其他干细胞

    SD乳鼠原代皮质神经元及星形胶质细胞同时培养的实验方法
  • 图1|不同时间段SD乳鼠皮质神经元的形态变化(×100)


    图2|Calcien-AM活细胞染色观察神经元活性(×100)


    图3|皮质神经元β-Tubulin免疫荧光染色(×200)


    图4|皮质神经元MAP2免疫荧光染色(×100)


    结果:培养24 h后看到神经元贴壁生长,胞体增大,突触变长,部分聚集生长,细胞间有少量的突触连接;培养3 d后胞体进一步增大,突触增粗伸长相互连接形成稀疏网络;培养5 d后神经元体积增大、成熟饱满,神经元突触连接密切;培养7 d后神经元明显聚集,突触增长增粗,相互连接形成致密的细胞网,见图1。Calcien-AM活细胞染色可见细胞活性较好,见图2。β-Tubulin(兔源)、MAP2(兔源)对神经元进行纯度鉴定,2种鉴定方法纯度均大于90%,可满足后期实验的纯度要求,见图34

    图5|不同时间段SD乳鼠星形胶质细胞的形态变化(×100)


    图6|星形胶质细胞的GFAP免疫荧光染色(×200)


    结果:经恒温水平摇床振荡(300 r/min)24 h后消化纯化,接种于含有爬片的6孔板中,培养3 d后胞体增大,呈现梭状、不规则状,细胞间出现少量相互连接,细胞间存在较多小胶质细胞;培养第5天后胞体突起进一步增大,细胞间连接密切,呈现铺路石样;培养第7天发现细胞间的小胶质细胞及其他杂质较第5天明显减少,背景较为干净,见图5。用GFAP蛋白进行细胞纯度鉴定后,星形胶质细胞的纯度大于95%,达到后期实验对于此细胞纯度的要求,见图6

    图7|进口爬片与国产爬片细胞贴壁对比图(×100)

    结果:多次实验结果显示,选择进口爬片在促进神经元的贴壁上优于国产爬片。见图7。建议后期实验使用进口爬片。经多聚赖氨酸包被处理的爬片是神经元成功贴壁的因素之一。未经多聚赖氨酸处理的爬片,细胞贴壁较慢,细胞容易大量聚团且贴壁不牢,漂浮在培养液中,随着时间的推移出现大量细胞死亡。该实验采用0.1%多聚赖氨酸对爬片处理5 min后,放到恒温培养箱中过夜备用。经过多聚赖氨酸包被处理的爬片能够有效促进神经元的贴壁。此外,爬片的使用还有利于转运及保存,以便后期采图。


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  • 发布日期: 2022-10-18  浏览: 147