其他干细胞
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图1｜骨形态发生蛋白2(BMP2)和抑制锌指蛋白3(Simshn3)重组腺病毒分别感染C3H10T1/2细胞后5，7 d 碱性磷酸酶染色及BMP2、Simshn3最佳感染剂量感染C3H10T1/2细胞48 h 后mRNA相对定量
取对数期生长的C3H10T1/2细胞以约1×105/孔的密度铺板至24孔板，细胞贴壁后分别加入不同剂量的重组腺病毒感染，碱性磷酸酶染色观察两组腺病毒处理后5，7 d碱性磷酸酶的表达情况，并参考光学显微镜及荧光显微镜下细胞状态及荧光转染情况选择最佳感染剂量；分别提取最佳感染剂量感染48 h后细胞总mRNA分析BMP2及Shn3的mRNA相对定量值。结果显示：两种重组腺病毒均能成功感染C3H10T1/2细胞；BMP2最佳感染剂量为1.6 μL，Simshn3最佳感染剂量为2.0 μL；1.6 μL Ad-BMP2组较Ad-GFP对照组BMP2 mRNA表达水平显著增高，2.0 μL Ad-Simshn3组较Ad-RFP对照组Shn3 mRNA表达水平显著降低，差异均有显著性意义(P < 0.01)，见图1。因此，后续实验中Ad-BMP2的使用量为1.6 μL/105个细胞，Ad-Simshn3的使用量为2.0 μL/105个细胞。
图2｜抑制锌指蛋白3(Simshn3)对骨形态发生蛋白2(BMP2)诱导C3H10T1/2细胞中碱性磷酸酶表达的影响
C3H10T1/2 细胞在各组腺病毒(Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-Simshn3及Ad-BMP2+Ad-Simshn3)感染24 h后观察荧光表达，检测各组重组腺病毒作用3，5，7 d后碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶mRNA转录水平，结果显示，Ad-BMP2能诱导碱性磷酸酶的表达，抑制Shn3能增强BMP2诱导细胞碱性磷酸酶的表达；Ad-BMP2组碱性磷酸酶mRNA表达量显著高于Ad-GFP组，Ad-BMP2联合Ad-Simshn3组碱性磷酸酶mRNA表达量显著高于Ad-BMP2组，差异均有显著性意义(P < 0.01)，见图2。以上结果提示抑制Shn3能显著增强BMP2诱导C3H10T1/2 细胞中碱性磷酸酶的表达。
图3｜抑制锌指蛋白3(Simshn3)对骨形态发生蛋白2(BMP2)诱导C3H10T1/2细胞成骨分化的影响
成骨标志物的表达是检测间充质干细胞成骨分化的标准之一，随着细胞分化骨基质矿化不断增多，成骨分化的晚期标志钙盐结节也会增加。RT-qPCR检测各组重组腺病毒作用7 d后骨钙素、成骨细胞特异性转录因子、Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原mRNA转录水平。结果显示，Ad-BMP2组成骨细胞特异性转录因子、骨钙素、Ⅰ型胶原、Runt相关转录因子2 mRNA转录水平较Ad-GFP对照组显著增高，抑制Shn3后BMP2诱导的成骨细胞特异性转录因子、骨钙素、Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原mRNA转录水平较Ad-BMP2组显著增高。茜素红染色及半定量分析结果显示，成骨培养基诱导21 d后Ad-GFP组无明显钙盐结节形成，Ad-BMP2组有显著钙盐结节形成，Ad-BMP2联合Ad-Simshn3组相较Ad-BMP2组表现出更显著的钙盐沉积作用，见图3。
图5｜免疫组化染色检测各组C3H10T1/2细胞中Ⅰ型胶原、血管内皮生长因子、内皮黏蛋白表达(×100)
以上实验结果提示抑制Shn3能够有效增强BMP2诱导的C3H10T1/2细胞成骨及成血管因子的转录表达，因此进一步检测Ⅰ型胶原、血管内皮生长因子、内皮黏蛋白的表达。免疫组织化学染色结果显示，Ad-BMP2组Ⅰ型胶原蛋白的表达量较Ad-GFP组显著增强，Ad-Simshn3组血管内皮生长因子、内皮黏蛋白表达量相较Ad-GFP组明显增强，Ⅰ型胶原、血管内皮生长因子及内皮黏蛋白在Ad-Simshn3联合Ad-BMP2组中的表达相较单独处理进一步增强，且表达水平7 d显著高于5 d，见图5。
图6｜抑制锌指蛋白3(Simshn3)对小鼠脑微血管内皮细胞小管形成的影响(×100)
小管形成实验是对血管内皮细胞血管生成的功能性评价，因此进一步检测抑制Shn3对BMP2诱导成骨过程中血管生成的影响。bEnd.3细胞铺板4 h后于光学显微镜下观察到Ad-GFP组、Ad-BMP2组、Ad-Simshn3组均未形成明显小管，Ad-BMP2联合Ad-Simshn3组开始出现小管雏形；Ad-Simshn3组培养8 h后开始出现小管，至12 h时出现多个显著小管；Ad-BMP2联合Ad-Simshn3组12 h后小管密度逐渐增高且部分区域出现管腔减小的现象；持续8 h及12 h后观察Ad-Simshn3组亦出现小管，并随培养时间延长而增多，见图6。血管生成实验是对血管内皮细胞的功能性评价，可以反映小鼠脑微血管内皮细胞在体外形成血管环的能力。
图7｜抑制锌指蛋白3(Simshn3)对骨形态发生蛋白2(BMP2)诱导C3H10T1/2细胞裸鼠皮下异位成骨的影响
上述实验证实抑制Shn3显著增强BMP2诱导C3H10T1/2细胞成骨分化及血管形成，因此进一步在裸鼠皮下植入各组腺病毒处理后的C3H10T1/2细胞以观察皮下异位骨块形成情况。结果显示：小动物X射线片检测显示Ad-GFP组不形成异位骨块，Ad-BMP2组在裸鼠皮下形成的异位骨块显著大于Ad-Simshn3组，但Ad-BMP2+Ad-Simshn3组骨块显著大于Ad-BMP2组，见图7A，B；苏木精-伊红染色及Masson染色结果显示Ad-BMP2+Ad-Simhn3组成熟骨组织相较Ad-BMP2及Ad-Simshn3单独作用组显著增高，见图7C。