2.1   神经生长因子概述   神经生长因子在神经生长、存活、分化和髓鞘形成过程中发挥重要的调控作用[4]。神经生长因子调控细胞行为的主要方式是作为配体与细胞表面受体结合，常见的神经生长因子受体包括高亲和力受体原肌球蛋白相关激酶A(tropomyosin-related kinase A，TrkA)和低亲和力受体神经营养因子受体p75(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)[5]。 神经生长因子通过与TrkA受体结合激活促进细胞存活、分化和生长的信号通路[6]。TrkA具有受体酪氨酸激酶活性，与神经生长因子结合后可通过磷酸化激活级联反应启动信号传导[7]。TrkA受体激活的下游信号通路已经得到了广泛研究，主要包括细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases/extracellular signal-regulated kinase，ERK/MAPK)通路、磷脂酰肌醇三激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B，PI3K/Akt)通路、磷酸肌醇特异性磷脂酶C/ 蛋白激酶C(phosphoinositide-specific phospholipase C/protein kinase C，PLC/PKC)通路等[8]。此外，神经细胞上与神经生长因子结合的TrkA还可形成信号内吞体，沿轴突逆向运输，并以细胞外囊泡形式被神经元释放，从而作用于体细胞[9]。 p75NTR不具有酪氨酸激酶活性，因而通常与其他跨膜蛋白结合，以实现其下游作用[10]。在缺乏TrkA受体的情况下，p75NTR受体倾向于促进细胞死亡[8]。成熟神经生长因子对TrkA受体的亲和力强于p75NTR受体，而神经生长因子前体则缺乏对TrkA受体的亲和力，主要作为p75NTR受体的有效配体诱导细胞凋亡[11]。p75NTR与细胞凋亡高度相关，被视为一种神经细胞死亡受体。然而，当TrkA受体存在时，p75NTR的作用转为增强TrkA对神经生长因子的敏感性，进而促进靶细胞存活和分化[12]。p75NTR与TrkA的共表达可产生神经生长因子的高亲和力结合位点，从而显著提升TrkA对神经生长因子的结合能力和特异性[8]。因此，p75NTR可通过激活不同的信号通路，产生不同的调节作用，这是神经生长因子作用多效性的基础[13]。 神经生长因子及其受体的表达分布于多种组织细胞，包括单核细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞在内的多种非神经细胞同样受到神经生长因子的调控[14-15]。通过对这些非神经细胞的调控，神经生长因子可作为信号传导因子参与多种重要生理和病理过程，如炎症反应[16]、血管生长[17]、痛觉产生等[18]。因此，神经生长因子不仅作为组织工程靶点受到重视，还被认为具有广阔的临床应用前景。 2.2   神经生长因子对骨形成的调控   2.2.1   神经生长因子对骨形成的调控作用概述   神经生长因子受体广泛分布于骨组织及支配骨的神经血管中。早期文献即指出，神经生长因子可增强骨折模型中神经支配和骨再生，从而加速骨愈伤组织骨化[19]。近期研究证明，神经生长因子可通过引导神经血管长入、与骨组织细胞膜上受体结合、协同力学刺激信号等多种方式促进骨骼的形成、分化和愈合[20]。神经生长因子在骨形成领域的研究进程，见表1。 神经支配和血管生成在骨形成中起着至关重要的作用，而骨骼中大多数神经纤维和血管细胞表达TrkA受体，神经生长因子可以通过TrkA受体将感觉神经轴突和新生血管引导至初始骨化部位，通过促进血管形成和神经长入正向调控骨形成过程。LI等[21]使用免疫荧光技术对神经生长因子在骨骼中的表达进行定位，发现生理情况下成熟皮质骨中几乎不表达神经生长因子，神经生长因子"

