2.1   miRNA发展及治疗股骨头坏死的研究时间图   通过检索并整理相关文献，将miRNA的发展史以及其在股骨头坏死相关的研究进行汇总，其研究时间线见图3。"

2.2   与股骨头坏死相关基因在股骨头坏死骨代谢机制下的作用 2.2.1   miR-155   miR-155可以通过对成骨细胞与破骨细胞的分化及功能起到调控作用，从而在骨骼重塑过程中发挥出十分重要的作用。一方面，QU等[22]通过实验结果得出，下调miR-155通过作用于沉默信息调节因子2相关酶1 (Silent information regulator factor 2 related enzyme 1，SIRT1)这一与miRNA呈负相关的靶点，以促进在高葡萄糖和游离脂肪酸(High glucose and free fatty acids，HG-FFA)条件下碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)及骨钙素调节人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。另一方面，KANG等[23]通过对miR-155(来源于巨噬细胞M1型ev富集中)功能进行检查后表明，与对照组相比，miR-155在正向表达时能降低骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)，9及RUNX2的表达水平，能有效降低间充质干细胞的成骨分化作用。同样，LIU等[24]通过使用RT-qPCR检测RUNX2与成骨相关转录因子抗体(Osterix，Osx)在第3天以及骨形态发生蛋白9诱导成骨的第7天观察碱性磷酸酶和骨钙素的表达水平，最后与对照组相比，在间充质干细胞中，上调miR-155后能降低如Osx、RUNX2、骨保护素及骨钙素等与成骨相关的基因的表达水平，对成骨细胞的增殖分化能力起到了抑制作用。 Sul等[25]研究证实，miR-155在高度表达下能促进破骨细胞的自噬与分化，转化生长因子β激活激酶1结合蛋白2(Transforming growth factor β-activated kinase 1-binding protein 2，TAB2)通过与其3’-UTR结合而被确定为miR-155的靶点基因，敲除TAB2后破骨细胞相关特异性基因有所上升，同时进一步实验表明，在脂多糖诱导下，TAB2复合物释放BECLIN1，其与转化生长因子β活化激酶1(Transforming growth factor β-activated kinase，TAK1)结合，刺激自噬启动，故得出在脂多糖诱导下，miR-155通过降低TAB2的表达水平，从而促进破骨细胞的分化。另外，MAO等[26]研究证实，miR-155可以通过激活腺苷酸5’-单磷酸激活蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase)对瘦素受体(Leptin receptor，LEPR)起到上调作用，同时增加骨保护素、Bcl-2相关x蛋白(Bcl2-associated X protein，Bax)等的表达，对破骨细胞活化及骨吸收能力起到抑制作用。miR-155的具体作用流程详见图4。"

因此，miR-155与碱性磷酸酶、RUNX2、骨钙素及Bax等与成骨及破骨相关的标志物存在密切关系，当miR-155处于正向表达时，其可以通过抑制与成骨相关的标志物(骨形态发生蛋白2/9及骨保护素等)，降低成骨分化能力，也可通过抑制TAB2，对破骨细胞分化能力起到促进作用，同时亦可以通过刺激AMPK，对相关因子起到促进作用，从而抑制破骨分化及骨吸收能力；相反，当miR-155处于低水平表达时，其能通过作用于靶点，促进碱性磷酸酶、RUNX2及骨钙素等成骨相关标志物表达，使成骨分化能力得到提升。因此，miR-155与成骨及破骨的相关标志物有着紧密联系，但其是否存在调控阈值或在某种条件下才能发挥其更大的能力，仍需深入研究，掌握miR-155的调控能力，并与骨组织工程相结合，从而为防治股骨头坏死提供基因层面的参考作用。 2.2.2   miR-206   miR-206在近年来亦成为与股骨头坏死呈负相关的热点基因。Inose等[27]通过相关实验发现，miR-206是在成骨细胞分化进程中起到关键调节作用的因子，其在此过程中的表达水平有所下降，连接蛋白43(Connexin 43，CX43)作为miR-206的靶点，能更好地阐述其机制：当miR-206高度表达时会下调CX43的表达，而miR-206表达下降时CX43的表达则会逐渐上调，同时成骨细胞增殖分化的能力亦随之加强。