2.1   RHC的发酵及纯化   5 L发酵罐中进行RHC的重组表达，当菌液A600达到70后，加入终浓度0.5 mmol/L 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，诱导17 h结束发酵。在诱导后12，14，17 h取样，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白表达，如图 3所示，诱导结束时A600达到了150，并且3个批次菌体生长趋势一致。经计算，RHC表达量达到了10 g/L，箭头所指为目的蛋白条带。 菌体重悬后，经过破菌预处理，上清中的宿主细胞蛋白去除效果明显，再经过亲和层析和离子交换层析后蛋白纯度已经达到95%以上。如图4A所示，菌体重悬破菌后记为全菌；经预处理离心后的上清记为上清，沉淀记为沉淀；流穿为亲和层析的流穿液；P1为亲和层析的洗脱液；置换和置换过滤分别为P1用切向流超滤置换为SPA缓冲液后的溶液及其经过0.22 μm滤膜的滤液；SP1为离子交换的洗脱溶液；脱盐和脱盐过滤为SP1经过切向流超滤脱盐后的溶液及经过0.22 μm滤膜过滤后的溶液。目的蛋白主带在75 kD附近。在50 kD附近有一条较弱的条带，尝试多种方法不能有效去除，将上述条带切下后，委托上海中科新生命对其按照肽段覆盖率中的方法进行序列分析鉴定为目的蛋白的降解产物。 用EK酶切除RHC的组氨酸标签后，RHC的分子质量会变小(减小了1.56 kD)，如图4B所示，RHC经EK酶切后分子质量有轻微下降，说明组氨酸标签酶切成功。 "

2.2   重组人Ⅲ型胶原蛋白杂质残留检测结果    2.2.1   外源性DNA残留量   外源性DNA残留量主要是胶原蛋白在表达及纯化过程中残留的宿主DNA，如果有外源性DNA的残留会有潜在的风险，包括感染、致癌性、免疫原性和致突变作用。 根据《中华人民共和国药典》(2020年版)和《YY/T 1849-2022 重组胶原蛋白》，参考注射用人生长激素的要求，将产品的外源性DNA残留量确定为≤1.5 ng/mg。按照《中华人民共和国药典》(2020年版)外源性DNA残留量测定法“定量PCR法”进行测定时，外源性DNA残留量应为≤1.5 ng/mg。3个批次样品的检测结果分别为1.13，1.05 和1.11 ng/mg，均小于标准值。 2.2.2   大肠杆菌蛋白质残留量   宿主细胞蛋白是蛋白纯化过程中的主要杂质之一，它们可能对患者的健康产生影响。宿主细胞蛋白在人体中可能会有生物活性，如果宿主细胞蛋白有蛋白酶活性就可能会通过降解蛋白本身或者蛋白稳定剂影响产品的稳定性。在极端情况下，宿主细胞蛋白会引起潜在的不良反应，如免疫反应或形成抗药物抗体等。根据YY/T 1849-2022 《重组胶原蛋白》对大肠杆菌蛋白质的要求，将其残留量定为< 0.1%。按照《中华人民共和国药典》(2020年版)酶联免疫试剂盒进行测定时，大肠杆菌蛋白质残留量应< 0.1%。3个批次样品的检测结果分别为2.237×10-5%，1.543×10-5%和2.125×10-5%，纯化产品的宿主细胞蛋白残留远低于标准所规定的0.1%。 2.2.3   细菌内毒素   注射用人生长激素的内毒素残留要求是5 EU/mg。重组胶原蛋白作为医疗器械原材料，细菌内毒素需要考虑最终产品与人体的接触方式，若作为植入医疗器械原材料，根据《中华人民共和国药典》对注射剂的要求，人体最大可接受的内毒素剂量为5 EU/(kg·h)。结合产品的实际使用情况，细菌内毒素的限度定为< 0.5 EU/mg，按60 kg体质量计算，最大使用剂量为600 mg，能够满足常规的使用剂量。按照《中华人民共和国药典》(2020年版)“细菌内毒素检查法”方法1 凝胶法检测，3个批次产品的限度均< 0.5 EU/mg。 2.3   重组人Ⅲ型胶原蛋白的结构表征结果    2.3.1   肽段覆盖率   样品经还原酶解后液相色谱-质谱检测图谱，见图 5。液质检测数据经软件检索理论序列数据库和匹配分析，酶解产物肽段覆盖率图谱见图6(阴影部分为覆盖的序列)，胰蛋白酶酶解的覆盖率为97.6%，蛋白内切酶和谷氨酰内肽酶酶解的覆盖率均为100%。合并分析后，鉴定肽段与理论氨基酸序列的肽段覆盖率为100%，说明表达产物的序列与理论序列完全一致，目的产物得到了正确表达。"

