Tissue-engineered nerve conduits with internal structure in the repair of peripheral nerve defects

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.08.022

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: To enhance peripheral nerve regeneration, the focus on the development of nerve conduits has been shifted from conventional conduits without internal structure to novel conduits with internal stuucture. Therefore, a comprehensive understanding of the internal structure of nerve conduits is necessary.
OBJECTIVE: To review the application of tissue-engineered nerve conduits with internal structure in nerve regeneration.
METHODS: A computer-based research of CNKI, WanFang, SinoMed and PubMed databases was performed to retrieve relevant literatures about the tissue-engineered nerve conduits with internal structure published from January 2009 to December 2015, using the keywords of “nerve conduit/conduits/scaffolds/scaffold/channel/channels, internal scaffolds/scaffold, nerve regeneration/repair, hydrogel, acellularized/decellularized nerve” in Chinese and English, respectively. Forty-seven eligible literatures were included for overview.
RESULTS AND CONCLUSION: The novel nerve conduits with internal structure have many advantages over conventional conduits without internal structure, which can support, guide, promote peripheral nerve regeneration and functional recovery, especially, when modified with seed cells, neurotrophic factors or extracellular matrix, can achieve more effective results comparable to autologous nerve grafts.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Bicompatible Materials, Peripheral Nerves, Stents, Tissue Engineering

CLC Number:

R318

Chen Jun, Shen Hua. Tissue-engineered nerve conduits with internal structure in the repair of peripheral nerve defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(8): 1273-1279.