同样，ZHANG等[28]在激素性股骨头坏死标本中发现miR-206表达水平上升，miR-206的过度表达降低了碱性磷酸酶及B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的表达，同时提高Bax的表达，由此得出，miR-206可以通过降低成骨细胞增殖分化及激活其凋亡机制，从而加速激素性股骨头坏死病情进展。 CHEN等[29]研究鉴定出，作为miR-206的直接靶点，谷氨酰胺与骨髓间充质干细胞成骨分化关系密切，在实验第7，14天时发现，随着骨髓间充质干细胞的成骨分化能力升高，谷氨酰胺亦随之升高，miR-206高度表达时，可以通过与谷氨酰胺酶结合抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化，同时，miR-206抑制剂作用后，谷氨酰胺的降低被恢复，从而骨髓间充质干细胞的成骨分化能力亦随之加强。YE等[30]通过研究发现，在miR-206高度表达的情况下，能将细胞外调节蛋白激酶1/2(Extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)磷酸化能力降低，使得碱性磷酸酶、RUNX2及Osx的表达下调，表明miR-206能通过ERK1/2对成骨分化起到抑制作用，而通过进一步研究表明，生长激素释放多肽能降低miR-206的表达水平，从而对来源于兔的骨髓间充质间质细胞的成骨分化能力起到增强作用。miR-206的具体作用详见图5。"

因此，降低miR-206在成骨分化过程中的表达，能促进成骨细胞分化，提高其表达可抑制成骨细胞分化以及促进破骨细胞分化，但是否存在miR-206在某些表达量上对股骨头坏死在骨质破坏情况下起到调控作用，并达到恢复其骨质的可能，属于一种动态平衡的过程，目前作者检索国内外相关文献，尚未找到该领域的研究，故研究此方向，对改善股骨头坏死骨质问题可起到推动作用。 2.2.3   miR-27a   作为正向表达时具有促进成骨分化作用的miRNA，miR-27a的研究已经逐渐成熟，见图6。"

GU等[31]通过相关实验表明，miR-27a在激素性股骨头坏死大鼠骨髓间充质干细胞的成脂与成骨过程中发挥作用，miR-27a上调可促进成骨分化，其机制主要是，miR-27a能够通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferatotor-activated receptor，PPARγ)以及骨形态形成拮抗蛋白1(Gremlin1，GREM1)两个关键靶点(LI等[21]证实沉默PPARγ与GREM1可以增强miR-27a的成骨分化能力)，使得骨髓间充质干细胞成脂能力降低、成骨细胞增殖分化能力升高，从而达到减弱激素性股骨头坏死的作用。BAI等[32]研究发现，miR-27a在正向表达时可以促进成骨分化，减少caspase3/9活性在MC3T3-E1细胞Bax中的表达，降低相关细胞凋亡能力，而miR-27a抑制剂可抑制成骨细胞增殖分化，增加caspase3/9活性在MC3T3-E1细胞Bax蛋白的表达，促进细胞凋亡。 黄涛等[33]通过相关实验证明，在激素性股骨头坏死大鼠中，miR-27a表达显著降低，而PPARγ和载脂蛋白A5(Apolipoprotein A5，Apo A5)的mRNA表达均显著提高，由此可得出，PPARγ和Apo A5的表达水平与miR-27a表达呈负相关性，miR-27a可以通过对PPARγ/Apo A5表达的沉默，来减缓激素性股骨头坏死发展。张根生等[34]通过相关检测得出miR-27a(在体内，miR-27a的过表达会导致成骨细胞分化的损伤而发生严重的骨丢失[35])过表达的人脐静脉内皮细胞来源外泌体(miR-27a)能将miR-27a传输至MC3T3-E1细胞处，从而提高其成骨分化能力，同时还提示miR-27a可靶向作用于DDK2来促进成骨。作为可以促进成骨细胞分化的正向性表达基因，适当提高miR-27a的表达，可使在股骨头坏死中因血运不足而导致股骨头成骨细胞分化障碍的问题得以解决，对于减缓股骨头坏死发展具有重要意义。由此可知，与此前提到的miR-155及miR-206相反，miR-27a作为与成骨分化呈正相关性的基因，其能通过调控相关蛋白因子，在降低成脂分化的同时促进成骨分化，但其正相关性是否存在时效性或仅存在某个剂量阈值中，仍尚未清楚，故其具有十分重要的研究意义。 