主要分布于骨膜，而骨损伤后愈伤组织内神经生长因子表达显著增强且持续升高，说明神经生长因子与骨骼的生长和修复存在显著关联。上述研究发现，在应力性骨折后形成的骨折愈伤组织中，首先发生神经纤维再支配，愈伤组织中多数细胞表达神经生长因子引导新生神经、血管长入，愈伤组织面积扩大；随着神经生长因子整体表达水平下降，神经血管长入减缓，此时神经生长因子表达主要集中于成骨细胞，引发愈伤组织骨化。而使用阻断剂抑制神经生长因子可导致神经再支配减少、血运重建减弱、总成骨细胞活性降低以及骨折愈伤组织骨化的显著延迟，提示引导新生神经和血管长入是神经生长因子影响骨骼的重要方式之一，见图3。"

神经生长因子对骨组织内的各种细胞具有直接调控作用[22]。刘国铭等[23]发现神经生长因子可促进骨组织细胞中骨形态发生蛋白2表达，通过骨形态发生蛋白2/Smad通路促进骨折愈合。研究发现神经生长因子可促进Runt相关转录因子2蛋白表达，提示神经生长因子可能通过增强骨形态发生蛋白2/Smads/Runt相关转录因子2信号级联反应促进骨形成[24]。另外，王裕祥等[25]发现神经生长因子还可与转化生长因子β、成纤维细胞生长因子协同促进骨修复。通过与多种靶细胞膜上受体结合激活胞内信号通路，神经生长因子可直接影响骨组织细胞的生长、分化、代谢、凋亡，从而调节骨骼的生理进程和病理变化。 现有研究指出，力学负荷对骨组织的生长、发育和修复均存在重要影响，而骨细胞感知力学信号和传递生物信号的机制仍不清楚[26]。研究表明，长时间、剧烈的体育锻炼可引发血清神经生长因子水平升高[27]。成熟的成骨细胞在力学负荷下可产生神经生长因子，而神经生长因子表达是力学负荷实现最大骨形成的必要条件之一，神经生长因子-TrkA信号传导可能是骨细胞接受力学刺激的主要通路之一[28]。FIORAVANTI等[29]证明对小鼠四肢长骨施加力学负荷后，骨骼中神经生长因子水平显著上升。而TOMLINSON等[30]发现给予小鼠注射外源性神经生长因子增加了力学刺激诱导的骨形成速率，抑制TrkA信号传导显著降低了前肢受轴向力学刺激后的骨形成速率。神经生长因子在骨骼接受力学刺激调节过程中的作用，以及周围神经血管通过神经生长因子参与这一过程，可能是进一步研究的方向。 2.2.2   神经生长因子通过促骨髓间充质干细胞增殖分化促进骨形成   神经生长因子通过调节间充质干细胞的活性和功能对骨形成过程进行正向调节。骨髓间充质干细胞可以促进骨骼基质形成并矿化为骨组织，还可协调骨折愈合的阶段转换过程，在骨形成过程中具有重要作用[31-32]。骨髓间充质干细胞本身可分泌包括神经生长因子在内的神经营养因子，同时还能促进施万细胞分泌神经生长因子[33-34]。骨髓间充质干细胞又可受到位于骨膜的交感神经和感觉神经纤维分泌的包括神经生长因子在内的神经递质调节[35]。崔国胜等[36]发现经神经生长因子处理的骨髓间充质干细胞的成骨分化基因表达水平和钙化能力均显著增加。FANG等[37]研究进一步发现神经生长因子过表达可增强骨髓间充质干细胞的细胞活力、黏附能力和迁移能力，而敲除神经生长因子则对骨髓间充质干细胞呈现相反的效果，同时，敲除神经生长因子受体TrkA的骨髓间充质干细胞同样表现出细胞活力下降、黏附功能降低等特征。通过促进间充质干细胞成骨分化，神经生长因子对骨形成发挥重要的促进作用。 神经生长因子对骨髓间充质干细胞及其衍生细胞的促增殖分化作用已得到大量研究支持，但是神经生长因子的作用浓度范围仍需探索。YE等[38]通过复合涂层释放神经生长因子显著增强了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，但该释放量不能促进骨髓间充质干细胞的黏附和增殖。AN等[39]研究发现，随着神经生长因子添加量的增加，对MC3T3细胞成骨分化的促进作用先增大后减小，在水凝胶中神经生长因子浓度达到0.5%之前，成骨分化呈剂量依赖性增加，然而，神经生长因子高于0.5%浓度对成骨细胞分化反而表现出抑制作用。