Gene therapy with induced pluripotent stem cells: a hope for beta thalassemia?

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.027

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Beta thalassaemia is a monogenic disease, which lacks effective clinical treatments. Hematopoietic stem cell transplantation currently is the only radical treatment for beta thalassaemia, but the limits of suitable donor and costs minimize its clinical application. Given the technology of reprogramming using somatic cells is well established, gene therapy using induced pluripotent stem cells has become the new direction of beta thalassaemia treatment.
OBJECTIVE: To put forward the advantages of CRISPR/Cas9 technology in gene therapy of beta thalassaemia in the future by summarizing the mechanisms of three kinds of gene editing technologies and the preliminary experimental results in animal models.
METHODS: In order to search relevant articles about beta thalassaemia, the first author retrieved PubMed database and CNKI (from 1989 to 2015) using the key words of “beta thalassemia, genetic therapy, genome editing, homologous recombination, iPSCs” in English and Chinese, respectively. After eliminating literatures which were irrelevant to research purpose or containing a similar content, 67 articles were chosen for further analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Gene editing technology has made considerable progress and three kinds of directed gene editing technologies have been developed, including ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas technology. By targeting induced pluripotent stem cells from thalassemi patients, these three kinds of gene editing technologies have been expected to correct pathogenic genes of thalassemia. The CRISPR/Cas system is more simple, rapid, safe and efficient than the others. The CRISPR/Cas9 system is expected to repair β-globin genes in the induced pluripotent stem cells, germ cells, fertilized eggs and embryos from beta thalassaemia patients, laying the foundation for future clinical application.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: beta-Thalassemia, Induced Pluripotent Stem Cells, Targeted Gene Repair, Tissue Engineering