2.2.4   其他相关基因   近年来，有关miRNA在骨科疾病中的研究日渐广泛，故除上述提到的近年来研究较多的几种miRNA外，仍有许多miRNA对骨科疾病，尤其是股骨头坏死具有不同的调控作用。文章根据检索结果将相关miRNA分为促进与抑制成骨分化两个方面进行阐述。 促进成骨分化：QI等[36]通过实验证实，miR-199a-5p在人骨髓间充质干细胞中的表达呈上升趋势，而TET2蛋白的表达呈下降趋势，miR-199a-5p在去卵巢模型小鼠的骨组织中表达水平降低，而TET2蛋白的表达水平却升高，通过进一步实验表明，高度表达miR-199a-5p可以上调人骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶、RUNX2、Osx及骨钙素的表达，加强模型小鼠的骨骼质量，由此得出，miR-199a-5p可以通过靶向调控TET2，从而加强成骨细胞的分化能力。HUANG等[37]发现，骨髓间充质干细胞衍生的细胞外囊泡内的miR-148a-3p通过降低SMAD泛素化调节因子1(Smad ubiquitination regulatory factor 1，SMURF1)以及提高SMAD7-Bcl2轴以促进骨髓间充质干细胞的增殖分化，对股骨头坏死的防治提供参考。 作为骨骼稳态与骨代谢中不可或缺的因素之一，GSK3B的正向表达与多种骨科疾病中成骨细胞分化的下调的呈正相关性，且作为miR-155-5p的直接靶点，GSK3B在超表达时下调了miR-155-5p促进成骨细胞增殖分化的能力，对间充质干细胞的成骨增殖分化起到了下调作用。WU等[38]通过TargetScan软件及相关实验证明，通过增加miR-155-5p的表达水平，可以起到减缓激素性股骨头坏死进程的作用，其原因主要是miR-155-5p表达的上调降低了GSK3B水平，使得成骨细胞分化作用得到强化。CHEN等[39]通过研究得出，miR-375可以通过在人脂肪间充质干细胞中过度表达，而在外泌体中处于富集化状态，对骨髓间充质干细胞的成骨分化起到了促进作用，其主要机制为：当来源于人脂肪间充质干细胞的miR-375表达被降低后，胰岛素样生长因子结合蛋白3(Insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP3)与其3’-UTR结合后被抑制，从而影响骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，而上调miR-375表达则反之。 张扬等[40]研究后发现，抑制miR-98-5p表达后，相关成骨因子指标如RUNX2、骨钙素等的表达均显著升高，此外，在实验中从模型小鼠的整体骨量及骨缺损恢复速度推断出沉默miR-98-5p对间充质干细胞成骨分化及骨缺损恢复具有良好的推动作用。Yu等[41]发现，高度表达的miR-296能有效提高碱性磷酸酶活性及骨钙素的表达水平，而沉默miR-296则会产生反向作用，miR-296还可促进成骨细胞的增殖、迁移，同时还能下调细胞凋亡能力，并通过进一步实验来证实，在成骨细胞的分化中，miR-296对其的正向调控主要是通过增强hFOB1.19细胞中核心结合因子a1(Core-binding factor a1，Cbfa1)的表达能力来实现的。 抑制成骨分化：与上述提到的miR-206的作用相反，ZHANG等[42]通过实验首次验证出来源于间充质干细胞分泌的外泌体的miR-135b能通过对细胞程序性死亡蛋白4(Programmed cell death protein 4，PDCD4)作用下成骨细胞凋亡表达水平的抑制，从而缓解股骨头坏死的进展；另外，他们还发现miR-135b可以通过直接靶向作用于PDCD4的3’-UTR，沉默PDCD4表达，抑制成骨细胞凋亡。 Huang等[43]通过相关检测技术证实miR-205-5p的直接靶点为RUNX2，进一步实验显示，RUNX2在高度表达下对miR-205-5p作用于成骨细胞相关标志物的影响起到了显著的下调作用，由此推断miR-205-5p存在靶向作用RUNX2，从而减弱成骨细胞的增殖分化能力。张浩等[44]通过体外培养人骨髓间充质干细胞发现，SMAD4为miR-224的靶基因，随着人骨髓间充质干细胞诱导分化的持续，miR-224的表达降低，且SMAD4的表达则会升高，在提高miR-224表达水平后，相关的成骨分化指标，如碱性磷酸酶、骨钙素、RUNX2及SMAD4的表达均下降，说明miR-224可以通过靶向作用于SMAD来降低人骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。