2.1 诱导性多能干细胞的来源  诱导性多能干细胞是指通过诱导重编程的方法，将已分化成熟的体细胞诱导成具有胚胎干细胞特性的细胞。诱导重编程所需的体细胞，通常来源于帕金森患者和健康成人的皮肤成纤维细胞、毛囊角化细胞、肝细胞和造血细胞[3]。早在2006年，Takahashi小组利用反转录病毒，将Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4四种因子导入小鼠和人的成纤维细胞，筛选获得具有胚胎干细胞特性的诱导性多能干细胞[4]。现如今，改良的诱导性多能干细胞诱导方法也不胜枚举，其中载体的优化成为关键的突破口之一。Rhee小组通过比较病毒和蛋白质分别作为载体，病毒组的诱导性多能干细胞分化的神经前体细胞相比蛋白质组，在传代过程中表现为早期的衰老和凋亡[5]。诱导性多能干细胞另一方面诱导方法的改进是特异性转录因子的简化。Soldner小组应用DOX介导的携带有loxP剪切位点的慢病毒作为载体，将4种特异性转录因子导入帕金森患者成纤维细胞中，在获得有效的诱导性多能干细胞后，利用重组酶剪切外源性DNA，从而获得了无转录因子整合的 诱导性多能干细胞[6]。 2.2 诱导性多能干细胞源多巴胺能神经元诱导流程 2.2.1 标准的诱导流程 标准的诱导流程包括：诱导性多能干细胞诱导分化为神经前体细胞和神经前体细胞诱导分化为多巴胺能神经元[7-9]。当然，不同的小组所采用的诱导方案存在差异，诱导方案的多样化也为人诱导性多能干细胞源多巴胺能神经元的诱导分化提供了更多的选择参考。 2.2.2 多样化的诱导性多能干细胞体外诱导分化方案  Cooper小组[10]的体外诱导分化方案[7]的具体流程如下：诱导性多能干细胞的维持和传代培养，参考美国国家科学院官方指导。神经外胚层的分化，用SRM培养基培养11 d，再用增补了600 μg/L的Noggin、100 μg/L的Wnt1、100 μg/L的成纤细胞生长因子8a和全反式维甲酸培养3 d。第14天人工挑取神经外胚层克隆，并将其接种在包被了多鸟胺酸和层粘连蛋白的培养皿中，并在培养皿内放入增补了生长因子的N2培养基。神经前体细胞向多巴胺能神经元分化所需的生长因子为：Shh-N、SHH-C24II、成纤细胞生长因子8b、成纤细胞生长因子8a、20 μg/L的脑源性神经营养因子、1 μg/L 的转化生长因子β3、10 μg/L的胶质细胞源性神经营养因子、0.5 mmol/L的cAMP、0.2 mmol/L的抗坏血酸。在21 d后(第35天)将培养好的细胞用胰酶替代物消化，1 000 r/min转 5 min。用N2培养基将离心后的细胞制成细胞悬液，再次接种到包被多鸟胺酸和层粘连蛋白的多孔培养板上培养 7 d，每孔1 000 000- 2 000 000个细胞，并加入脑源性神经营养因子，抗坏血酸，SHH，和成纤细胞生长因子8。在上述基础上，加入cAMP，胶质细胞源性神经营养因子，和转化生长因子β3等生长因子，再培养7 d，细胞在第49天分化。 Sundberg小组[11]试图找到更优化的诱导性多能干细胞的体外诱导分化方案，故而拟定了4种方案同时进行以用于比较，具体流程如下：①方案A：诱导性多能干细胞传代培养后，加入LDN-193189、SB431542培养1 d后，在此基础上加入SHH、purmorp、成纤细胞生长因子8a培养12 d，第3天补充加入CHIR；第13天，在前面基础上加入转化生长因子β、DAPT培养17 d。②方案B:诱导性多能干细胞传代培养后，加入LDN-193189、SB431542、Noggin培养1 d后，补充加入Noggin、SAG培养2 d；第3天，加入CHIR、成纤细胞生长因子8a、Wnt1、RA培养8 d；第11天，加入CHIR培养2 d后，加入脑源性神经营养因子、cAMP、转化生长因子β、胶质细胞源性神经营养因子、抗坏血酸、DAPT培养17 d。③方案C：诱导性多能干细胞传代培养后，加入LDN-193189、SB431542、Noggin、SAG、CHIR、成纤细胞生长因子8a、Wnt1、RA培养11 d；第11天，加入CHIR培养    2 d后，加入脑源性神经营养因子、cAMP、转化生长因子β、胶质细胞源性神经营养因子、抗坏血酸、DAPT培养17 d。