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2.3.2   分子质量   RHC由579个氨基酸组成，理论分子质量为52 912.33 Da。样品经高效液相色分离后，用高分辨质谱仪检测RHC分子质量，数据去卷积后汇总分子量信息见表3。由于存在部分谷胱甘肽和葡糖苷化修饰，观测到53 217.3，53 395.4 和53 574.1 Da 3个分子质量，进一步确认了目的蛋白得到了正确表达。"

2.3.3   二硫键分析   样品经胰蛋白酶酶切后，经高效液相色谱脱盐及分离后采用高分辨质谱仪进行检测扫描质谱分析，所得肽段相关质谱检测总离子色谱图见图 7。 所得质谱数据经软件分析，共鉴定到1对信号强度较高二硫键以及一条存在葡糖苷化修饰的半胱氨酸的肽段，鉴定结果见表4，质谱鉴定图谱见图8，9。共鉴定到1对二硫键，即C579-C579，占比15.14%。在胶原蛋白序列中仅在C端有一个半胱氨酸，因此只能形成链间的一个二硫键。 "

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2.3.4   热稳定性   样品的热稳定分析检测图谱见图10，样品的熔解温度为79.72 ℃。熔解温度指样品从有序状态转变为无序状态(如蛋白质变性或聚合物熔融)的温度。对于蛋白质，熔解温度是其热变性的中点温度，此时蛋白质的折叠和未折叠状态处于平衡。熔解温度值越高，表明样品的热稳定性越好。"

2.4   重组人Ⅲ型胶原蛋白的安全性评价结果    2.4.1   皮内反应实验   在此次实验条件下，重组人Ⅲ型胶原蛋白实验液在兔体内只在注射24 h时有极轻微水肿(勉强可见)，最终记分为0.3(≤1.0)，评分统计结果见表5。根据记分标准，此次研究制备重组人Ⅲ型胶原蛋白不具有皮肤刺激性。"

2.4.2   皮肤致敏实验   在此次实验条件下，按Magnusson和Kligman分级标准进行评分，注射24，48 h，所有小鼠皮肤Magnusson和Kligman分级标准评分均为0，说明重组Ⅲ型人源化胶原蛋白实验液未导致豚鼠出现皮肤致敏反应。 2.4.3   急性全身毒性实验体质量：注射后 24，48，72 h，所有动物体质量均有增加，相同时间下实验组与对照组小鼠体质量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图11，说明重组Ⅲ型人源化胶原蛋白不影响动物的生长。 临床观察：根据表2所示的临床观察项目，整个实验过程中所有动物均未见异常症状。 在此次实验条件下，实验组与对照组小鼠均未见死亡和异常症状，所有动物体质量均有增加。实验结果表明，重组人Ⅲ型胶原蛋白未引发明显的急性全身毒性反应。 "

2.4.4   细胞效应   MTT检测显示，1，2，3，4 ，5 mg/mL RHC或RHC-EK均可促进角质形成细胞HaCaT增殖，并且相同浓度下的RHC与RHC-EK促细胞增殖效果无明显差异，如图12A所示。选择2 mg/mL和3 mg/mL的 RHC或RHC-EK进行进角质形成细胞HaCaT迁移实验，结果显示，相对于空白组，2 mg/mL和3 mg/mL的 RHC或RHC-EK可促进角质形成细胞HaCaT迁移，并且相同质量浓度下的RHC和RHC-EK促细胞迁移结果无明显差异，见图12B，C。以上数据说明，组氨酸标签的存在并没有影响RHC的细胞活性。 "