Wu等[45]研究发现，在成骨细胞分化过程中，miR-452-3p处于显著下降趋势，高度表达的miR-452-3p可以对成骨细胞相关标志物[如RUNX2、骨桥蛋白及胶原蛋白Ⅰ型a1链(Collagen type 1 a1 chain，Col1A1)]的表达及碱性磷酸酶的活性起到下调作用，但沉默miR-452-3p时则会产生负向作用。徐昊等[46]研究发现，在人体间充质干细胞向成骨细胞增殖分化后的2周内，miR-216a的表达水平降低，高度表达的外源性miR-216a会下调人体间充质干细胞的体外成骨能力，相关成骨基因如碱性磷酸酶、RUNX2及Osx的表达均降低，由此推出，miR-216a的表达与成骨分化呈负相关性。 近年来miRNA防治股骨头坏死已经成为了研究热点，并且其研究也越来越趋于成熟。随着大量的miRNA被发现与股骨头坏死存在相关性，研究者们发现miRNA具有多样性，其在干预股骨头坏死所形成的正负相关性就是最好的证明，但对于各miRNA在干预股骨头坏死进程中是否存在协同作用，目前检索相关文献中并未找到相关报道，对此仍需进行深入研究，根据股骨头坏死的具体情况，通过调控相关miRNA，维持成骨及破骨细胞的动态平衡，从而对改善股骨头坏死起到推动作用，同时结合近年来骨组织工程领域的发展，可以对股骨头坏死的研究起到更为重要的作用意义。相关miRNA在骨代谢机制中对股骨头坏死的作用机制如表1。"

2.3   与股骨头坏死相关基因通过相关信号通路在股骨头坏死骨代谢机制下的作用    2.3.1   Wnt/β-catenin   作为与骨骼生长发育等方面的经典信号通路，Wnt信号途径在此发挥着举足轻重的作用，近期研究发现，miRNA在此通路通过调控骨髓间充质干细胞在成骨分化及股骨头坏死的发展方面发挥着重要作用[47]。但与上述相同，不同miRNA的表达通过Wnt信号轴干预股骨头坏死所起到的作用亦不相同，以下将从对成骨细胞的促进与抑制两大方面进行阐述。 促进成骨细胞分化：ZHANG等[48]通过实验证实，DKK1为miR-29a的下游因子，miR-29a在过度表达下可以通过hFOB1.19细胞中的Wnt/β-catenin信号传导途径，下调DKK1的表达水平，从而促进成骨细胞增殖分化的能力。与ZHANG等[48]类似，LI等[49]亦是以DKK1为作用点出发，其发现miR-291a-3p可以提高受地塞米松抑制的骨髓间充质干细胞的成骨分化能力、细胞与碱性磷酸酶活性；通过进一步研究，他们发现miR-291a-3p可直接沉默DKK1 mRNA及蛋白的表达水平，激活Wnt/β-catenin通路，使得骨髓间充质干细胞的成骨分化能力得到增强。Wang等[50]通过通过RT-qPCR及western blot检测后发现，转染PDCD4在高度表达质粒后，碱性磷酸酶、骨钙素及RUNX2 mRNA的水平出现下降，但在共转染miR-15a-5p+pcDNA3.1-PDCD4后，上述基因表达水平出现明显上升，而PDCD4与miR-15a-5p呈负相关性，进一步表明提高miR-15a-5p表达可以通过敲除Wnt信号传导途径中PDCD4的表达，并提高碱性磷酸酶、骨钙素以及RUNX2等与成骨相关蛋白因子的表达水平，促进成骨细胞增殖分化作用。 Zhang等[51]研究发现，作为miR-486-3p的靶点以及抑制Wnt/β-catenin信号轴的蛋白，连环蛋白相互作用蛋白1(Catenin beta interacting protein 1，CTNNBIP1)在去卵巢小鼠模型及骨质疏松症患者中的表达均处于高表达水平，而miR-486-3p的表达水平则处于下降趋势，这一情况会出现降低Wnt/β-catenin通路中包括β-catenin、Bcl-2以及D型细胞周期蛋白的表达，抑制骨髓间充质干细胞的成骨细胞分化；通过进一步实验阐明，CTNNBIP1为miR-486-3p的作用靶点，其能与CTNNBIP1的位点232e250结合，使CTNNBIP1的表达显著降低，由此可知，上调miR-486-3p可以降低CTNNBIP1的表达，促进Wnt/β-catenin信号途径，从而增强成骨细胞分化能力。Chen等[52]通过相关实验得出，miR-409-3p能促进间充质干细胞的成骨分化能力，癌细胞侵袭抑制因子(Suppressor of cancer cell invasion，SCAI)的正向表达可以下调Wnt/β-catenin信号传导通路中相关基因的表达，从而降低成骨细胞的分化能力，同时随着Wnt/β-catenin通路的被抑制，miR-409-3p对间充质干细胞的作用亦随着减弱，而miR-409-3p被证实可以沉默SCAI，故由此得出，miR-409-3p可以通过降低SCAI的表达水平，提高Wnt/β-catenin信号轴的表达，最终对成骨细胞增殖分化起到促进作用。 