Figures/Tables 1

2.1 以肌肉作为内支架的组织工程神经导管脱细胞的肌肉组织置入组织工程导管后，随着时间的推移，肌桨和肌膜可被巨噬细胞清除，剩下肌肉的基底膜将对再生的轴突起引导作用[5]。李政等[6]在利用聚乳酸-羟基乙酸神经导管联合自体变性肌桥修复大鼠10 mm神经缺损的实验研究中发现，聚乳酸-羟基乙酸神经导管联合变性肌桥组，无论是大体观察、坐骨神经功能指数测定、腓肠肌湿重恢复率测定，还是组织学观察和图像分析对比等均优于单纯聚乳酸-羟基乙酸导管组。此研究证实了聚乳酸-羟基乙酸神经导管联合化学萃取自体骨骼肌肌桥在修复大鼠坐骨神经缺损方面具有良好的桥梁作用和促神经生长的作用。他们采用的化学萃取法制作的肌肉基底膜管，能模拟形成一种中空网管状结构，且肌肉基底膜含有层粘连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白，能促进周围神经再生，有助于许旺细胞黏附及轴突沿支架延伸生长。实验中除了肌桥的内支架作用外，聚乳酸-羟基乙酸神经导管还可以将肌桥和神经断端与周围环境进行隔绝，可避免周围组织的压迫和炎性细胞的浸润。内置肌肉的组织工程支架在修复人的长节段周围神经缺损方面也取得了良好的疗效，Manoli等[7]通过3种方法即内置肌肉的静脉复合导管、自体神经移植和神经断端直接吻合来评价指神经修复效果，他们发现肌肉静脉复合导管组与自体神经移植组的修复效果相似，并且在修复较长节段(30-60 mm)的神经缺损上也取得了满意的效果。此方法中除了肌肉的内支架的载体作用，静脉作为鞘管也发挥了重要作用，静脉的外膜富含胶原蛋白和层粘连蛋白，可以提供新生神经血管再生的微环境。静脉导管既可以对再生神经起引导作用，又具有防止周围组织长入的作用。Riccio等[8]报道用内置骨骼肌肌桥的羊膜导管修复人长达50 mm的正中神经缺损，感觉和运动功能都得到了良好的恢复，此实验中不仅肌肉起到了内支架作用，羊膜所富含的层粘连蛋白、胶原、纤连蛋白、多能干细胞和生长因子也发挥了重要作用。以肌肉作为载体，复合骨髓基质干细胞可提高周围神经修复效果。Nijhuis等[9]将大鼠的自体肌肉片段复合骨髓基质干细胞后充填于静脉导管中，导管取自大鼠自体的左侧颈外静脉，修复大鼠15 mm的坐骨神经神经缺损。研究发现内置复合骨髓基质干细胞的自体肌肉片段组的修复效果要优于不复合细胞组。虽然充填肌肉的神经导管在修复周围神经缺损方面相较于自体神经具有很多优势，但是对于充填在导管的中的肌肉是否需要经过变性预处理，以及变性预处理的流程仍然存在一些问题，因为这些直接关系到肌肉的降解时间和降解程度，而肌肉的降解时间和程度直接关系到是否会阻碍再生神经的生长[10]。 2.2 以神经碎屑作为内支架的组织工程神经导管 Sahin 等[11]利用内置周围神经碎屑的静脉导管修复大鼠 10 mm长的胫神经缺损，在与自体神经移植组和单纯静脉组比较时发现，内置神经碎屑的静脉导管组的运动功能的恢复，有髓神经纤维的数量都与自体神经移植组相近，且具有正常形态的轴突的数量要比单纯静脉导管组多。该实验中填充到静脉导管内的神经碎屑组织具有防止静脉塌陷的作用，填充的神经碎屑是远端将要进行瓦勒氏变性的部分，因此不存在供区的损伤。相较于单纯自体神经移植所需要的神经的量，填充到静脉导管中的神经的量要少。因此可以使用较不重要的区域，较少的供区神经作为填充物来修复较长节段神经缺损，从而可以尽可能的减少供区的神经损伤。 Eren等[12]以复合有血管内皮生长因子或骨髓间充质干细胞的自体周围神经碎屑作为内支架，填充到静脉导管内，与单纯静脉导管组对照来修复鼠的16 mm长的腓总神经缺损。结果步态分析、神经电生理学检测和神经形态学分析都证实复合血管内皮生长因子组的修复效果与自体神经移植组的修复效果类似，其次是复合间充质干细胞组，单纯静脉导管组的修复效果最差。他们的实验证实填充有神经碎屑内支架的神经导管可以提高轴突的再生效率，复合血管内皮生长因子或骨髓间充质干细胞后修复效果更佳。 2.3 以合成的纤维丝或纤维条索作为内支架的组织工程神经导管 2.3.1 以合成的纤维丝作为内支架的组织工程神经导管神经导管内导入纤维丝支架可以为轴突提供支架，并引导轴突的生长。Kriebel等[13]将同向的聚己内酯(PCL)纤维丝包埋进Ⅰ型胶原基质后，充填于PCL神经导管内，与胶质瘤细胞(U373)和鸡胚背根神经节(DRG)混合培养后发现，包埋在胶原基质导管的纤维丝能够引导许旺细胞的迁移和轴突的生长。