④方案D：诱导性多能干细胞传代培养后，加入SB、Noggin、SAG、CHIR、成纤细胞生长因子8a、Wnt1、RA培养11 d；第11天，加入CHIR培养2 d后，加入脑源性神经营养因子、cAMP、转化生长因子β、胶质细胞源性神经营养因子、抗坏血酸、DAPT培养17 d。不论ABCD4种方案，在前5 d都采用SRM培养基，在5-11 d都采用N2培养基，在11-30 d都采用Neurobasal培养基。 Kwon小组[12]对神经前体细胞的诱导分化方法相比上述2种则稍有不同[9]：在室温下，诱导性多能干细胞被胰酶消化4.0-5.0 min，成为单个细胞；在培养皿中，用增补了LIF的胚胎干细胞培养基将消化好的细胞制成细胞悬液，反复20 min直至排除滋养层细胞。为了诱导分化，本试验采用悬滴法形成拟胚体。这些悬滴在室温且湿润的条件下，在10% CO2恒温箱中孵育3 d。在第4天的时候，收集明显增大的细胞滴，并将其接种在1.5%明胶包被的培养皿中培养24 h。nestin为神经前体细胞的标志物，选择nestin阳性的细胞，将其培养在ITSFn培养基中。细胞用此培养基培养7-9 d，每一两天换1次液。将神经前体细胞从培养皿中剥离下来，并接种到包被了多聚鸟胺酸和纤连蛋白的培养皿中，细胞浓度大概为75 000个/cm2。培养24 h后，进行细胞扩增。将神经前体细胞置于ITSFn培养基中培养4 d，并增补20 nmol/L孕酮、100 nmol/L的腐胺、1 mg/L的层粘连蛋白、10 μg/L碱性成纤细胞生长因子、500 μg/L的SHH、100 μg/L的成纤细胞生长因子8b、100 U/mL的青霉素、100 mg/L的链霉素。神经前体细胞的体外分化用的N3培养基培养8-10 d，其中用200 μmol/L的抗坏血酸替代了碱性成纤维细胞生长因子。 Kikuchi小组[13]采用无饲养层培养基，通过悬浮法诱导神经前体细胞：用Accumax细胞分离液，将人诱导性多能干细胞块分离成单个细胞，并快速接种到加入分化培养基的96孔低细胞黏度的培养板上，使其快速再聚集。分化培养基为DMEM/F12培养基，增补了5%的KSR、2 mmol/L的谷氨酸盐、0.1 mmol/L的非必需氨基酸和0.1 mmol/L的2-巯基乙醇。在前3 d，加入50 μmol/L的Y-27632， 2 μmol/L的dorsomorphin和 10 μmol/L的SB-431542到培养皿中。第14天，诱导性多能干细胞源细胞球形成，接种到Petri培养皿中，并加入增补了B-27和2 mmol/L左旋谷酰胺的neurobasal培养基。第14-28天，加入SHH、100 g/L的成纤细胞生长因子。28 d后，换用增补了B-27、2 mmol/L的左旋谷酰胺、2 μg/L的胶质细胞源性神经营养因子、    10 μg/L的脑源性神经营养因子、1 mmol/L的dbcAMP和200 nmol/L的抗坏血酸的neurobasal培养基，将神经前体细胞诱导分化为成熟的多巴胺能神经元。 Han小组[14]采用鼠MEFs为饲养层细胞，诱导性多能干细胞体外诱导分化流程如下：首先将诱导性多能干细胞接种到加有胚胎干细胞培养基的六孔培养板上，以MEFs为饲养层细胞。在前4 d，用增补了SB431542和Noggin的标准胚胎干细胞培养基培养诱导性多能干细胞，并形成诱导性多能干细胞克隆。第5天，移除SB431542和Noggin，并加入200 μg/L的SHH。再维持培养5 d后，加用脑源性神经营养因子(20 μg/L)、抗坏血酸(200 mmol/L)、SHH(200 μg/L)和成纤细胞生长因子8b(100 μg/L)。维持培养7 d后，细胞被接种到多聚左旋鸟胺酸/层粘连蛋白包被的六孔培养板上，加入增补了脑源性神经营养因子、抗坏血酸、胶质细胞源性神经营养因子(10 μg/L) ，转化生长因子β(1 μg/L)和cAMP(500 mmol/L)的DMEM: F12/N2培养基，再培养1-3周。 