抑制成骨细胞分化：HAO等[53]的相关实验表明，miR-122-3p在高度表达的情况下能对小鼠脂肪源性干细胞的成骨分化能力起到削弱作用，而沉默miR-122-3p则会与上述结果相反，并且通过进一步研究得出其主要机制为miR-122-3p通过调控Wnt/β-catenin信号通路来实现此作用；采用Western blotting检测各组β-catenin的表达水平，结果显示miR-122-3p组β-catenin表达水平明显升高，而miR-122-3p抑制组则与之相反，β-catenin表达水平的升高会导致成骨相关标志物如骨钙素及碱性磷酸酶的表达降低，这表明miR-122-3p与Wnt/β-catenin通路呈负相关，提高miR-122-3p的表达，对小鼠脂肪源性干细胞的成骨分化具有抑制作用。ZHANG等[54]研究发现，在股骨头坏死模型中，miR-15a-5p及Bax的表达均升高，在miR-15a-5p高度表达的情况下，显著抑制了Wnt-3及β-catenin的表达，同时提高了miR-15a-5p的直接靶点PPARγ的表达水平，由此得出，miR-15a-5p通过抑制Wnt/β-catenin信号途径，同时升高具有诱导成脂分化能力的PPARγ的表达水平，对降低细胞增殖能力及加速骨髓间充质干细胞凋亡起到了推动作用。 Yin等[55]发现，作为可以下调成骨细胞分化以及骨形成能力的基因之一，miR-129-5p通过靶向作用于T细胞因子4(T cell factor 4，TCF4)及Wnt/β-catenin通路的下游转录因子TCF7和淋巴增强子结合因子1(Lymphoid enhancer-binding factor 1，LEF1)，从而抑制该通路并对其下游的转录因子起到了抑制作用，最终抑制成骨细胞分化能力。JOHN等[56]在相关实验中发现miR-487b-3p表达均与Ⅰ型胶原、骨钙素、骨形态发生蛋白2及RUNX2呈现负相关性，在miR-487b-3p转染细胞后，NOTCH调控锚蛋白重复蛋白(Notch-regulated ankyrin-repeat protein，Nrarp)mRNA的表达下降，进一步研究指出，miR-487b-3p靶向作用Nrarp，抑制Wnt信号途径，对成骨细胞增殖分化功能起到抑制作用。 因此，相关miRNA可以通过调控对促进成骨分化具有重要作用的Wnt/β-catenin信号通路，通过其自身表达的差异性，对成骨细胞增殖分化起到不同程度的影响，其作用主要取决于相关miRNA对Wnt/β-catenin通路起到激活或沉默作用。但作者通过检索发现，对于miRNA通过Wnt信号轴对股骨头坏死进行调控的研究仅停留在证明其通过Wnt信号轴作用于某个靶点，从而影响成骨细胞分化，但其具体作用表达量及其是否存在剂量或浓度依赖性等方面尚未完全阐明，故此研究方面亦可作为日后深入研究的方向发展。相关miRNA通过Wnt/β-catenin信号轴在骨代谢机制方面对股骨头坏死的影响见表2。"

2.3.2   PI3K/Akt   此前已有研究发现，miRNA通过PI3K/Akt信号轴及其相关因子，对成骨细胞的增殖分化能力有不同程度的调控，其具体机制为：一方面，Xie等[57]发现，miR-328-3p可通过蛋白酪氨酸磷酸酶基因(Protein tyrosine phosphatase gene，PTEN)/PI3K/AKT信号通路以促进成骨细胞活力，但在环境稳定情况下，miR-328-3p在第14，21天会出现明显下降，同时他们发现，PTEN为miR-328-3p的靶基因，并在成骨细胞中与miR-328-3p呈负相关性，miR-328-3p的高度表达促进了成骨细胞增殖分化，但同时也降低了细胞凋亡率。YANG等[58]发现，miR-21能通过促进缺氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)的活性以及提高磷酸化Akt(Phosphorylated Akt，p-Akt)的表达，通过PTEN/PI3K/Akt/HIF-1α通路达到增强骨髓间充质干细胞的成骨分化作用，其主要作用机制为：当miR-21过度表达时，p-Akt表达与HIF-1α活性均得到上调，上游因子PTEN则下调，而在PI3K抑制剂干预下，p-Akt与HIF-1α的表达均明显降低，同时通过CT、荧光色素标记及骨组织形态测量学等检测得出上调miR-21可以促进骨髓间充质干细胞成骨，此外，通过对骨桥蛋白、骨钙素、BMP-2以及RUNX2共4种成骨关键因子的检测发现，上调miR-21能有效提高上述4种因子的表达，对促进骨髓间充质干细胞体外成骨起到促进作用。