CLC Number:

R318

Li Ling-li, Zhang Feng-bo, Li Qi, Ma Yan-lin. Gene therapy with induced pluripotent stem cells: a hope for beta thalassemia?[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(9): 1463-1469.

Figures/Tables 1

2.1 地中海贫血概述地中海贫血是一种全球范围内的疾病，包括α及β地中海贫血。而仅β-地中海贫血全世界就有大约8 000万携带者，在地中海区域、非洲和中亚等地区比较常见[3]，而中国主要分布在南部沿海地区[4]。人类成年血红蛋白(HbA，α/β)分别由两条α珠蛋白链和β珠蛋白链组成。β-地中海贫血是一种单基因疾病，是由于11号染色体上的β珠蛋白基因突变导致，引起正常β珠蛋白肽链合成量不足甚至缺失，使得α链与β链的比例失调，α链相对过剩，从而沉积在红细胞内破坏细胞，引起红细胞生成障碍[5-6]。β-地中海贫血一共有300多种突变类型，与镰刀形细胞性贫血一起对于城市的发展具有极大的影响[7]。严重的地中海贫血若不进行治疗，患者出生后不久就会死亡[8-9]。输血治疗虽然可以暂时缓解贫血症状，但是长期反复地输血，铁离子的沉积就会加重，最终导致器官衰竭而死亡[10]。进行骨髓移植是目前惟一可以治愈β-地中海贫血的方法。但是异体骨髓移植面临着2个难题：移植物抗宿主病及免疫排斥[11-13]，因此就需要找到主要组织相容性抗原相匹配的供者，以避免上述排斥反应的发生[14-15]，在缺乏供者的情况下，修饰自体骨髓的β-珠蛋白基因再进行移植成为治疗β-地中海贫血的希望[16]，或者将正常的人类β-珠蛋白基因导入人体进行基因补偿也是目前治疗β-地中海贫血最直接的方式，但由于缺乏安全有效的表达载体而进展缓慢。将患者诱导多能干细胞的β-珠蛋白基因修复后再移植入患者体内，避免了免疫排斥及移植物抗宿主病，或者直接在生殖细胞中进行修复，让后代的遗传概率降低，可能是目前最有前景的治疗策略。 2.2 诱导多能干细胞及其造血分化干细胞具有多向分化潜能和自我更新能力，可以在一定的条件下利用细胞分裂维持自身群体的大小，又可在所处周围微环境的影响下，分化形成多种不同的组织细胞，从而构成机体的组织器官。干细胞按发育阶段可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。利用基因导入技术在动物或人的体细胞内导入某些特定因子，同时在培养液中选择性地加入某些特定的小分子物质，就可以将体细胞重编程为多潜能干细胞，这类细胞在生长特性、克隆形态、基因表达模式、表面标志物、表观遗传学特征、畸胎瘤形成、拟胚体形成以及嵌合体形成(针对小鼠)等方面与胚胎干细胞极其相似。 2006年8月，Yamanaka小组将24种转录因子随机排列组合后导入小鼠成纤维细胞，将成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞，并且最后确定至少有4种转录因子发挥了作用——Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。2007年11至12月，Yamanaka小组和Thomson小组又先后将人类的体细胞重编程为诱导多能干细胞[17-18]。在这之后诱导多能干细胞的关注度和研究力度迅速增长，并获得了很多突破性的进展，如建立了疾病特异的人诱导多能干细胞库等。诱导多能干细胞的应用价值极广，包括再生医学、组织工程和药物发现与评价等领域。诱导多能干细胞的制备简单易行，并且在细胞来源、免疫排斥、宗教、伦理及法律等方面解除了诸多限制，因此诱导多能干细胞一经问世，就轰动了整个生命科学领域，故被称为生命科学领域里新的里程碑。随着研究的深入，重编程的效率日益提高，安全性也逐渐完善，对来源于患者的诱导多能干细胞进行基因编辑、修复致病突变基因从而治疗遗传性疾病正成为转化医学研究的热点。诱导多能干细胞与胚胎干细胞一样具有多向分化能力，在与OP9共培养时，可以定向分化为红系、粒系、巨核系。2011年，Morishima等[19]将诱导多能干细胞与OP9共培养，再加入特定的细胞因子，延长培养时间到30 d，得到的细胞与外周血中成熟中性粒细胞非常相似。而早在1994年，Nakano等[20]首次利用干细胞与OP9细胞共培养时就获得过淋巴造血细胞。