8周才出现新骨形成，位于皮下的材料中无新骨形成。进一步研究发现在不同的区域骨形成相关因子如骨形态发生蛋白2的浓度有差异，在骨折断端浓度最高，肌肉次之，皮下最少。另外，由于肌肉内血液循环较为丰富，而皮下血供较差，血液循环能够为新骨形成提供必要的营养物质，因此骨诱导性材料植入肌肉中更容易观察到新骨的形成[34]。 植入体的大小对材料骨诱导性也具有不可忽视的影响。Habibovic等[9]将多孔双相磷酸钙陶瓷制成10 mm和5 mm两种高度的圆柱体并植入山羊背肌中，荧光染色定性分析发现，6周后10 mm组氧四环素标记阳性，而5 mm组为阴性；8周后二甲酚橙标记均为阳性，说明骨生成在较大种植体中较早发生；组织形态学数据显示10 mm组新骨所占孔隙的百分比显著高于5 mm组，分析原因可能是过小种植体在植入区域微动度较大，对材料中细胞黏附、增殖及分化具有不利影响。另外，过大的材料由于埋植区营养供应及血液循环的限制不能有效成骨。"