胚胎干细胞
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图1｜通过Tet-on载体系统构建沉默MKRN1的载体
结果：shRNA PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，条带位置显示在100 bp左右，表明成功扩增3条shRNA序列，见图1A；胶回收后经EcoRⅠ及XhoⅠ双酶切，见图1B；以及对载体p-Tripz进行双酶切，见图1C；胶回收酶切后的shRNA及载体pTripz后，进行连接、转化后挑菌进行菌落PCR，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，结果显示sh1，sh2，sh3均与载体p-Tripz连接成功，见图1D；送菌液至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，sh1-1至sh1-4，sh2-1，sh2-2，sh2-4，sh3-1测序结果与设计的shRNA序列一致，见图1E。以上结果说明sh1，sh2，sh3序列均成功连入载体。
图2｜构建四环素诱导的稳定敲减MKRN1的HEK-293T细胞(标尺=100 μm)
结果：选取测序正确的sh1，sh2，sh3菌液摇菌提取质粒后进行慢病毒包装，72 h后HEK-293T细胞的荧光表达分别达到50.0%，40.0%，30.0%，见图2A，表明shRNA载体成功转进HEK-293T细胞。收集强力霉素诱导表达的48，72 h的病毒上清液，用浓缩后的病毒液感染HEK-293T细胞，感染48 h后HEK-293T的荧光表达约为50.0%，见图2B，待HEK-293T细胞汇合度达到90.0%进行嘌呤霉素筛选，筛选至荧光表达90.0%以上后进行敲减效率验证。以上结果表明慢病毒成功感染目的细胞。
图4｜沉默MKRN1后对HEK-293T细胞增殖、凋亡的影响
结果：通过集落形成实验检测细胞增殖活力，结果显示沉默MKRN1可明显抑制HEK-293T细胞的增殖(P < 0.05)，见图4A。且通过Western blot检测了在HEK-293T细胞中沉默MKRN1表达后的细胞增殖相关蛋白指标及凋亡相关蛋白指标，发现增殖细胞核抗原的表达减少(P < 0.05)，见图4B；抗凋亡蛋白Bcl2的表达减少(P < 0.05)，促凋亡蛋白BAX的表达水平增加(P < 0.01)，Bcl2/BAX的比值减低(P < 0.01)，见图4C。以上结果说明在HEK-293T细胞中，沉默MKRN1可抑制其增殖，且能够促进其发生凋亡。