2.1   KRT18在退变髓核组织中表达并广泛影响转录组图谱   现有研究表明，椎间盘退变的发病机制包括细胞外基质相关蛋白、炎症因子和细胞因子的失调等[22-24]。角蛋白家族尤其是KRT18被认为是单细胞水平上椎间盘的潜在生物标志物，但其功能尚不清楚[25]。为了进一步研究KRT18对椎间盘退行性病变的潜在影响，分析了GSE56081转录组数据集，其中包含5个退变髓核样本和5个健康髓核样本[26]。在得到所有检测到的基因水平变化后，通过对退变髓核和健康髓核样本中的所有基因进行主成分分析，可以清晰地分离出这两组(图1A)，表明了髓核转录组图谱的整体变化。MA图展示了与椎间盘退行性病变相关的差异表达基因，表明上调的差异表达基因明显多于下调的(图1B)。在4 083个上调的差异表达基因中，通过微阵列分析检测到在退变髓核组织中KRT18存在明显较高的表达(图1C)，暗示KRT18表达水平的变化能够密切调控影响椎间盘退行性病变的发生。 2.2   KRT18-RNA 相互作用图揭示了 KRT18 与成熟 mRNA 的结合能力   KRT18在先前的一项研究中被证实是一种新的RNA结合蛋白，暗示了其在椎间盘退变中的潜在功能[27]。为了深入研究KRT18在椎间盘退行性病变中可能发挥的功能，采用了一种改进的RNA免疫沉淀和测序方法(iRip-seq)来获得髓核细胞内与KRT18结合的RNA的全面基因组图谱。为此在iRIP-seq 过程中使用了Flag标记的 KRT18并进行2次独立的重复试验。蛋白免疫印迹实验验证了Flag-KRT18蛋白在总细胞裂解物和 Flag免疫沉淀 (IP) 样品中存在，而在IgG对照的IP部分中则不存在(图2A)，从而验证了iRIP过程的成功执行。将低质量的测序读数筛除后与人类基因组进行比对，随后根据对所有4个样本(2个IP样本和2个input样本)在整个转录组中映射读数分析得到，2个KRT18_IP样本展现出与input样本明显不同的聚类模式(图2B)。此外，IP和input样本对中每个检测到基因表达水平的相关图(以FPKM为单位)显示了KRT18_IP样本中特定基因的某些mRNA的偏倚(图2C，D)，这些结果证明 iRIP-seq 实验已成功进行。KRT18_IP和input样本中映射读数的基因组位置显示在5’非翻译区域KRT18相关读数存在富集(图2E)。对成熟mRNA的3个区域进行标准化读取密度分析进一步确认了KRT18在5’非翻译区域的富集(图2F)。5’非翻译是mRNA的起始区域，通常包含有调控转录和翻译的序列元件。基因在这个区域富集可能意味着它在调控转录和翻译过程中起着重要的作用，可能与mRNA的稳定性、翻译效率或其他生物学功能相关联。因此，这种富集可能表明KRT18与mRNA之间存在着良好的结合关系。 2.3   KRT18 结合峰富含CCG和CGC的基序   从iRip-seq读数中提取KRT18结合峰，通过ABLIRC流程进行分析[18]，以研究髓核细胞内KRT18对与其结合的mRNA的影响。这些峰值的基因组位置主要存在于3’非翻译区域、内含子和编码序列(图 3A，B)。进一步分析重叠峰发现在2个重复样本之间共有285个峰共享基因组位置(图3C，P=4.029 05×10-250，超几何检验)。为了找出KRT18 峰中富集的潜在序列基序，采用了 HOMER 算法，显示共有序列CCG和CGC在两次IP实验识别的峰中都明显更多(图 3D，E)，这两个基序在共享峰中排名前三，P值具有差异显著性(图3F)。说明与KRT18相互作用的mRNA在转录和翻译调控中具有重要的功能。随后对与KRT18相互作用的mRNA进行了富集功能分析，GO分析得到一些与椎间盘退行性病变强相关的生物过程通路(图3G)，包括细胞外基质组织[28-29]、胶原纤维组织[30]、DNA转录调控、衰老以及凋亡的负调节；此外，KEGG分析显示其在黏附斑和细胞外基质-受体相互作用途径中存在显著富集(图3H)；同时这些基因在凋亡和松弛素信号通路中也被发现富集[31]。这些发现表明KRT18在相关mRNA的转录和选择性剪接过程中具有重要调控作用，密切影响椎间盘退行性病变的发病机制。 2.4   KRT18结合mRNA的基因分析   为了进一步阐明与KRT18结合的mRNA在椎间盘退行性病变的潜在活性功能，将GSE56081数据集的差异表达基因与2次iRIP-seq中检测到的KRT18结合的基因峰群进行交叉，得到了182个重叠基因(图4A)，对这182个基因进行GO功能分析，分析结果显示高度富集的通路有细胞外基质组织、胶原纤维组织、MAPK级联的正向调节、细胞因子介导的信号传导途径等(图4B)。此外结果发现KRT18能够良好的结合到CRLF1和IGFBP4的5’非翻译区域(图4C，D)，其中CRLF1表达升高是黄韧带肥厚的主要反应[32]；而IGFBP4在调节细胞生长、增殖和凋亡中发挥重要作用[33]。因此推测，与KRT18结合的mRNA能够影响调控多种生物功能，并调节细胞外基质代谢，在椎间盘退行性病变的机制中发挥重要作用。 2.5   KRT18结合lncRNA的基因分析   LncRNA作为调节分子在许多生物过程和疾病包括椎间盘退行性病变中发挥着至关重要的作用[34-35]。对KRT18 iRIP-seq 数据的分析显示，两次实验中4.6%和7.1% 的峰位于非编码RNA的外显子区域区域内，该区域包含lncRNA。因此，根据所识别的基因峰群搜索与KRT18相互作用的lncRNA，将2次重复实验中筛选得到的lncRNA(包括lincRNA和反义RNA)交叉获得19个重叠的lncRNA(图5A)。在这些重叠的lncRNA中，RNU12和SNHG25始终表现出高丰度(图5B)，表明KRT18能够优先与它们相互作用。将input样本中高表达的lncRNA筛除后发现KRT18与SNHG25和SNHG12能够特异性结合，进一步可视化了这2个 lncRNA 的读数分布和结合峰(图 5C，D)，发现KRT18与其能够良好的结合。先前的研究表明，SNHG25能够调控细胞增殖及细胞凋亡[36]，同时SNHG12对炎症因子具有良好的调控作用[37]。这些发现表明KRT18与功能性 lncRNA存在较密切的相互作用，能够通过调节髓核细胞环境及炎症反应影响椎间盘退行性病变的发展。 2.6   KRT18调节细胞外基质代谢，延缓髓核细胞变性   为了进一步阐明KRT18对人髓核细胞外基质的调节影响，在人髓核细胞中使用siKRT18敲低KRT18的表达。KRT18敲低的效果通过qRT-PCR和蛋白免疫印迹进行验证，其中si-KRT18-1165表现出最明显的敲低效果(图6A，B)。在细胞外基质方面，Sox-9、Col2α1、Aggrecan、MMP-13、ADAMTS-5和MMP-3等标志物提示椎间盘退变。qRT-PCR和蛋白免疫印迹结果显示KRT18敲低后MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5水平显著升高，同时Sox-9、Col2α1和Aggrecan显著降低(图6C-E)。这些发现表明 KRT18 可能通过调节细胞外基质代谢在改善椎间盘退变中发挥关键作用。"

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