李志跃等[14]用内置聚乳酸聚羟基乙酸微丝的聚乳酸-羟基乙酸三维神经导管修复大鼠12 mm神经缺损，并按照导管内纤维丝的数量进行了分组，分别为20根聚乳酸-羟基乙酸微丝，40根聚乳酸-羟基乙酸微丝，并在导管内注入层粘连蛋白和神经生长因子混合液。结果显示内置20根微丝支架的神经导管组修复神经缺损的效果接近于自体神经移植组，且优于内置40根微丝支架的神经导管组，此实验证实适量的微丝内支架有利于神经再生，数量过多的微丝置入反而可能抑制神经再生。研究者认为内层微支架及层粘连蛋白基质有利于许旺细胞黏附爬行，外源性神经生长因子的注入，可作为生物活性物质诱导神经轴突再生并沿支架生长，更接近正常神经的微环境，但导管内微丝过多可能产生“拥挤”和“空间占位”效应不利于周围神经再生，同时不利于酸性降解产物的排除。 Ahn等[15]用左消旋聚乳酸(PLDLA)导管修复大鼠 10 mm的神经缺损，导管内置入左消旋聚乳酸包裹的纤维内支架，这种纤维内支架是由纳米碳管共价键结合到磷酸盐玻璃纤维复合而成。体外实验显示脊髓背根神经节的轴突能够沿着复合神经纤维生长，复合了纳米碳管的磷酸盐玻璃纤维能显著促进轴突的生长，使轴突的长度增加。研究者们用此种神经导管修复鼠的10 mm坐骨神经缺损后发现，再生神经的轴突的数量，再支配靶肌肉的横截面积均显著增加，且神经电生理学检查结果也显著提升。 Hinüber等[16]设计具有渗透性的以聚-3-羟丁酸(P3HB)为基础的渗透性神经导管，P3HB熔纺纤维填充内腔。他们发现此种导管可以支持神经元的存活和轴突的生长，导管内置入的纤维能够促进轴突的定向生长，结合细胞外基质蛋白后更能促进神经节的黏附和细胞的迁移。此实验中，结合有层粘连蛋白和胶原的熔纺纤维类似于神经内膜的结构。 Cui等[17]选择与人的面神经解剖相似的猪的面神经作为修复对象，用内置复合有睫状神经营养因子和碱性成纤维细胞生长因子线性胶原丝状支架的胶原神经导管修复微型猪的35 mm长的面神经缺损，结果显示复合有两种因子导管组的再生神经纤维的数量和分布，髓鞘形成和神经功能的恢复均优于复合单一因子组。 2.3.2 以合成的纤维条索束作为内支架的组织工程神经导管 Koh等[18]用内置聚乳酸-羟基乙酸纤维条索束的神经导管修复大鼠10 mm的坐骨神经缺损。神经导管利用静电纺丝技术做成多孔的双层结构，内层为定向排列的聚左旋乳酸纳米纤维，外层为无序的聚左旋乳酸纳米纤维，导管内腔充填纤维条索束。研究发现，内置纤维条索束的神经导管组的一些病例在肌肉的重新支配，感觉功能的恢复方面均优于自体神经移植组，但再生神经中段的轴突的数量要低于自体神经移植组，并且将导管壁复合层粘连蛋白以及纤维条索束复合神经生长因子后，一定程度上可促进神经的再生，有助于神经缺损的修复。 2.4 以内部凹槽结构作为内支架的组织工程神经导管导管生物学性能以及与周围组织的相互作用，是制作导管时需要考虑的重要的因素，当被植入不同的解剖学部位时，导管会受到不同的生物学力量。对导管进行表面形态学修饰来改变导管的生物学性能和机械力学性能，提高神经再生的效率，特别是较长节段(大于30 mm)的神经缺损的神经再生的效率是学者们的一大关注点，其中一种方法就是对神经导管的内表面进行微沟槽化处理，而这种方法背后隐藏的规律是“接触导向作用”[19]。近年来，学者们对神经导管内表面微沟槽的形状，凹槽脊背的宽度，底部的宽度的设计等方面的问题进行了深入的探索。Mobasseri等[20]对用聚己内酯/聚乳酸(PCL/PLA)做成的表面具有SL型凹槽，V型凹槽，SQ型凹槽的膜片进行了实验研究，他们发现，有凹槽的结构有利于细胞的定位，黏附以及扩散，SL型的效果最好。然而Mobasseri等[21]则发现许旺细胞沿着膜片上的V型和SL型凹槽定向延伸，未出现交叉现象，且最长的细胞出现在V型凹槽的膜片上，但在SQ型凹槽上则不能很好的伸展，且出现交叉现象。他们在另一项研究中也发现凹槽壁的倾斜角度和凹槽底部的宽度影响NG108-15(一种神经细胞株)细胞的反应，但斜坡倾斜度的影响更大[19]。Cai等[22]的实验也证实，微槽结构可以促进细胞呈线性定向排列，引导细胞迁移和分化，微槽的宽度和深度都对细胞的线性定向排列有重要影响。