现有研究结果显示神经生长因子对成骨分化的作用或许存在与剂量相关的多效性，提示不同浓度神经生长因子对成骨的影响可作为未来的研究方向。 2.2.3   神经生长因子通过促破骨细胞分化成熟调控骨形成   破骨细胞是来源于单核细胞/巨噬细胞造血谱系的骨吸收多核巨细胞，也是主要的骨吸收细胞[40-41]。神经生长因子与其受体TrkA共同在多核破骨细胞中表达[42]。通过促进破骨细胞分化成熟，神经生长因子可抑制过度的骨形成并促进骨重塑[43]。而神经生长因子对破骨细胞的具体作用受到神经生长因子剂量和其他因素的影响。MELONI等[44]研究证实了神经生长因子诱导破骨细胞成熟的能力，但是该研究同时指出，较高剂量(100 ng)的神经生长因子干预后小鼠单核细胞向破骨细胞分化的能力反而不如较低剂量(10，50 ng)的神经生长因子。这种表现不能简单地用过量神经生长因子使TrkA受体饱和解释，提示与神经生长因子对骨髓间充质干细胞的作用类似，神经生长因子对破骨细胞的影响可能同样存在剂量相关的多效性。 神经生长因子在破骨细胞核因子受体激活因子κB配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)非依赖性生成过程中扮演的作用同样受到重视。生理情况下，RANKL/核因子κB受体活化因子信号转导是破骨细胞形成的主要途径[45]。但是在某些情况下，特别是在与病理性骨吸收相关的疾病中，包括神经生长因子在内的其他细胞因子可以替代RANKL促进破骨细胞的分化[46]。体外研究显示，将神经生长因子添加到单核细胞培养物中可诱导抗酒石酸盐酸性磷酸酶阳性的多核破骨细胞的形成，其效果是增殖诱导配体或B细胞活化因子诱导效果的5倍，与用白细胞介素6或转化生长因子β处理的培养物相当[47]。然而，另一体外研究证明，在没有RANKL的情况下，神经生长因子在体外显著增加了破骨细胞的数量，但是，在RANKL存在的情况下，不同浓度神经生长因子不仅没有增强RANKL的作用，反而减少了抗酒石酸盐酸性磷酸酶阳性破骨细胞的数量[48]。神经生长因子与RANKL单独使用时均对破骨细胞存在促形成作用，两种因子同时存在时反而表现出负面作用，这一反常现象的机制和原理需要进一步研究探索。神经生长因子介导的破骨细胞生成过程不仅体现了神经生长因子对骨形成的负向调节能力，还可能与骨吸收过度导致的疾病有关。 2.2.4   神经生长因子通过神经-血管耦合调控骨形成   非骨骼系统，包括血管系统和神经系统，也是骨骼生理环境的关键参与者[49]。骨骼形成、发育、再生和重塑过程中，新长入血管在提供营养和氧气方面起着至关重要的作用[50]。早期研究认为骨组织再生可以定义为一种成骨与血管生成相互影响的复杂机制[51]。近期研究已经注意到，在骨组织生长和血管长入过程中，神经调控同样扮演极为重要的角色，并在此基础上提出了骨骼中的神经-血管耦合机制[52]，即神经可通过分泌神经递质和神经肽来调节骨代谢并引导血管长入[53]。 LI等[21]研究首先提出，在骨修复过程中，感觉神经对骨折愈伤组织的再支配在时间上早于新骨形成部位的血管形成，且两者的轨迹会相互影响；同时，在神经生长高峰与血管生长高峰之间，愈伤组织出现了神经生长因子表达高峰，说明神经生长因子在神经调控血管形成的过程中起到关键作用。在近期研究中，LIAN等[54]发现神经生长因子诱导骨髓间充质干细胞产生的外泌体在显著促进施万细胞增殖、迁移及营养神经功能的同时，通过施万细胞增强骨髓间充质干细胞的成骨分化能力；在体内实验中，此外泌体促进了多孔支架中的骨整合，并显著增强了血管、神经向支架内生长。关于神经生长因子对血管内皮细胞影响的研究显示，神经生长因子存在显著促血管形成的作用[55]。神经生长因子能通过TrkA和p75信号传导诱导人脐静脉内皮细胞分化和管腔形成[56-57]。神经生长因子在骨髓干细胞、施万细胞、血管内皮细胞等组织细胞中的表达使其对骨修复、周围神经再支配和血管形成等过程均具有重要的影响。同时，神经生长因子还可作为信号传递因子在血管、神经与骨之间发挥沟通作用(图4)。目前研究认为神经生长因子可能在神经-血管耦合机制中起到关键作用，但具体机制仍需进一步研究[1]。"