2.2.3 总结上述诱导性多能干细胞体外诱导分化方案 诱导性多能干细胞体外诱导分化条件的不断改良，也致使其方案的不断优化。Cooper小组[10]的诱导分化周期为49 d，其他小组的诱导分化周期均保持在28 d左右，周期的缩短也明显提高了诱导性多能干细胞体外诱导分化的效率。Cooper小组[10]和Sundberg小组[11]在诱导性多能干细胞的体外诱导分化中加入了11种乃至11种以上的生长因子，且重复加入同一生长因子的次数多；Han小组[14]在Sundberg小组[11]体外分化条件的基础上，将诱导性多能干细胞体外分化必需的生长因子缩减到8种，在一定程度上优化了实验；Kwon小组[12]和Kikuchi小组[13]分别通过悬滴法和悬浮法诱导诱导性多能干细胞分化为神经前体细胞，并减少了加入生长因子的种类和重复次数，简化了实验流程。 2.3 帕金森病模型的选择 目前用于帕金森病实验研究的常见帕金森病模型动物为：大鼠、灵长目类动物（猕猴、食蟹猴、恒河猴等）、小型猪。帕金森病模型的建立为日后的移植效果检测奠定了基础，目前常用的诱导剂为6-羟基多巴胺和MPTP[15-16]。由于异种移植所无法避免的免疫排斥反应，单纯的6-羟基多巴胺和MPTP诱导损害的帕金森病模型在移植时都需加用免疫抑制剂。为了优化模型，避免移植后免疫反应对移植神经元的攻击，Samata小组[17]巧妙的利用罹患X-性连锁重症联合免疫缺陷病的大鼠，建立了6-羟基多巴胺诱导的帕金森病模型；这种6-羟基多巴胺诱导的X-性连锁重症联合免疫缺陷病大鼠模型在后续的移植实验中，在不加用免疫抑制剂的条件下，并未产生免疫移植反应，且移植后大鼠的旋转行为得到改善[17]。 2.4 人诱导性多能干细胞源神经元的移植 2.4.1 移植效果的评价手段 流式细胞仪为多巴胺能神经元的纯化提供了良好的保障[18-19]。将纯化后的多巴胺能神经元制成细胞悬液，注射到模型动物纹状体的定位坐标位置[20-25]。后续对模型动物进行行为学分析、影像学显影扫描和尸检后的大脑组织切片的免疫组织化学等检测[26-27]。 2.4.2 各小组的多巴胺能神经元移植效果 Hallett小组[28]分别采用了Cooper小组[10]和Sundberg小组[11]的诱导性多能干细胞体外诱导分化方案，并将2种方案分化所得的成熟的多巴胺能神经元进行移植试验。其中，MF25-04食蟹猴接受Cooper小组[10]的诱导分化方案，而MF27-04和MF66-02食蟹猴接受Sundberg小组[11]的诱导分化方案，这三系动物都经MPTP损害以构建帕金森病模型。移植后6个月，MF25-04模型动物日间肌动活动计数增加了146%，在接下来的18个月中，MF25-04模型动物的肌动活动保持上升趋势，增加范围从178%到292%，移植后2年，该模型动物的肌动活动是MPTP损害模型基线的188%。实验中，鉴于稳定的双侧MPTP 损害模型，通过运动分析面板实验给单侧移植提供了一个评价运动功能不对称的机会。相比基准值，MF25-04 模型在移植后12个月，左侧(移植对侧)上肢使用时运动机能的进行性改善被关注到，肌动活动的减少在移植后24个月有了一定的意义(统计学上)；而右侧上肢使用时的运动机能在移植后24个月并没有得到显著的改善。帕金森病症状的严重性，也通过帕金森病评定量表按月进行评估：Hallett小组[28]观察到，MF25-04模型在量表中的运动功能减退部分改善了，从移植前的2分(最高3分)，到移植后12个月的0分，且0分一直稳定维持到研究结束。然而，相比MF25-04模型，移植后一两年，MF27-04和MF66-02 模型动物在总的肌动活动、运动分析面板实验或运动功能减退方面没有显著的改变，这也暗示了中脑多巴胺能神经元移植后的存活不足。在尸检时发现，接受移植后的食蟹猴的壳核区仅有不足50个多巴胺能神经元存活。自从观察到MF25-04动物自体移植后运动症状功能改善，Hallett小组[28]采用11C-CFT-PET 显影扫描神经元移植2年后的尾状核和壳核区的多巴胺能神经末梢。他们观察到，对比未移植的左侧壳核，2年后，右侧壳核11C-CFT的结合位点有明显的增加，这正说明了移植区存在有功能的多巴胺能神经元。