近年来，地中海贫血患者的诱导多能干细胞也成功地进行了造血分化研究[21]，这为地中海贫血患者的诱导多能干细胞可以向红系分化提供了有力证明。 2.3 诱导多能干细胞在动物疾病模型中的治疗实验诱导多能干细胞有2种移植方式，其中一种是直接将诱导多能干细胞注射入动物体内，利用体内特有的环境因素分化为特异种类的细胞；另外一种是将诱导多能干细胞在体外分化为特定的细胞、组织或器官后再移植入动物体内。 Wang等[22]在脑缺血大鼠左侧脑室注入诱导多能干细胞后第1周和第2周，大鼠葡萄糖代谢水平恢复正常，神经功能也得到了改善。免疫组化结果显示，移植的细胞迁移到了缺血部位，并能够表达相关细胞的蛋白标志物。这项研究证明，在细胞移植治疗中是可以应用诱导多能干细胞的。有报道显示人诱导多能干细胞被诱导成肝细胞样细胞后移植到CCl4致肝损伤小鼠模型1周后发现，血清白蛋白明显升高，而低密度脂蛋白和胆红素明显降低[23]。另外也有报道人诱导多能干细胞在体外被诱导产生的肝芽基移植到小鼠体内后形成功能性肝脏[24]，这是人类首次报道诱导多能干细胞被诱导成为功能性器官，器官芽基移植技术为再生医学的发展展示出了无可限量的价值。 2007年，Hanna等[25]用小鼠的成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞，通过同源重组，βs-珠蛋白基因被代替为人野生型βa-珠蛋白基因，再定向分化为造血祖细胞后移植到镰刀型细胞性贫血小鼠体内，发现造血祖细胞可以有效控制镰刀型细胞性贫血的症状。特异性诱导多能干细胞进行基因治疗，并诱导分化成特定类型的细胞，为遗传病患者带来了新希望，但是要将这些技术应用于临床治疗依然还有很长的一段路要走。 2.4 基因治疗基因治疗是将人的正常基因或者有治疗作用的基因，利用一定方式导入人体靶细胞，从而纠正缺陷基因或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的一种生物医学技术，通常包括基因修正、基因置换、基因修饰、基因失活等。在过去25年，基因治疗的发展速度有了相对的提升。传统的基因靶向修饰技术依靠细胞内自有的DNA损伤修复机制——同源染色体的随机交换，即同源重组技术，但其效率极其低，通常只有10-6级，因此实际操作的工作量就会增加，并且实验重复性也较差[26]，限制了这项技术的应用[27]。Plavec等[28-29]很早就使用致癌反转录病毒载体进行造血干细胞的基因治疗，近来这种方法也成功运用到了原发性免疫缺陷病[30-32]、视网膜病[33-35]、血友病[36]，但是调控序列较长会降低病毒滴度和基因表达水平，而且容易发生基因重排现象。随着基因编辑技术的迅速发展，出现了3种定向基因打靶技术，包括锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和规律成簇间隔短回文重复CRISPR相关核酸酶(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats，CRISPR/Cas)技术[37]，显著提高了基因组靶向修饰的效率。 2.4.1 ZFNs ZFNs是一种由锌指蛋白和FolkⅠ融合而成的人工合成酶。ZFNs的N末端为锌指蛋白DNA结合域，能够识别并结合特定DNA序列，由一系列Cys2-His2锌指蛋白串联而成，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。位于ZFNs C末端的是非特异性核酸内切酶FokⅠ的剪切结构域。FokⅠ是一种限制性内切酶，由海床黄杆菌表达，只有当两个单体构成二聚体时才具有活性[38]，目前ZFN技术已经成功应用于多个物种的遗传研究，比如拟南芥、线虫、烟草、果蝇、黑麦金斑蝶、非洲爪蟾、斑马鱼、大鼠、小鼠、猪、人等[39]。在基因修复过程中，它可以识别一段特异的DNA序列，并在此特异位点利用FolkⅠ切割DNA，产生1个DNA双链切口(Double strand break，DSB)，然后通过细胞固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行DNA损伤修复，从而完成精确定点修饰和修复致病基因的目的[40]。Chang等[41]构建了α-地中海贫血患者特异性的诱导多能干细胞，并利用锌指核酸酶技术在安全位点插入野生型珠蛋白基因，获得包含正常珠蛋白基因的诱导多能干细胞，基因编辑后的诱导多能干细胞分化形成的红细胞表达正常的β-珠蛋白。Zou等[42]通过ZFNs技术直接在原位点将镰刀型细胞贫血致病突变β-globin(βS/βS)修复成β-globin(βS/βA)，诱导多能干细胞基因修复后分化形成的红细胞可以表达正常的β-珠蛋白。目前，ZFNs已成功应用于源自患者的诱导多能干细胞，修复帕金森综合征相关的突变基因SNCA[43]。