Yin等[23]甚至对导管内的几何形状等进行了大量的数据研究，他们做了一个在具有凹槽的神经导管内生长的轴突的粘弹性模型，神经导管内的凹槽具有一定的圆周方向上的宽度和径向上的高度，并且此模型中轴突被看做弹性机械臂，运用杠杆理论对轴突的延伸、弯曲和扭转等方面的变形与运动进行了深入的研究。他们发现当减少凹槽的宽度和增加凹槽的高度时，轴突沿导管纵向的延伸也会增加。 Huang等[24]则是对做成导管的纤维的纤维表面进行微沟槽化处理后，用此种导管修复大鼠的坐骨神经缺损。电生理学、足迹、腓肠肌、免疫组织化学等方面的分析均提示微沟槽化处理后的纤维丝做成的神经导管能促进坐骨神经再生。Huang等[25]则通过体外实验证实，聚左旋乳酸纤维丝表面经过微沟槽化处理后不仅能够引导许旺细胞的延长和轴突的延伸，在与许旺细胞和PC12共培养后，还可引导髓鞘化的轴突沿着纤维表面的微沟槽定向延伸。Zamani等[26]对利用静电纺丝技术制成导管的纳米纤维丝做成粗糙(多孔和槽)的还是表面光滑的进行了比较，发现粗糙的纤维丝做成的导管相较于光滑纤维丝做成的导管更能促进神经的生长，纤维表面结构会对吸收特点以及细胞的黏附和增殖产生影响，这可能主要是因为增大了可利用的表面积。 2.5 以内层作为内支架的具有多层结构的组织工程神经导管孙丹丹等[27]用聚乙丙交酯可降解生物医用纤维和甲壳素无纺布制备了新型编织型神经导管，导管既有管中管结构又有内支架结构。新型双层编制型神经导管相较于单层神经导管改变了导管的力学性能，拉伸性能、抗扭转能力较单层导管有一定的提高。导管的内层有较好的通道，不仅可以引导轴突定向生长还为细胞的黏附和生长提供了良好的载体，为物质交换提供了适宜的环境。 Uemura等[28]在双层管壁的基础上又引入了诱导多能干细胞(IPSc)。他们所设计的神经导管外层为由聚左旋丙交酯构成的纤维网，内层为50%聚左旋丙交酯和50%的聚-ε-己内酯的共聚物构成的海绵状疏松多孔的结构，将内层管壁复合神经球来源的诱导多能干细胞来修复鼠的5 mm坐骨神经缺损。术后发现复合诱导多能干细胞的一组鼠的运动功能和感觉功能相较于单纯导管组都有了显著的恢复，组织学分析显示，复合诱导多能干细胞组导管内轴突的再生和髓鞘化的程度均显著提高。诱导多能干细胞理论上有形成畸胎瘤的可能，但他们的长期观察未发现畸胎瘤的形成。 Kakinoki等[29]则以聚左旋乳酸为基础，根据不同的功能需要，将其与其他的有机物或人工蛋白聚合成不同的聚合物制备出具有3层结构的神经导管。导管的内层由含有25%的类弹性蛋白—层粘连蛋白的人工蛋白(AG73-(VPGIG)30)的聚左旋乳酸纤维静电纺织而成，起引导轴突再生的作用；中间层最厚，由纯聚左旋乳酸纤维静电纺织而成，具有很好的机械性能可以起到支撑的作用；外层由含有10%聚乙二醇的聚左旋乳酸纤维静电纺织而成，具有防止与周围组织粘连的作用。用此种神经导管修复兔的20 mm的胫神经缺损，术后2个月观察，周围组织未发生粘连，并且内层导管内再生神经的动作电位有所提高。 2.6 以内部管道结构作为内支架的神经导管正常神经结构是由神经外膜，神经内膜，神经束膜包裹神经纤维形成的。目前研究中所设计的各种各样的内部具有管道结构的神经导管旨在利用仿生学原理来模拟天然的周围神经结构[30]。 Tansey等[31]设计了一种用琼脂糖凝胶做成的多管道结构的神经导管，导管内部的管道内充填胶原蛋白来修复鼠的坐骨神经10 mm缺损，修复的效果在组织学水平上与自体神经移植相似。此外，他们还将其与单腔导管的修复结果进行了对比，发现用单腔导管修复后，再生的神经呈单束状，而内部为多管道结构的神经导管修复后，再生的神经呈多束状分布，并且还产生了类似于神经束膜的结构。他们认为多管道结构避免了神经再生过程中紊乱的情况的出现，防止了轴突之间的相互交叉，并且胶原可以为轴突再生提供再生的基质。改进导管结构，包括增加导管内部微管结构，以内部微管结构作为支架搭载合适的生长因子从而为神经再生提供营养支持可能是解决限制神经导管发展的一个重要因素。Zeng等[32]计了一种模拟正常的神经结构的胶原-壳聚糖神经导管，内部做成蜂窝状定向排列的管道结构，并结合搭载有神经生长因子的壳聚糖缓释微球体用来修复雄性SD大鼠15 mm的神经缺损。结果显示以内部的蜂窝状管道结构作为支架，搭载含有神经生长因子的缓释微球体组实验结果要优于单纯导管组和非微球体组(生长因子未包埋在壳聚糖微球体中)。此种复合型神经导管体外可以缓慢释放神经生长因子28 d，缓慢释放的机制很可能是搭载有神经生长因子的壳聚糖微球体随着胶原-壳聚糖神经导管的缓慢降解而释放。