络氨酸羟化酶免疫反应活性多巴胺能神经元的体视学细胞计数表明移植区壳核有13 029个移植神经元存活。作为对照， MF27-04和MF66-02各自有8 551和7 938个络氨酸羟化酶免疫反应活性多巴胺能神经元存活。MF25-04，MF27-04和MF66-02络氨酸羟化酶免疫反应活性神经纤维在壳核区的生长的比较显示，MF25-04有更多更广泛的多巴胺能神经再支配，这个结果与动物功能恢复的观察结果相一致。这些数据都提示：运动功能的改善需要足够数量存活的中脑多巴胺能神经元和移植物在壳核内适当的神经再支配；反之，运动功能无法恢复。种种数据显示，在一系列的分化方案中，Cooper小组[10]的神经元分化条件相比Sundberg小组[11]更为成功。 Kikuchi小组[13]选用MPTP损害的食蟹猴作为接受神经元移植的帕金森病模型动物，选取培养天数不同的2组神经前体细胞，28 d和42 d，进行移植试验。移植后6个月，MRI显示移植细胞存活并在食蟹猴的大脑中增殖。Kikuchi小组[13]用MRI来测量移植物在宿主中的大小。根据MRI得出，42 d移植物明显小于28 d移植物，从生长速度来看，28 d也比42 d占优势。当然，日后的大脑切片苏木精-伊红染色也证实了MRI的显影结果：在28 d移植物中，有更多的细胞聚集，相比42 d移植物来说。免疫组织化学结果显示：相比42 d移植物，在d28移植物中，有更多的Vimentin+细胞和更少的Nestin+细胞。Ki67为增殖细胞的标记物，其表达的比率在28 d移植物中明显高于42 d移植物。28 d移植物中Ki67阳性的细胞也同时表现为Vimentin阳性，这表明移植物中增殖细胞为未成熟的神经细胞和间叶细胞。反之，d42移植物中Ki67阳性的细胞也同时表现为Nestin阳性，表明移植细胞的一部分仍然是神经前体细胞，一部分为增殖细胞。当然，Kikuchi小组[13]还对移植物的体内分化情况进行了检测。TH+细胞位于移植物外围，其密度显然在42 d移植物组更高。同时，这些TH+细胞也表达成熟多巴胺能神经元的标志物，如：Nurr1，VMAT2，DAT，Girk2和Pitx3。结果表明在食蟹猴的大脑中，42 d移植细胞分化为多巴胺能神经元更为高效。后续还采用帕金森病运动等级评分和人工录像分析来评价移植后动物的行为学表现。根据帕金森病等级评分，移植后6个月猴的行为学表现得到轻微的改善；根据人工录像分析，移植后6个月猴的自发运动和拾物速度也有一定的改善。综合结果显示：42 d悬浮细胞球移植效果优于28 d，且移植的神经前体细胞在食蟹猴大脑中分化为多巴胺能神经元并存活。  Han小组[14]与Kikuchi小组[13]一样，也是将诱导性多能干细胞源的神经前体细胞移植到帕金森病模型。不同的是，采用的模型动物为6-羟基多巴胺损害的大鼠，并选用阿扑吗啡诱导的旋转试验作为行为学测验。平均来说，移植后4周和8周时，大鼠的旋转率分别下降到0.674和0.703(PBS对照组则分别为0.960和0.953)，然而，在统计学上实验组和对照组的旋转率无明显差别。移植后12周和16周，旋转率下降到0.577和0.518，对比对照组的0.997和1.008，此时统计学上实验组与对照组有差异，这也说明了移植细胞需要多于2个月的时间才能在体内发挥作用。移植后，转棒试验时间的进行性延长被观察到。移植后4，8，12和16周的转棒试验时间平均为74.63 s、89.63 s、110.25 s和120.37 s，相比对照组的29.25 s、29.75 s、34.25 s和47.50 s明显延长，且在统计学上有意义。这些运动行为测试都表明移植的诱导性多能干细胞源神经前体细胞能够恢复一部分的6-羟基多巴胺损害帕金森病的功能缺损。当然，后期的大脑切片免疫组织化学检测也印证了动物行为学检测的结果：移植物中仅有1/5左右的成熟神经元(Tuj1阳性)，大部分都分化为星形胶质细胞(阳性)。 