而YOU等[59]则证明了在高糖条件情况下，miR-378通过激活PI3K/Akt信号通路，下调细胞色素C(Cytochrome C，CytC)、凋亡酶激活因子(Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)以及Bax等促细胞凋亡蛋白的表达，从而促进高血糖条件下成细胞分化能力。 另一方面，Lin等[60]通过实验证实，从机制上分析，来源于骨肉瘤细胞的外泌体miR-501-3p可以通过PTEN/PI3K/Akt信号传导途径，增加破骨细胞的分化能力，同时加重体内外骨量的丢失。Luo等[61]发现，在骨肉瘤中miR-19a-3p处于高表达状态，PTEN是其结合位点，在转染模拟物24 h后，miR-19a-3p表达及破骨细胞数量均上升，而PTEN的表达则降低，另外，miR-19a-3p表达的升高促进了MMP-9、组织蛋白酶K(Cathepsin K，CTSK)的转录及翻译水平，同时在miR-19a-3p模拟物存在时，PTEN的蛋白水平降低，而p-Akt的蛋白水平则升高。但在转染抑制剂24 h后，miR-19a-3p的表达被抑制，PTEN的蛋白水平升高，而p-AKT的蛋白水平则降低。综上所述，miR-19a-3p可以通过降低PTEN的表达水平来激活PI3K/AKT信号通路，对破骨细胞分化能力起到促进作用，最终导致骨质破坏。 Wang等[62]使用巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)及核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)作用于RAW264.7细胞72 h后，再单独转化miR-17-5p模拟物或与PI3K/Akt信号传导途径抑制剂LY294002联合处理48 h后观察发现，利用miR-17-5p处理后的RAW264.7细胞及LY29-14.7细胞中TRAP的阳性细胞数量均较单独使用miR-17-5p模拟物处理后的细胞显著减少；此外，LY294002处理后转染miR-17-5p的细胞中TRAP1、活化T细胞核因子(Nuclear factor of activated T cells，Nfatc)、CTSK以及小眼转录因子(Microphthalmia transcription factor，Mitf)的mRNA水平亦出现下调情况。这些数据均表明，PI3K/Akt信号传导通路参与了RANKL激活的破骨细胞分化的下游部分；而实验证明miR-17-5p在高度表达情况下对RAW264.7细胞中破骨细胞的生成分化起到了促进作用，而在LY294002的干预下，miR-17-5p对破骨细胞能力的作用受到限制，由此得出，miR-17-5p可以通过PI3K/Akt信号轴，增强破骨细胞生成的能力。 因此，作为与Wnt/β-catenin具有相同作用的信号通路，PI3K/Akt在股骨头坏死进程中亦具有重要作用，但由于在促进股骨头坏死过程中成骨与破骨之间的平衡中各miRNA的作用不同，其亦会被影响，具体表现为被促进与被抑制的状态，从而产生相应的作用。相关miRNA通过PI3K/Akt信号途径作用于股骨头坏死在骨代谢机制上的具体作用见表3。"

2.3.3   转化生长因子β   作为与成骨相关的经典通路之一，转化生长因子β对于参加骨形成、发育及骨稳态过程中间充质干细胞的分化具有调控作用。 TIAN等[63]在实验中发现，坏死的股骨头中存在高度表达的miR-141与低度表达的转化生长因子β2，并通过进一步研究阐明通过抑制miR-141能使股骨头坏死大鼠模型股骨头组织中的的转化生长因子β2表达得到上调，提高骨保护素、Bcl-2及RUNX2的表达水平，降低Bax及RANKL等的表达水平，起到了降低破骨细胞生成、促进成骨细胞分化的作用，从而改善股骨头坏死进程。Chen等[64]研究发现，在高糖环境下时，MC3T3-E1细胞中miR-590-5p和与成骨细胞相关蛋白(如Ⅰ型胶原、RUNX2及碱性磷酸酶)的表达水平均显著降低，而SMAD7的表达则升高，同时他们还发现，SMAD7能够抑制转化生长因子β信号通路，影响成骨分化，而miR-590-5p能靶向作用于SMAD7，通过进一步研究得出，miR-590-5p在高度表达下可以提高在高糖环境下MC3T3-E1细胞内的转化生长因子β信号途径，从而促进成骨细胞生成分化。 