而且，ZFNs也成功地修复了β-地中海贫血诱导多能干细胞的Ivs-654及CD41-42突变位点。该研究在β珠蛋白基因(HBB)3个外显子下游600 bp非编码区设计sgRNA，作为其打靶位点，人为地造成DNA损伤，同时利用电转染方式将同源序列转染入诱导多能干细胞，通过药物筛选及PCR、测序鉴定后，得到了基因修复的细胞，并且进行了后续的功能实验，修复后的诱导多能干细胞红系表达量明显增高[44]。 ZFNs存在上下文依赖效应，这也是它美中不足的地方[45]。于是ZFN设计和筛选效率显著降低，其高昂的成本及繁琐的程序使其难以成为实验室常规技术；另外，ZFNs的脱靶效应会导致错误切割其他DNA位点，引起较强的细胞毒性，最终造成细胞死亡[46]。因此限制了ZFNs技术在基因治疗领域中的应用。 2.4.2 TALENs TALE由N末端转座结构域和DNA结合相关的中央结构域以及C末端转录激活结构域构成。中央DNA结合区域含有15.5-19.5个单元模块，而每个单元模块有34个氨基酸残基，除了第12位和第13位氨基酸可变之外，其他氨基酸均是保守的，因此，第12位和第13位氨基酸被称为重复可变的双氨基酸残基(repeat variable di-residues，RVDs)位点[47]。TALEN之所以能特异识别DNA，其原因在于RVD可以与DNA 4种碱基中任意1个结合。由于TALE模块可以和DNA序列相对应，于是在TALE模块上连接一个FokⅠ核酸内切酶，构建DNA靶位点的重组核酸酶TALENs，TALEN的DNA结合区域将每个单元模块固定在识别位点上，异源FokⅠ形成二聚体使其自身具有活性后，切割DNA双链[48-49]。TALENs于2010年底成功应用于基因编辑，而且不久后就成为一种比ZFNs更容易设计、特异性更高以及毒性更低的人工核酸内切酶。更值得一提的是，Wang等[50]利用TALEN技术成功编辑了Y染色体，而在此之前，在哺乳动物的基因编辑操作中Y染色体一直是操作的禁区，因此从没有成功改动过。Ma等[51]和Sun等[52]先后建立了地中海贫血特异性诱导多能干细胞系和镰刀型细胞贫血特异性诱导多能干细胞系，并通过TALEN技术成功地修复了β-珠蛋白上的致病突变基因，修复后的诱导多能干细胞仍然保持多能性及正常的核型，并且修复后的诱导多能干细胞分化形成的β-珠蛋白可以表达正常的红细胞。目前，随着研究的不断深入和推进，TALENs已成为TALE应用中最值得关注的研究。 ZFNs和TALENs都属于人工合成的嵌合体核酸酶，均由DNA结合域和DNA内切酶构成。尽管ZFNs和TALENs都能通过切割特殊基因位点的DNA双链诱导非同源末端连接或同源重组修复来大规模地改造目的基因，但是TALENs识别特异性的DNA位点比ZFNs要高。尽管如此，TALEN技术也有一定缺陷，经TALENs进行基因编辑以后的细胞克隆与克隆之间单核苷酸多态性(SNP)位点存在一定的差异，虽然对TALEN的使用不构成影响，但也是不容忽视的[53]。总而言之，这在遗传学的基础理论和临床应用研究上无疑都是一次重大的飞跃。 2.4.3 CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas的基因座结构相对比较简单，Ⅱ型CRISPR/Cas是目前研究得较为深入的一型，其基因座结构包括3部分，5’端的tracrRNA基因、中间的一系列Cas蛋白编码基因(Cas9、Casl、Cas2和Csn2)以及3’端的CRISPR基因座。CRISPR基因座由启动子区域和间隔序列以及重复序列构成。 CRISPR/Cas的作用机制可分为3个阶段[54]，首先是CRISPR的高度可变7间隔序列的获取，其次是CRIPSR基因座的表达，最后是CRISPR/Cas系统发挥活性干扰外源遗传物质。对于CRISPR的高度可变的间隔区的获取，其实就是指入侵的噬菌体或者质粒的一小段DNA序列被整合到宿主菌的CRRSPR的5'端的两个重复序列(repeats)之间。因此，CRISPR基因座中的间隔序列从5’到3’的排列顺序也暗示了外源DNA入侵的时间顺序。噬菌体或者质粒上跟间隔序列相对应的DNA序列被称为原间隔序列(protospacer)，通常原间隔序列的5’或3’端延伸的几个碱基序列很保守，被称作PAM(protospacer adjacent motifs)序列，一般由2-5碱基组成，通常与原间隔序列相隔1-4个碱基[55]。原间隔序列的获得过程可能分为3步：第一，识别入侵的DNA和外源DNA潜在的PAM序列，将靠近PAM的序列作为候选原间隔序列；第二，在CRISPR基因座的5’端合成重复序列(repeats)；最后在两个新合成的重复序列之间将原间隔序列整合进去。目前观点认为Cas1和Cas2蛋白是负责原间隔序列获取的核心蛋白。此外研究发现，Type Ⅱ型CRISRP/Cas系统中Csn2蛋白对于新的间隔序列的获得也是必不可少的[56]。