2.1   通过FRET成像显示MDCK上皮微组织的形成   MDCK细胞是一种常用的研究上皮形态发生的模型细胞系，由Rab GTP酶调控顶基底极性的形成[35]。基于FRET技术可视化观测MDCK微组织发生和ERK活性变化，构建了稳定表达ERK FRET探针的细胞株。将细胞培养在100% Matrigel凝胶上(模拟基底膜)、包埋在Matrigel凝胶中，以及培养基含有MEK抑制剂(PD98059，10 μmol/L)、RAF抑制剂(Sorafenib，5 μmol/L)的凝胶上。这2种抑制剂均是ERK上游信号分子特异性抑制剂，对照组为添加溶剂二甲基亚砜。使用含2% Matrigel的DMEM高糖培养基进行培养，每隔2 d更换1次培养基。在生长的第3，9天进行活细胞FRET成像(20倍物镜)，通过FluoCell软件程序分析FRET荧光比值(FRET/ECFP)，以及Image J软件计算细胞团的直径。其中，MDCK微组织的颜色代表FRET/ECFP的相对荧光比值，从蓝到红代表ERK活性从低到高的分布。 培养第9天之后，与包埋在Matrigel凝胶中相比，在Matrigel凝胶上生长的微组织FRET比值更高，代表了更高的ERK活性(图1A，B)，细胞团的直径更大(图1C)，提示改变培养的基质环境对MDCK微组织的形态发生有重要影响。用共聚焦显微镜拍摄培养第9天后的微组织图片，证明已形成了类似三维组织结构。使用PD98059、Sorafenib处理的MDCK微组织与对照组相比，ERK活性降低(图1A，B)，直径更小(图1C)；通过CCK-8实验分析，这2种抑制剂对MDCK细胞增殖有一定抑制作用(图1D)。这些结果表明ERK活性对MDCK上皮微组织的生长有重要调控作用。"

2.2   细胞收缩力调节MDCK上皮微组织的形成   基于以上实验，进一步检测细胞肌动蛋白收缩力是否参与调节MDCK微组织的发生。Y27632抑制Rho下游的ROCK信号通路[36]，Blebbstanin和ML-7分别抑制非肌肉肌球蛋白Ⅱ型ATP酶和肌球蛋白Ⅱ轻链激酶(MLCK)，从而抑制细胞中的收缩力作用[37-38]。将MDCK细胞分别培养在含二甲基亚砜(0.1%)、Y27632(40 μmol/L)、Blebbsitatin(40 μmol/L)、ML-7(40 μmol/L)的培养基中，每隔2 d更换1次培养基(含2% Matrigel)。 培养第9天后，均形成了MDCK微组织(图2A)，与对照组(二甲基亚砜)相比，加入3种抑制剂之后ERK活性降低(图2A，B)，细胞团变小(图2C)。通过CCK-8实验检测细胞增殖活性，发现Y27632对细胞增殖有一定促进作用、Blebbsitatin对细胞没有影响、ML-7对细胞增殖有一定抑制作用(图2D)。这些结果表明，抑制细胞内收缩力后，ERK活性降低，微组织体积变小，显示细胞收缩力作用是该微组织正常生长的必要条件。"

2.3   钙离子通道对MDCK微组织发生的调节作用   细胞钙信号常见于力学信号转导过程[39]，课题组近期工作表明内质网膜上的钙通道在细胞-细胞力学通讯中至关重要[40]。该研究通过使用多种阻滞剂来研究Ca2+通道是否参与调控MDCK微组织的形成。2-APB能够选择性地抑制内质网上IP3R Ca2+ 通道，硝苯地平(Nifedipine)能够抑制质膜上L型Ca2+ 通道，Thapsigargin选择性地抑制内质网上的SERCA钙泵。将MDCK细胞分别培养在含二甲基亚砜(0.1%)、2-APB(10 μmol/L)、Nifedipine(10 μmol/L)、Thapsigargin(10 μmol/L)的培养基中，每隔2 d更换1次培养基(含2% Matrigel)。 培养第9天之后，用2-APB和Nifedipine处理的细胞能够形成微组织形态，而Thapsigargin处理的细胞没有组织形态的发生(图3A)。与对照组(二甲基亚砜)相比，2-APB和Nifedipine处理后ERK活性和细胞团大小显著下降(图3B，C)。CCK-8实验显示这3种抑制剂对细胞增殖都有明显抑制作用(图3D)。该结果显示选择性抑制IP3R Ca2+ 通道和质膜上L型Ca2+通道导致MDCK微组织变小，而Thapsigargin对细胞的毒性较大，影响微组织的正常形态发生。"

2.4   机械敏感离子通道Piezo与整合素信号调控MDCK上皮微组织的生长   Piezo是细胞膜上的一种机械敏感离子通道，可以将机械信号转化为生物信号，并导致多种细胞反应[41]。整合素是由亚基α和β组成的二聚体，作为细胞膜上的受体与胞外基质配体相互作用，调节多种动态细胞过程，如细胞迁移、吞噬作用以及生长和发育的细胞内分子信号[42]。该研究进一步检测细胞质膜上机械敏感受体分子Piezo和整合素对MDCK微组织发生的影响。GsMTx4可以选择性抑制Piezo，GdCl3是力学敏感型钙离子通道阻滞剂；AIIB2抗体可以作用于整合素代表型β1亚基，起到一定的阻滞作用。将MDCK细胞分别培养在含二甲基亚砜(0.1%)、GsMTx4(5 μmol/L)、GdCl3(25 μmol/L)、AIIB2(2 μg/mL)的DMEM高糖培养基中，每隔2 d更换1次培养基(含2% Matrigel)。 培养第9天后，与对照组(二甲基亚砜)相比，加入Piezo抑制剂的实验组ERK活性更低(图4A，B)、直径更小(图4C)。CCK-8实验分析显示该抑制剂对细胞增殖没有显著影响(图4D)。这些结果初步表明Piezo1力敏感通道对MDCK细胞中的ERK活性和组织形态大小发挥有效调控作用。加入AIIB2抗体后，实验组中仅形成没有完整组织形态的细胞簇，CCK-8实验分析表明AIIB2对MDCK细胞增殖没有显著影响(图4A-D)，这些结果证实整合素在该组织形态发生中具有重要作用。"

2.5   不同细胞外基质环境介导的肾小管形成   基于以上细胞力敏感受体的作用，该研究进一步检测不同胞外基质环境对MDCK微组织生长的影响。将细胞分别培养在100% Matrigel凝胶、用PBS稀释过1倍的50% Matrigel凝胶、50%Matrigel基质胶+Ⅰ型胶原(0.5 mg/mL)、50%Matrigel基质胶+Ⅰ型胶原(1 mg/mL)和50%Matrigel基质胶+Ⅰ型胶原(2 mg/mL)上。 培养第9天后，与100% Matrigel凝胶相比，50% Matrigel凝胶上MDCK微组织的ERK活性和直径没有显著性差异(图5A-C)。在基质中加入不同质量浓度Ⅰ型胶原后，对MDCK微组织形态发生有显著影响，生成长形的细胞团(图5A)。与50% Matrigel凝胶条件比较，添加Ⅰ型胶原的各组ERK活性没有显著变化(图5B)。通过测量长轴方向的大小，发现Ⅰ型胶原质量浓度越高，形成的细胞团长度越长(图5D)。这些结果表明胞外基质胶的组成对MDCK的形态发生有重要影响。"