有研究通过荧光素酶报告基因检测证实了SMAD7为miR-15b的直接作用靶点，同时相较于对照组，miR-15b模拟组细胞中RUNX2 mRNA的表达升高，其在抑制组细胞中的表达水平却显著降低，其主要作用机制为miR-15b的低表达，使得SMAD7蛋白表达升高，而作为具有抑制性的SMAD蛋白，其可以通过与转化生长因子β受体Ⅰ(TGF-β receptorⅠ，TβRⅠ)相结合，以抑制SMAD2/3蛋白的磷酸化，并且其还可通过招募SMUFL1/2，使TβRI降解及泛素化，从而令转化生长因子β信号途径受到抑制，导致RUNX2表达水平下降，最终降低骨髓间充质干细胞的成骨分化能力[65]。 Qin等[66]研究发现，miR-183在去卵巢小鼠模型股骨中呈现上升趋势，同时SMAD4则呈现下降趋势，其通过相关检测得出后者为前者的靶点，同时通过进一步研究证实，在miR-183模拟组中，MC3T3-E1细胞、与成骨相关的因子(如骨钙素、骨桥蛋白及RUNX2等)及碱性磷酸酶活性等表达均显著降低，SMAD4亦下调，但在miR-183抑制组中则会出现相反的结果。因此，miR-183可以通过降低转化生长因子β信号通路中SMAD4的表达，从而抑制成骨细胞的增殖分化能力。与股骨头坏死相关的miRNA通过转化生长因子β信号传导途径对股骨头坏死的影响详见表4。"

由此可知，各种miRNA可以通过对转化生长因子β信号通路中上下游相关因子的调控，作用于与骨桥蛋白、RUNX2及Osx等与成骨相关的因子，从而对转化生长因子β通路起到不同程度的调控作用，但现阶段有关miRNA通过转化生长因子β信号轴干预股骨头坏死的研究尚未成熟，作为与成骨相关的经典信号通路，其后续研究的推进，对于股骨头坏死的防治进程具有重要意义。 2.3.4   MAPK   作为骨科相关疾病的经典信号通路之一，MAPK家族参与了细胞增殖、抗细胞凋亡等相关过程，如MAPK信号轴干预间充质干细胞的成骨分化及迁移；同时有研究证实，RUNX2为MAPK信号途径在成骨细胞分化进程中的下游分子，而RUNX2亦是成骨分化进程中的重要因子之一[67-68]。 此前已有学者证实，下调Sprouty2 (SPRY2)表达可促进成骨细胞的增殖分化[69]，在此基础上，LIAO等[70]得出SPRY2是miR-122-5p的靶基因，并分别运用Diana、TargetScan、StarBase等对miR-122-5p的靶基因预测及分析后表明影响股骨头坏死与miR-122调控SPRY2基因有关，并通过体内实验证实上调 miR-122-5p表达水平的外泌体，受体酪氨酸蛋白激酶(Receptor tyrosine kinase，RTK)/Ras/MAPK信号轴对SPRY2的表达起到抑制作用，RTK的活性得到增强，对成骨细胞增殖与分化起到促进作用，通过观察可见，股骨头中骨密度、平均骨小梁厚度以及骨小梁体积均得到改善，股骨头的坏死程度也得到了显著的改善。Zha等[71]通过实验发现，与对照组相比，骨质疏松组患者中miR-920的表达水平降低，而同源盒基因A7(Homeobox genes A7，HOXA7)的表达水平则升高，miR-920与HOXA7存在负向关系；另外，在人骨髓间充质干细胞成骨分化进程中，miR-920的表达升高，而HOXA7的表达则降低，通过相关分析得出，MAPK信号传导通路为潜在的靶向信号轴，并通过进一步研究证实，miR-920可以通过MAPK通路靶向作用于HOXA7，最终促进人骨髓间充质干细胞成骨分化能力。 与上述miRNA不同，miR-23对成骨分化具有抑制作用。Jiang等[72]发现，一方面，miR-23可以对p-p38的活性表达起到下调作用，由此得出miR-23可以通过p38/MAPK信号通路，抑制RUNX2的表达水平，对成骨分化起到抑制作用；另一方面，miR-23在人骨髓间充质干细胞成骨分化进程中处于低表达水平，而肌肉增强子因子2C(Muscle enhancer factor 2C，MEF2C)则处于高表达水平，通过进一步研究证实，MEF2C为miR-23的靶点，最终得出上调miR-23并作用于靶点MEF2C，对p38MAPK通路起到抑制作用，从而对间充质干细胞成骨分化起到阻碍作用。