新生血管生成不足限制了神经导管在神经修复方面所发挥的作用。自体大网膜不仅具有很好的生物相容性，不会产生免疫排斥反应，而且具有很好的形成血管的能力，可结合神经导管修复长节段的神经缺损。Zhang等[33]根据大网膜的上述特点对内部多管道结构的胶原-壳聚糖神经导管作了进一步的改进。他们在胶原-壳聚糖神经导管的基础上外包一层大网膜来修复SD大鼠15 mm的坐骨神经缺损。结果显示在轴突的再生和神经功能的恢复上，大网膜包绕的神经导管组与自体神经移植组相似，神经导管内多种蛋白质(血管内皮生长因子，脑源性神经营养因子，神经生长因子)的水平均高于单纯导管组。修复结果好的原因除了内部导管的蜂窝状结构外，还可能与大网膜分泌的蛋白质有关。 Stoyanova等[34]设计了一种用聚二甲基硅氧烷做成的直径三级递减的神经导管，并将此导管置于硅胶管中，用来修复鼠的神经损伤。这种方法可以防止单一导管修复神经缺损时出现的所有神经轴突长成一簇的现象，这种逐级分开引导的方式可以使再生神经更接近正常神经，使再生神经在传导时更加精细有效。不仅导管内部做成微管结构引起了人们的重视，目前神经导管内部管与管之间间隔部分的微观结构也引起了学者的重视。通过制作工艺的改进和创新可以将导管内部的管道之间的连接部分做成阶梯状，球状多孔，纳米纤维状等。管与管之间的连接部分的微观结构对管的机械特性，营养物质的吸收、神经细胞之间的交流以及神经网络的形成将产生重要的影响[35]。近年来，在制作带有微管的神经导管的工艺方面有了很大的提高，导管内微管制作的可控性也越来越强，可以根据需要设定不同的参数，来改变导管内微管的分布、数量、直径、长度、管壁的厚度以及微管间隔部分的孔隙率等[36-37]。 2.7 其他类型具有内支架结构的神经导管 2.7.1 以凝胶作为内支架的组织工程神经导管由于哺乳动物体内没有降解角蛋白的酶，因此经一定处理后的角蛋白的降解速率是可控的，较其他的天然蛋白填充物的降解速率慢，并且角蛋白凝胶充填的神经导管可通过细胞的渗入而被重塑，可以为神经修复的早期提供临时基质而后期也不会影响神经的再生[38-39]。Pace等[38]将角蛋白水凝胶充填于牛Ⅰ型胶原导管内修复猴的 10 mm的正中神经缺损，而对照组导管内充填无菌生理盐水。角蛋白凝胶填充组再生神经的电生理学结果、组织学结果均优于充填生理盐水组。 Jin等[40]设计了一种外壁为聚L-丙交酯-co-己内酯共聚物(PLCL)纳米定向纤维，内部充填胶原/透明质酸复合凝胶的神经导管来修复鼠的10 mm的坐骨神经缺损。结果发现，充填有胶原/透明质酸复合凝胶的聚L-丙交酯-己内酯神经导管体外能促进感觉神经元轴突的生长，体内可以促进感觉功能的恢复，但导管内填充凝胶不能增加运动功能的恢复，凝胶复合神经因子体外短期内可提高轴突的剂量依赖相关性生长但体内实验未发现明显影响。 Black等[41]设计了一种以两亲性肽为基础的凝胶(C16GSH gels)，与胶原凝胶相比，此种凝胶体外更有利于许旺细胞的伸展，增殖，迁移，且鼠的体内实验证实此凝胶具有很好的生物相容性，生物可降解性，且支持血管生成，无炎症反应和异物免疫反应。McGrath等[42]设计了BDTM PuraMatrixTM 多肽凝胶充填于纤维素超滤膜神经导管内，与藻酸盐/纤连蛋白凝胶相比修复神经缺损效果更佳，但无论哪一种凝胶在复合许旺细胞后仅对神经再生的早期起作用，而对于神经再生远期效果和腓肠肌的恢复无明显效果。最近Wang等[43]的一项研究证实，神经导管内充填复合骨髓基质干细胞的细胞外基质凝胶不但有助于周围神经缺损的修复，并且修复的效果要优于自体神经移植组。 2.7.2 去细胞神经的天然网状结构作为内支架的组织工程神经导管去细胞神经天然网状支架呈三维管状立体结构，将许旺细胞、髓鞘及轴突等抗原物质去除后，支架的抗原性被降低，基底膜成分予以保留，因基底膜所含有的层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖等大分子物质以及多种神经营养因子，不仅对神经再生有明显的引导和促进作用，而且可为神经再生构建良好的微环境[44-45]。Guo等[46]用同种异体神经修复人的指神经缺损后，发现患者的感觉功能得到了很好的恢复。近来，有研究证实去细胞异种神经移植取得了与去细胞同种异体移植相似的效果[47]。"

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