2.4.3 总结各小组的移植结果 Hallett小组[28]采用了2种分化条件所得的多巴胺能神经元进行移植试验，不仅通过移植后效果对两种分化条件进行评价，还采用了多种手段对模型动物进行检测以评估移植效果，给以后的实验研究提供了大量的参考依据。而Kikuchi小组[13]和Han小组[14]，移植的细胞都为未分化成熟的神经前体细胞，后期的检测更多的采用行为学测验和大脑切片免疫组织化学试验，然而移植细胞的体内分化效果并不如人意，后期行为学功能也只有部分得到恢复。4个小组的实验结果对比，提示了神经前体细胞移植后的体内分化难以把控。相比之下，优化诱导性多能干细胞的体外诱导方案，移植纯化的多巴胺能神经元更有前景和研究意义。 2.5 关于移植后路易小体的出现 2.5.1 路易小体为帕金森病的典型病理表现 黑质中的路易小体是帕金森病的典型病理表现，其主要成分为α-突触核蛋白、富含亮氨酸重复序列激酶2、组蛋白去乙酰化酶6、带电多泡体蛋白质2B [29-31]。帕金森病模型中，路易小体在大脑中广泛分布。究其原因，主要是蛋白质的错误折叠并聚集，从而形成的蛋白质包涵体——路易小体[32]。对于帕金森病患者而言，具有聚集倾向的α-突触核蛋白是导致路易小体的最主要原因。α-突触核蛋白是由140个氨基酸组成的14 000大小的蛋白质，位于突触前末梢和细胞核、细胞质以及细胞膜上[33]。  到目前为止，α-突触核蛋白在基因编码中发生的6种不同的错义突变——p.A53T，p.A30P，p.E64K， p.H50Q，p.G51D，p.A53E，已经被认为是引起常染色体显性形式的帕金森病的主要原因[34]。尽管α-突触核蛋白准确的功能仍然未知，但目前实质的证据表明α-突触核蛋白的功能和它直接与细胞膜磷脂质相互作用的能力有关，尤其是有弧度的细胞膜，比如囊泡。这表现为在神经递质释放时，α-突触核蛋白能对囊泡转运这一过程发挥作用。在水溶液中，α-突触核蛋白通常被归类为天然的未折叠的蛋白质。然而，α-突触核蛋白在已经确定的病理条件下(比如突触核蛋白的基因突变，氧化应激和翻译后修饰)，会形成低聚物或者纤维状结构。  逐渐增加的证据表明：病理的α-突触核蛋白种类包括翻译后修饰的，基因突变的，低聚物的或者是聚合物的形式。这些病理的α-突触核蛋白种类，也许能通过某些机制诱发毒性反应，例如干扰神经递质释放时α-突触核蛋白的正常功能(此处也许α-突触核蛋白作为多巴胺释放的负调节蛋白)，损害线粒体结构、复合体Ⅰ活性、线粒体动力学和线粒体自噬，干扰内质网和高尔基体间囊泡的转运导致的中毒性内质网应激，和损害某些蛋白质降解机制的效能。这些毒性机制干扰了细胞的正常生理，因而导致了细胞的损伤和最终的死亡[35]。α-突触核蛋白也许存在的自蔓延现象，和其通过细胞间的传输机制在互相连接的大脑区域进行性播散，这一概念在近年来被强烈推崇。帕金森病动物模型显示，α-突触核蛋白导致的损害不仅存在于黑质中，还存在于大脑的其他区域，包括周围神经系统和中枢神经系统。根据Braak分期假说[36]，帕金森病也许起源于中枢神经系统以外，通过退化的轴索和跨神经元运输，促使病原体进入中枢神经系统，而在此错误折叠的α-突触核蛋白可能是该病原体的候选蛋白质。α-突触核蛋白病理学在罹患路易病的帕金森病患者外周自主神经系统中大量存在，这一点也支持了上述理念[37-38]。 2.5.2 探讨多巴胺能神经元移植后路易小体的形成机制 继Braak假说后，又有2个小组分别报道了接受DA神经元移植的帕金森患者在多年后的病理学表现：实验表明，在人脑中，路易小体病理学表现从宿主播散到移植物中。紧随着这些发现，“阮病毒”和“类阮病毒”的学说时代被开启了，且被广泛的应用于α-突触核蛋白蛋白潜在发病机制的描述。在此学说中，α-突触核蛋白能被宿主本身的活细胞释放(通过胞外分泌的激活)，也能被死亡细胞释放到周围的细胞外环境。此后，移植的神经元能够通过不同的途径获取释放的α-突触核蛋白，包括内吞作用。一旦进入到移植神经元的内部，外源性的α-突触核蛋白会作为模版促进蛋白质的错误折叠，从而内生性的产生α-突触核蛋白，最终导致路易小体的形成。当然，路易小体病理学呈现的差异或者出现与否，与应用的组织学条件、移植环境、移植后的时间或者帕金森病患者之间的个体差异有关[39-40]。"