Jiang等[73]研究表明，miR-143-3p可以降低破骨细胞的分化能力，对破骨细胞分化进程中M-CSF和RANKL的表达水平起到下调作用，同时miR-143-3p能沉默MAPK信号蛋白表达，包括破骨细胞分化早期中的ERK1/2以及晚期中的c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)，此外，在破骨细胞分化进程中，MAPK抑制剂可以对miR-143-3p的表达水平起到提高作用，由此得出，miR-143-3p可以通过抑制MAPK信号传导通路，对破骨细胞分化能力起到抑制作用。 作为经典信号通路之一，MAPK对成骨细胞及破骨细胞的分化均有重要的影响，与股骨头坏死相关的基因可以通过调控该通路中的相关因子，干预成骨与破骨分化，对股骨头坏死影响具有重要意义。但同样，其研究深度亦仅限于发现相关靶点，其研究深度仍潜在巨大的挖掘空间。相关miRNA通过MAPK信号通路对股骨头坏死的作用详见表5。"

2.3.5   其他相关信号通路   除上述信号通路外，miRNA通过其他信号通路作用于股骨头坏死的研究亦较为广泛，其研究结果亦存在十分重要的意义。 JIANG等[74]发现miR-25所介导的骨髓间充质干细胞外泌体对MC3T3-E1C细胞的成骨增殖、分化及迁移起到了促进作用，研究过程中发现，骨髓间充质干细胞外泌体可以加快成骨细胞增殖分化及迁移，但抑制miR-25后则上述情况消失，随后经过进一步研究，发现来源于骨髓间充质干细胞外泌体所分泌的miR-25通过靶向作用于SMURF1以调节其对RUNX2的泛素化降解，最后得出miR25在SMURF1/RUNX2信号轴的干预下促进了成骨细胞的增殖、分化及迁移能力。同样，李广杰[75]也从实验中发现，miR-149能够和基质细胞衍生因子1(Stromal cell-         derived factor 1，SDF-1)基因的3′UTR相互作用，对SDF-1这一成骨转化骨髓间充质干细胞的蛋白的表达水平起到下调作用，而当miR-149启动甲基化时，miR-149表达将会被降低，SDF-1及CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)表达则反之，从而诱导骨髓间充质干细胞进行成骨分化，同时碱性磷酸酶和骨钙素均升高，由此可见，通过沉默miR-149，在SDF-1/CXCR4信号通路的干预下，促进碱性磷酸酶及骨钙素的表达，致骨髓间充质干细胞的成骨分化能力得到增强。 近期有学者通过实验发现，在非创伤性股骨头坏死外泌体里，miR-100-5p的表达水平上调，其通过相关检测方法得出的作用靶点骨形成蛋白Ⅱ型受体基因(Bone morphogenetic protein type II receptor，BMPR2)的表达会降低，而BMPR2的下调亦会导致成骨相关标志物(如骨保护素、骨钙素和RUNX2等)出现表达降低的表现，同时他们发现BMPR2与BMP-SMAD信号通路存在相关性，故由此得出，miR-100-5p通过BMP-SMAD信号途径作用于BMPR2，并能通过靶向BMPR2与抑制BMPR2/SMAD1/5/9信号通路，降低成骨相关标志物的表达，对人骨髓间充质干细胞的成骨等起到抑制作用，而敲除miR-100-5p表达后，在BMPR2/SMAD1/5/9信号传导通路的干预下，使得非创伤性股骨头坏死中成骨分化等能力得到提升[76]，这对于促进股骨头骨质生长提供了参考价值。 与上述具有负相关性表达的miRNA一样，Zhang等[77]研究表明，在成骨分化过程中miR-135b处于低表达水平，根据双荧光素酶报告基因分析，证实JAK2为miR-135b的作用靶点，同时通过进一步研究得出，miR-135b的正向表达对具有促进成骨分化作用的Janus蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录激活子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)通路具有抑制作用，说明miR-135b与成骨分化具有负向关系。 因此，在与股骨头坏死相关的情况下，相关miRNA可以通过对相关信号通路的调控，对股骨头坏死产生不同程度的影响，而miRNA及信号通路亦是现阶段股骨头坏死领域的研究热点，通过研究上述miRNA之间对股骨头坏死的研究，可以推动骨组织工程在股骨头坏死领域的研究深度，同时仍需继续探究各miRNA与信号通路之间是否存在多个miRNA作用于某条信号通路、miRNA同时与多条信号通路共同作用以及多个miRNA与多条信号通路进行多重作用的可能，这对股骨头坏死的防治具有十分重要的意义。在骨代谢机制下与股骨头坏死相关的miRNA通过相关的信号通路对股骨头坏死产生的作用详见表6。"