神经生长因子通过骨骼中神经-血管耦合机制对病理骨骼的影响可能与多种骨科疾病有关。Li等[21]研究指出，神经生长因子在骨痂处的表达在骨愈合后消失，并再次局限表达于骨膜。但在骨不愈合或愈合不良的情况下，神经生长因子表达可能持续存在于未愈合处，从而导致感觉神经过度支配，进而产生慢性疼痛。此类异位神经萌发已被证明与未愈合骨骼的慢性疼痛有关[58]。同时，有观点认为，神经生长因子对血管生成的抑制作用，可能是导致抗神经生长因子药物在临床试验中出现骨坏死和快速进展性骨关节病等不良反应的原因之一[59]。目前，以神经生长因子为核心的神经-血管耦合机制已经在骨组织工程研究中得到了大量的应用(表2)，但是其负面影响和在病理过程中的作用仍然缺乏关注。"

2.3   神经生长因子与骨相关疾病的关系    2.3.1   神经生长因子对软骨组织的影响   神经生长因子与多种骨疾病有关，这种关联往往表现为软骨组织中神经生长因子的高表达。GAO等[64]通过单细胞RNA测序认为正常状态下的软骨组织细胞中神经生长因子表达水平极低，这可能是因为生理状态下软骨组织的再生能力较弱，且神经血管分布较少，故神经生长因子在成熟软骨组织细胞中的表达和作用较不显著[65]。SANG等[66-67]在基于小鼠骨折模型的研究中发现，软骨愈伤组织中出现了明显的神经生长因子表达，而通过转基因技术提高神经生长因子表达则明显促进了软骨生长分化和软骨细胞分化转录因子SOX9基因的表达。因此，可以认为神经生长因子在软骨组织中的表达与在骨组织中的表达类似，在生理情况下较低，而在软骨增殖活跃的情况下才会出现短时间内的快速升高，常见于各种关节炎症和软骨损伤或病理性增生。 神经生长因子对软骨组织的影响主要通过对神经、血管的影响间接实现。CHERIEF等[68]研究指出，创伤早期的软骨愈伤组织中神经生长因子表达急剧增加，随后引发神经血管长入，使用TrkA激动剂后，血管长入和血管网进一步成熟，软骨修复能力显著增强，甚至可导致异位骨化。YU等[69]发现与经过神经生长因子预处理的软骨细胞共培养后，内皮细胞的体外血管生成活性显著增强，而敲除软骨细胞上的TrkA受体则显著消除了上述影响。研究指出神经生长因子不仅可以直接作用于周围神经和血管促进长入，还可能通过作用于软骨细胞激活PI3K/Akt信号通路的方式影响血管内皮细胞间接促进血管长入。生理情况下除部分半月板外，软骨组织内血管通常缺如，血管长入软骨组织多见于关节炎症等病理情况，因此神经生长因子对软骨神经和血管的积极影响可能与各种骨软骨疾病高度相关。 2.3.2   神经生长因子与关节炎的关系   神经生长因子不仅能通过神经血管参与骨软骨病理过程，还能作为炎症因子和疼痛递质介导多种关节炎症[70]。目前研究已经证实，在骨关节炎和类风湿性关节炎患者的关节软骨和滑液中，神经生长因子表达水平均升高[71-72]。这些关节炎症均会出现滑膜血管增生和软骨下骨重塑，而增生血管和软骨内成骨的分布与神经生长因子表达高度相关[73]。因此，神经生长因子作为潜在的关节炎治疗靶点受到广泛重视。LIN等[74]发现，在类风湿性关节炎的发病过程中，神经生长因子可以增强从幼稚巨噬细胞到M1型巨噬细胞的极化，从而加剧炎症并介导关节损伤。神经生长因子还作为重要的疼痛相关因子介导关节炎疼痛，这种疼痛极大地导致了关节功能受限和生活质量下降[75]。NWOSU等[76]发现，通过抑制TrkA阻断神经生长因子信号传导可减轻骨关节炎大鼠疼痛。因此，目前多数研究认为抑制神经生长因子和TrkA可以减轻患者痛苦并延缓疾病进展。 然而，由于神经生长因子作用存在多效性(图5)，在关节炎治疗中，抑制神经生长因子-TrkA信号的效果仍然存在争议，尚不明确是否存在显著的负面影响[77]。在慢性关节炎患者中，外周血和滑液单核细胞中TrkA表达显著降低，导致神经生长因子对炎性细胞因子释放的抑制作用丧失，提示抑制神经生长因子-TrkA信号通路反而可能对关节炎患者产生不利影响[78]。