多个研究表明在外源核酸入侵时，CRISPR基因座首先转录成前体CRISPR RNA (pre-crRNA)，然后被Cas蛋白或者核酸内切酶剪切成一些小的RNA片段，而这些小RNA就是成熟的crRNA，是由部分重复序列和一个间隔序列构成[57]，从而识别外源入侵的核酸，并将其原间隔序列进行切割，避免再次入侵。Type Ⅱ型CRISPR/Cas系统成熟的crRNA除了Cas9和Rnase Ⅲ参与之外，还需要tracrRNA的指导。CRISPR基因座在没有外源的质粒或者噬菌体入侵宿主菌的情况下表达水平很低，然而当受到外界压力时CRISPR的表达很快被诱导上调。 CRISPR/Cas系统的作用方式与限制性核酸内切酶有相似之处，都能进行DNA的特异性切割。而CRISPR/Cas系统对DNA序列的特异性切割主要依靠crRNA与Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物来识别靶序列上的PAM以及原间隔序列(protospacer)，从而准确地切割DNA序列。据此特性，可以将CRISPR/Cas系统用作设计人工的核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)来对感兴趣的目的基因进行编辑。最新的研究结果显示CRISPR/Cas9作为一种新兴的基因编辑工具已经在细菌、酵母、植物、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠和人的细胞模型之中成功应用[58]，最初，该技术广泛用于动物模型的构建，如成功构建了Kdm2b基因敲除、酶活突变的小鼠品系以及模拟人类FMO3基因突变的小鼠品系等[59]。加州大学旧金山分校的研究人员利用CRISPR/Cas9技术修复了β-地中海贫血特异性的诱导多能干细胞致病的突变基因，再将突变基因纠正后的诱导多能干细胞诱导分化为红细胞，发现这些红细胞β-珠蛋白的RNA水平得到了大幅提高[60]。SloanKettering研究所的研究人员在人类多能干细胞中定点插入Dox诱导型的Cas9，使CRISPR介导的基因打靶在时间上准确调控，甚至在干细胞分化的各个阶段进行特定基因的编辑[61]。 CRISPR/Cas系统的构建比ZFNs和TALENs系统要更加简单，并且花费更少，一般的实验室也可以自行构建，极大地提高了基因操作的简便性。然而由于CRISPR/Cas系统配对的碱基序列较短，可能会降低CRISPR/Cas系统的切割特异性[62]，出现脱靶效应，因此还需要进一步的改进与完善。 2.5 CRISPR/Cas9在动物疾病模型中的治疗实验遗传物质的改变可以引起遗传性疾病，并且能遗传给子代，有一定的家族聚集性，目前尚无治愈方法，只能通过产前筛查终止严重遗传病胎儿的降生。彻底根治遗传性疾病只能通过基因水平的治疗手段实现，在生殖细胞的基因中修复突变的DNA，产生健康的个体，并将正确的遗传物质遗传给下一代，从而在家族中彻底根治遗传缺陷。目前已经有相关报道，在携带遗传缺陷的受精卵中通过胞浆注射CRISPR/Cas9系统的方法，得到了基因修复的小鼠[63-64]，但是通过直接胞浆注射的方法并不能治愈所有的新生小鼠，而且仍然存在少量脱靶现象，因而在临床应用中受到了限制。只有在生殖细胞如精原干细胞中利用CRISPR/Cas9技术修复突变基因才能获得完全修复的小鼠。中科院上海生化与细胞所的科研工作者就建立了携带纯和的白内障遗传突变的精原干细胞系，并将CRISPR/Cas9注射入精原干细胞中，通过单细胞扩增建立了来自单个精原干细胞的细胞系。随后通过分析，选择两个突变位点均已修复，而且不存在脱靶效应，以及将能维持正常表观遗传特性的细胞系移植到雄性不育的受体睾丸中，2个月后分离出球形精子，并利用球形精子注射，获得了白内障修复的小鼠[65]。这个研究给未来人类精原干细胞的基因治疗带来了希望，男性不育及伴性遗传疾病的根治将指日可待。Guan等[66]构建了F9 Y371D成年小鼠模型，通过尾静脉大容量快速注射法注入pX-458-Cas9-2A-GFP及Donor 模板后，成功地修复了B型血友病Ⅸ因子Y371D突变，小鼠出血症状明显改善。此外Liang等[67]报道，在三原核(3PN)胚胎中利用CRISPR/Cas9能有效切割β珠蛋白基因(HBB)，但是同源重组(HDR)的效率很低，只有25%，大多都是通过非同源末端连接(NHEJ)进行修复，并且通过T7E1和全基因组测序发现仍然存在一定的脱靶效应。因此CRISPR/Cas9在未来的临床应用中依然存在很大的挑战。然而，在基因治疗过程中通过全基因组测序的手段挑选特定位点被修复而其他位点又未发生非特异编辑的细胞系来进行进一步的应用成为可能，从而消除人们对干细胞中基因组编辑安全性的担忧。"

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