同时，由于神经生长因子对成骨的促进作用，阻断神经生长因子表达的治疗方案可导致快速进展性骨关节炎等不良反应[79]。MENGES等[80]研究指出，抗神经生长因子抗体对不稳定关节中的软骨下骨和软骨等结构有负面影响，可能会加剧关节损伤。ZHAO等[81]针对骨关节炎的研究发现，抑制神经生长因子信号会导致骨关节炎关节的骨重塑受到阻碍和延迟。如何在避免不良反应的情况下发挥神经生长因子在关节炎治疗中的价值，是未来研究关注的重点问题。"

2.3.3   神经生长因子与骨肿瘤的关系   ANTUNES等[82]最早通过免疫荧光证明神经生长因子及其受体在原发性骨肉瘤中表达。HOU等[83]指出在骨肉瘤组织中神经生长因子的表达显著高于其他生长因子，细胞实验证明神经生长因子通过上调基质金属蛋白酶2表达促进了骨肉瘤细胞转移。研究表明，在癌症发生早期开始持续的神经生长因子抑制治疗，可有效减少肿瘤诱导的骨破坏，延迟骨折时间，延长肢体使用时间[84]。另一方面，骨是癌症转移的首选靶器官之一，骨与肿瘤中的神经可通过相互交流促进癌症进展和转移[85]。神经生长因子作为神经源性信号因子，可在包括乳腺癌、口腔鳞状细胞癌、前列腺癌在内的多种恶性肿瘤向骨转移的过程中发挥重要作用[86-88]。 神经生长因子与骨肿瘤的关系与其高亲和力受体TrkA有关，TrkA的编码基因NTRK1可能发生融合突变，从而持续激活下游通路[89]。因此，研究认为在骨恶性肿瘤的治疗中，以拉罗替尼为代表的抗神经营养性酪氨酸受体激酶药物具有极大潜力[83]。然而，阻断神经生长因子-TrkA信号传导的治疗方案存在多种与骨破坏有关的并发症[90]。针对神经生长因子的单克隆抗体药物研究也由于其严重不良反应被多次中止[91-92]。因此，抗神经生长因子方案的临床应用仍面临诸多问题，神经生长因子对骨骼的复杂影响尚未得到充分研究是限制其临床应用的主要原因。 2.3.4   神经生长因子与骨痛的关系   在骨相关疾病的临床研究中，神经生长因子作为致痛因子诱导疼痛的能力受到特别重视[93]。神经生长因子受体在大部分骨伤害感受器中表达，外源神经生长因子可通过TrkA受体迅速激活和敏化骨伤害感受器[94]。其中，神经生长因子在肿瘤导致的骨痛中发挥的作用尤其受到关注。在骨骼原发性和继发性肿瘤中，肿瘤细胞可通过神经生长因子-TrkA信号通路诱导感觉和交感神经末梢长入肿瘤组织，从而导致癌症相关骨痛[95-96]，骨痛的程度会随肿瘤发展进行性加重，其潜在机制与损伤、炎症、肿瘤侵犯以及其他多种神经病理过程有关[97-98]。抗神经生长因子治疗可以从神经和炎症两个方面减轻骨痛的程度[99]。MARTYN等[100]研究表明，即使在肿瘤组织中神经生长因子表达已经引发轴突长入和神经瘤形成的情况下，阻断神经生长因子-TrkA信号传导仍能显著减轻骨痛。目前，治疗各种疾病导致骨骼疼痛的常用药物仍为阿片类药物或非类固醇抗炎药，但是这两种药物不仅可能引发严重不良反应，还存在阻碍骨修复的风险。近期研究认为，通过使用特异性中和抗体阻断骨痛-TrkA信号通路，可以在不延迟骨愈合的情况下消除或减轻骨痛[101]。但是，KAN等[102]研究指出，神经生长因子可通过上调膜相关阿片受体增强其在癌痛模型中的镇痛作用，提示神经生长因子-TrkA信号通路也在镇痛机制中发挥上游调控作用。抗神经生长因子治疗作为传统骨痛治疗方案的替代被寄予厚望，但不良反应限制了其进一步临床应用。 2.3.5   神经生长因子的药用潜力   利用神经生长因子促进骨形成的能力治疗骨损伤疾病的临床前景同样受到关注。尽管神经生长因子已被用于多种神经损伤的临床治疗[103]，使用神经生长因子治疗骨折或骨不连依然处于临床试验阶段。由于神经生长因子作为大分子物质难以通过血液循环作用于骨损伤位置，目前研究一般采用局部注射方式给药、辅助手术治疗[104]。大量临床研究证明，使用神经生长因子可有效促进骨折术后愈合(表3)。"